宏基因組學(xué)的一般研究策略

宏基因組學(xué)的一般研究策略摘要:宏基因組學(xué)是目前微生物基因工程的一個重要方向與熱點。它把微生物的總?cè)后w特性與基因組學(xué)實驗手段結(jié)合了起來，包括從環(huán)境樣品中提取總DNA、再用可培養(yǎng)的宿主微生物建立文庫及篩選目的克隆和基因。該法是研究不可培養(yǎng)微生物、尋找新的基因和開發(fā)新活性產(chǎn)物的重要新途徑。它避開了微生物分離、純化和培養(yǎng)的步驟,大大擴展了微生物資源的利用范圍。本文旨在介紹宏基因組學(xué)的一般研究方法并結(jié)合我們的實驗情況,對這一嶄新領(lǐng)域中的最新研究策略進行了簡要綜述。關(guān)鍵詞:宏基因組學(xué),不可培養(yǎng)微生物,文庫構(gòu)建,文庫篩選，研究策略StrategiesforaccessingmetagenomicsfordesiredapplicationsAbstract:Metagenomicsisanewfieldofmicrobialgeneticengineering.Ithasthecharacteristicsofmicrobialecologyandthemethodologyofgenomics.MetagenomicsincludesgenomicDNAisolation,libraryconstructionandscreeningstrategies,andcanbeusedinthediscoveryofnewgeneandbiocatalystsandinthestudyofunculturedmicroorganism.Metagenomicscanovercometheadvantagesofisolationandcultivationproceduresintraditionalmicrobialmethod,andthusgreatlybroadenthespaceofmicrobialresourceutilization.Inthispaper,wemainlyreviewedthemetagenomicmethodology,togetherwiththelatestadvancesandnovelstrategyinthisresearchfield.Keywords：Metagenomics;Unculturedmicroorganism；Libraryconstruction；LibraryscreeningResearchstrategies大自然中蘊藏著無數(shù)具有重要價值的微生物及其活性產(chǎn)物,也是新基因及生物學(xué)資源的重要源泉，對其進行研究成為微生物學(xué)和分子生物學(xué)研究的一個重要方向。然而人們現(xiàn)在能夠培養(yǎng)與利用的不到環(huán)境中總微生物的1%[1]。宏基因組學(xué)(metagenomics)是直接從環(huán)境樣品中提取全部微生物的總DNA,避開了分離、純化和培養(yǎng)微生物的過程來構(gòu)建宏基因組文庫,用基因組學(xué)的研究策略來研究環(huán)境樣品中的總微生物的組成及其在群落中的功能等?，F(xiàn)在,宏基因組學(xué)技術(shù)方法已在微生物多樣性,微生物細胞間的相互作用,新基因和新型生物催化劑的開發(fā)，新的抗生素的開發(fā)及環(huán)境生態(tài)等方面得到了廣泛應(yīng)用[2]。本文旨在介紹宏基因組學(xué)的一般實驗方法并結(jié)合我們的研究情況,對這一嶄新領(lǐng)域中的最新研究策略進行了簡要綜述。深化了我們對這一學(xué)科的認識,促進了該學(xué)科的進步。1宏基因組學(xué)研究策略1.1宏基因組學(xué)概要宏基因組學(xué)是Handelsman等于1998年提出的[3],可見是一門很新的學(xué)科，其隨著基因組實驗手段，生物信息學(xué)和測序技術(shù)等的日新月異也迅猛發(fā)展了起來，這個新學(xué)科是以環(huán)境樣品的總微生物基因組為實驗對象，通過測序分析、文庫評價、產(chǎn)活性物質(zhì)及其基因的克隆的獲取和基因功能的鑒別，對微生物種群組成與生物量、生態(tài)學(xué)關(guān)系、生物化學(xué)關(guān)系與環(huán)境關(guān)系以及功能活性進行研究[4]。其主要過程包括樣品和基因的富集和提取;宏基因組文庫的構(gòu)建;目的基因的篩選;目的基因活性產(chǎn)物的表達(圖1)。1.2微生物及其基因的富集在文庫篩選過程中由于目的基因比例較小,對環(huán)境中微生物的富集不但可提高基因總量，有利于基因的提取，還可增加目的基因的比例，如Kouker等用橄欖油富集產(chǎn)脂肪酶的微生物收到了很好的效果[5]，橄欖油不僅可作為底物，還可誘導(dǎo)脂肪酶的合成。目前富集技術(shù)主要分為細胞水平和基因水平。其中細胞水平主要是用選擇培養(yǎng)基來富集某些微生物,常圖1環(huán)境微生物宏基因組學(xué)研究策略[6]Fig.1Generalprocessofmetagenomicstrategie[6]用的就是上面例子中的底物選擇法[5]。每一個事物都有其兩面性，富集培養(yǎng)雖然擴大了基因的總量，卻很容易使部分微生物及其攜帶的基因丟失?；蛩礁患械姆€(wěn)定同位素探針技術(shù)(SIP)很有代表性,它是用穩(wěn)定同位素標記底物,用相對量較大的原子摻入到具有活性的核酸里,采用密度梯度離心法將其分開,標記的核酸可作為PCR的模板,用來構(gòu)建宏基因組文庫[7]。目前，SIP與宏基因組學(xué)結(jié)合的報道還不多，但其潛力與優(yōu)勢很明顯，利用SIP可提高新基因發(fā)現(xiàn)的幾率。1.3環(huán)境中總DNA的提取宏基因組學(xué)要分析的樣品成分復(fù)雜,要獲得高濃度、大片段、無偏好的總DNA是宏基因組學(xué)技術(shù)的難點，也是其重點。現(xiàn)在提取DNA的方法大體有兩種:其一是直接提取法,又稱原位提取法，它用化學(xué)和物理方法直接裂解樣品中的微生物使DNA得以釋放,再抽提總DNA,并對DNA進行純化。其中以Zhou法[8]和Tsai[9]法最為常用。該法操作簡便、省時、成本低,能代表某一生境的微生物群落多樣性。其缺點是會出現(xiàn)細胞裂解不完全或DNA與樣品雜質(zhì)共沉淀而難以分離,故一般要再進行DNA純化這一步,它所提取的DNA片段較小(1kb~50kb),適合小片段文庫的構(gòu)建;其二是間接提取法,即異位提取法,是采用差速離心等方法將細胞從樣品中分離出,再提取DNA,該法獲得的DNA純度高、DNA片段大(20kb~500kb),適合構(gòu)建大片段的基因文庫。但操作繁瑣、成本高、DNA產(chǎn)率低且有偏嗜性,其PCR等方法獲得各種細菌rDNA,測序后進行系統(tǒng)學(xué)分析,即可描述環(huán)境微生物的遺傳多樣性,使人們對大量不可培養(yǎng)的微生物群體有了全新的認識[37]。例如Tyson[33]等研究了生長在流動的酸礦外排液表面的嗜酸生物膜的群落結(jié)構(gòu)及其代謝途徑,從中鑒定出了5個基因,并由微生物之間的基因的功能互補揭示了它們的碳氮固定和產(chǎn)生能量的代謝過程和這些微生物在極端環(huán)境中的生存策略[17]。宏基因組擴大了生態(tài)學(xué)研究的對象,隨著分子生物學(xué)技術(shù)的進步,以功能基因為基礎(chǔ)的功能生態(tài)學(xué)將成為未來的熱點，這才是真正意義上的微生態(tài)[32]。2.4生物降解作用研究微生物是適應(yīng)環(huán)境能力最強的物種,環(huán)境污染往往伴隨微生態(tài)的變化[34,35]。宏基因組技術(shù)可以研究不可培養(yǎng)微生物，發(fā)掘它們的基因資源，獲得具有某些物質(zhì)降解能力的活性物質(zhì)，進而了解特定環(huán)境下微生物或活性物質(zhì)的耐受機理，用于污染的修復(fù)。如，我們可建立污染地域的宏基因組文庫，篩選具有某污染物降解能力的克隆再用遺傳工程手段，把從宏基因組中分離出的基因組編成具有其他活性成分、或可降解污染物功能的基因簇用于污染物的處理。Kube[36]等建立了黑海海床的Fosmid文庫，篩選到了厭氧環(huán)境下苯甲酸鹽類降解相關(guān)酶的基因，經(jīng)過生物信息學(xué)分析后，完成了苯甲酸鹽的厭氧代謝通路，并找到了控制此過程的關(guān)鍵基因。可見本技術(shù)對解決三廢問題，實現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展有一定的意義。3結(jié)語與展望宏基因組學(xué)作為一門新興學(xué)科，展示出強大的生命力與潛力，越來越多的科研人員將眼光投向它，其重心也從多樣性分析轉(zhuǎn)移到活性物質(zhì)的篩選上來[37]。雖然該技術(shù)在應(yīng)有上碩果累累。但由于它剛剛起步,還有些技術(shù)方法不夠成熟。主要有三方面[38-43]，一是DNA的提取方法需進一步完善，外源基因表達量少和缺乏高效的篩選方法。二是對更適宜的載體的探索真核表達宿主細胞的開發(fā)，研究和探索多種真菌宿主勢在必行。三是需要把宏基因組學(xué)與生物信息學(xué)和生物芯片技術(shù)等結(jié)合起來，生物信息學(xué)為宏基因組復(fù)雜的序列信息的分析提供了方便。如芯片技術(shù)已用于檢測微生物群落的基因表達。隨著文庫構(gòu)建和篩選策略的不斷提高,異源基因表達能力和產(chǎn)量的增加,宏基因組學(xué)技術(shù)將成為研究環(huán)境微生物多樣性,篩選新的功能基因和生物活性物質(zhì)的重要手段，它的前景是很誘人的，相信經(jīng)過我們不斷的摸索與創(chuàng)新，并結(jié)合現(xiàn)在先進的儀器與技術(shù)，它將會發(fā)展成為生物學(xué)中璀璨的一顆明珠，更好的發(fā)揮出它應(yīng)有的潛力。參考文獻：[1]李麗娟,張殿昌,龔世園.宏基因組技術(shù)在開發(fā)未培養(yǎng)微生物資源中的應(yīng)用[J].水利漁業(yè),2007,27(3):7-9.[2]丁維俊,董婷,曾慶秋.從宏基因組學(xué)談中醫(yī)整體觀的現(xiàn)代化[J].四川中醫(yī),2008,26(6):26-28.[3]SuzanPantarotodeVasconcellos,CélioFernandoFigueiredoAngolini,IsabelNataliaSierraGarcía,BrunaMartinsDellagnezze,CynthiaCanedodaSilva,AnitaJocelyneMarsaioli,EugenioVazdosSantosNeto,ValériaMaiadeOliveira.Reprintof:ScreeningforhydrocarbonbiodegradersinametagenomicclonelibraryderivedfromBrazilianpetroleumreservoirs.OrganicGeochemistry41(2010)1067-1073[4]VenterJC,RemingtonK,HeidelbergJF,etal.EnvironmentalgenomeshotgunsequencingoftheSargassoSea.Science,2004,304(5667):66-74.[5]SchlossPD,HandelsmanJ.Biote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