常規(guī)細胞凍存和復(fù)蘇方法

常規(guī)凍存方法下面以腫瘤細胞和雜交瘤細胞為例，介紹常規(guī)凍存細胞的詳細過程。?主要材料儀器設(shè)備：普通冰箱和-700C?-800C超低溫冰箱、液氮凍存罐、高速離心機等；凍存管：容量為1ml或1.5ml;(3)冷凍保護液：一般是以5份小牛血清、4份細胞培養(yǎng)基與1份DMSO混合而成?，F(xiàn)配現(xiàn)用，或配制后放入普通冰箱冰盒內(nèi)冷凍保存。使用前，于室溫下水浴溶解；(4)待凍存細胞：各種腫瘤細胞或雜交瘤細胞。?操作過程待凍存細胞懸液的制備按常規(guī)方法消化處于對數(shù)生長期的細胞培養(yǎng)物，制備單細胞懸液，并計算細胞總數(shù)；將細胞懸液以800?1000r/min離心5min，去上清夜；向細胞沉淀物中加入冷凍保護液，輕輕吹打混勻，使細胞密度達1x106?1x107個/ml；按每管1?1.5ml的量分裝于凍存管內(nèi)，擰緊管蓋；在凍存管上做好標記，包括細胞代號及凍存日期。分級冷凍⑴先將凍存管放入普通冰箱冷藏室(4?80C)，約30min;接著將凍存管置于普通冰箱冷凍室(-100C?-200C)，約30?60min;將凍存管轉(zhuǎn)入低溫冰箱(-800C)，放置過夜；最后將凍存管投入液氮保存。記錄做好凍存記錄。記錄內(nèi)容包括凍存日期、細胞代號、凍存管數(shù)、凍存過程中降溫的情況、凍存位置以及操作人員。?凍存結(jié)果如此凍存的細胞，其存活率可達90%以上。?討論在使用DMSO前，不要對其進行高壓滅菌，因其本身就有滅菌作用。高壓滅菌反而會破壞其分子結(jié)構(gòu)，以致降低冷凍保護效果。在常溫下，DMSO對人體有毒，故在配制時最好帶手套在將細胞凍存管投入液氮時，動作要小心、輕巧，以免液氮從液氮罐內(nèi)濺出。若液氮濺出，可能對皮膚造成凍傷。操作過程中最好帶防凍手套、面罩、工作衣或防凍鞋。應(yīng)注意控制凍存細胞的質(zhì)量。既要在凍存前保障細胞具有高活力，還要確保無微生物污染，這樣的細胞才具有凍存價值。另夕卜，在每批細胞凍存一段時間后，要復(fù)蘇1?2管，以觀察其活力以及是否受到微生物的污染。凍存細胞的復(fù)蘇?主要材料儀器設(shè)備：恒溫水浴箱、高速離心機；培養(yǎng)用液：完全培養(yǎng)液。?復(fù)蘇過程調(diào)配370C?400C的溫水，或?qū)⒑銣厮∠涞臏囟日{(diào)節(jié)至370C?400C;從液氮中取出凍存管，立即投入37°C?400C溫水中迅速晃動，直至凍存液完全溶解；將細胞凍存懸液轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，加入約5ml培養(yǎng)液，輕輕吹打混勻；將細胞懸液經(jīng)800?1000r/min離心5min，棄上清夜；(5)向細胞沉淀內(nèi)加入完全培養(yǎng)液，輕輕吹打混勻，將細胞懸液轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶內(nèi)，補足培養(yǎng)液進行培養(yǎng)。復(fù)蘇第二天上午更換新鮮培養(yǎng)基，以棄去殘余DMSO。?結(jié)果復(fù)蘇后的細胞應(yīng)該保持其凍存時的活力，活細胞數(shù)達90%以上。?討論細胞凍存懸液一旦融解后，要盡快