酶法合成硫酸軟骨素和肝素

酶法合成硫酸軟骨素和肝素糖胺聚糖(Glycosaminoglycan,GAG)是一類以葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖(N-乙酰氨基半乳糖)為二糖單位組合而成的聚合物并經(jīng)硫酸化、變構(gòu)化修飾而成的酸性、直鏈多糖,廣泛存在于動(dòng)物細(xì)胞表面和周圍基質(zhì)中。糖胺聚糖具有多種生物學(xué)功能包括調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和分化等,被開(kāi)發(fā)成一系列的化妝品、醫(yī)美和醫(yī)藥產(chǎn)品,其中硫酸軟骨素是一種治療骨關(guān)節(jié)炎的藥物,抗凝血藥。目前硫酸軟骨素和肝素主要從動(dòng)物組織中提取,需消耗大量的酸堿,而且該方法制備的硫酸軟骨素和肝素中含有大量的其他糖胺聚糖,不僅降低它們的藥效甚至危及生命。因此,合成結(jié)構(gòu)單一的硫酸軟骨素和肝素勢(shì)在必行,對(duì)它們的臨床應(yīng)用和新功能的開(kāi)發(fā)尤為重要。本文采用酶法催化軟骨素和肝素前體合成單一的硫酸軟骨素和肝素。在此過(guò)程中,硫酸化所需的硫酸化修飾系統(tǒng)和硫酸基供體3?-磷酸腺苷-5?-磷酸硫酸(3?-phosphoadenosine-5?-phosphosulfate,PAPS)再生系統(tǒng)尤為重要。本論文通過(guò)在大腸桿菌(Escherichiacoli)中表達(dá)鼠源?；撬徂D(zhuǎn)移酶(ArylsulfotransferaseIV,ASSTIV),構(gòu)建PAPS再生系統(tǒng)；通過(guò)在畢赤酵母Pichiapastoris此基礎(chǔ)上，PAPSS生系統(tǒng)及硫酸化修飾系統(tǒng)合成硫酸軟骨素和肝素。主要研究結(jié)果如下：(1)優(yōu)化ASSTIV表達(dá)構(gòu)建PAPS高效再生系統(tǒng)。分別以pET20bpColdIIIE.coliBL21ASSTIV,SDS-PAGpColdIIIpET20bASSTIV的表達(dá)。為了純化及突變方便,10ASSTIV,YebF,CexPelB3ASSTIV的分泌表達(dá),PelB的分泌能力最強(qiáng),胞外上清的酶活達(dá)到0.36±0.01U/mL。為了提高E.coliBL21對(duì)ASSTIV的分泌能力PelBC-端進(jìn)行隨機(jī)突變ASSTM(AGA酶活達(dá)到1.49±0.02U/mL。在酶分子水平，ASSTIV的底物結(jié)合口袋門控序列85-Val-Pro-Ser-Gly-Leu-Glu-Thr-Leu-Glu-Glu-Thr-95,L89S/E90L。進(jìn)一步對(duì)以上兩個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行單點(diǎn)飽和突變和組合突變得到突變株L89M/E90Q的比酶活為5.98?0.15U/mg,是出發(fā)菌株的1.76倍,K<sub>catv/sub>/K<sub>mv/sub>相較于原酶提高了12.5倍。(2)表達(dá)硫酸轉(zhuǎn)移酶和差向異構(gòu)酶構(gòu)建硫酸化修飾系統(tǒng)。首先,比較在E.coli和P.pastoris等宿主中表達(dá)哺乳動(dòng)物源硫酸轉(zhuǎn)移酶和差向異構(gòu)酶的差異性以選擇合適的表達(dá)宿主。E.coli中,T7，SDS-PAGN--N-N-Deacetylase-N-sulfotransferase,NDSTC5epimerase,C5epi-4-硫酸轉(zhuǎn)移酶(Chondroitin-4-sulfotransferase,C4ST)和軟骨素-6-硫酸轉(zhuǎn)移酶(Chondroitin-6-sulfotransferase,C6ST)未表達(dá);肝素-2-羥基硫酸轉(zhuǎn)移酶Heparansulfate2-O-sulfotransferase,HS2ST-6-Heparansulfate6-O-sulfotransferase,HS6ST-3-(Heparansulfate3-O-sulfotransferase,HS3ST)以包涵體形式表達(dá)。在上述蛋白的N-端融合麥芽糖融合蛋白(Maltosebindingprotein,MBP )后,NDST和C5epi以包涵體的形式表達(dá)；HS2ST實(shí)現(xiàn)可溶表達(dá);C4ST和依舊沒(méi)有表達(dá)。P.pastoris中AOX為啟動(dòng)子，HS3STC4STC6ST得以成功表達(dá)并分泌到胞外，C5epi實(shí)現(xiàn)胞內(nèi)表達(dá)其余包括NDSTHS2ST和HS6ST沒(méi)有表達(dá)。在MBP后,NDSTC5epi、HS2STHS6ST實(shí)現(xiàn)分泌表達(dá)。HS2STHS6STSNMBP和硫氧還蛋白(Thiredoxin,TrxA)后,HS2ST和HS6ST3)利用軟骨素硫酸轉(zhuǎn)移酶催化軟骨素合成硫酸軟骨素。P.pastorisC4ST和C6ST0.101?0.001U/L0.100?0.002U/L,0.30?0.01U/mg和0.20?0.01U/mg此外，體外酶法催化能提高動(dòng)物源硫酸軟骨素的硫酸化度，C4ST催化能提高硫酸軟骨素中GlcUA-GalNAc(4S)比例,C6ST催化能提高硫酸軟骨素中GlcUA-GalNAc(6S)比例。C4STC6ST37^oC48h,得到的產(chǎn)物L(fēng)C-IT-TOF-MS紅外及核磁共振鑒定，C4ST催化軟骨素合成硫酸軟A,C6STC素。(4)利用肝素硫酸化修飾系統(tǒng)催化肝素前體合成肝素。 P.pastoris表達(dá)的NDST同時(shí)具有脫乙?；该富詈蚇-硫酸轉(zhuǎn)移酶酶活,N-硫酸轉(zhuǎn)移酶酶活比E.coliNDSTN-24.46倍0.52?0.01U/mL。此外C5epi、HS2STHS6STHS3ST勺酶活分別為3.28?0.07U/L、5.33?0.22U/L,4.50?0.13U/L12.50?0.43U/L,E.coliC5epi、HS2STHS6ST及HS3ST的酶活高。利用重組P.pastoris表達(dá)的HS2STHS6STHS3ST148%189?17IU/mg在此基礎(chǔ)上