基因測序的原理及應用

基因測序的原理及應用遺傳咨詢培訓-遺傳檢測一、基因測序的原理基因結構和基因序列、核酸分離純化和保存、PCR技術和應用二、一代測序技術和臨床應用一代測序技術、單基因遺傳病的基因檢測三、二代測序技術和臨床應用二代測序技術、panel測序和全外顯子組測序講 課 大 綱一、基因測序的原理基因結構和基因序列、核酸分離純化和保存、PCR技術和應用講 課 大 綱大?。喝L：3.2

×

109bp（3200Mb）基因序列占：1.2

×

109bp（1200Mb）基因間序列占：2.0

×

109bp

（2000Mb）基因平均長27kb，平均9個外顯子/基因，編碼序列平均1340bp/基因特點：編碼序列僅占1%；非編碼序列98%以上；重復序列多。目前，人類基因組中的蛋白質編碼基因數(shù)目：20500個（ClampM.ProcNatlAcadSciUSA.2007Dec

4;104(49):19428-33）人類基因組的結構特點4真核生物基因結構CAAT

boxTATA

boxEnhancerpromoter調(diào)控序列調(diào)控序列exonexonPoly(A)加尾信號5

′+1Stop3

′結構基因intronintronexonTGAATGresponseelement5’-UTR轉錄DNARNA翻譯蛋白質復制復制逆轉錄基因控制性狀的兩種途徑：基因通過控制酶合成控制生物體的性狀基因通過控制蛋白質的結構控制生物體的性狀基因、環(huán)境與性狀的關系生物性狀是由基因與環(huán)境綜合作用的結果中心法則及其發(fā)展酪氨酸黑色素酪氨酸酶控制酪氨酸酶的基因控制酶形成的基因異常酪氨酸酶合成異常黑色素形成障礙黑色素缺乏-白化病基因突變酶異常白化表型眼白化病-GPR143Type-1型-TYRType

2型-OCA2Type

4型-SLC45A2代謝異?；蛲蛔儗е录膊”硇虳NA的多態(tài)性(polymorphism)：某些DNA序列在人群中出現(xiàn)的頻率>1%，有的與疾病相關基因的突變(mutation)：出現(xiàn)頻率<<1%，引起基因功能的顯著改變，導致人類遺傳病或不致病人類DNA序列變異（variation）包括：8三類常見的DNA多態(tài)性（

frequency

>1%）變異類型概念基因組中的頻率給定人群中基因組的給定位點的單個核苷酸變異，人群中出現(xiàn)的頻率>1%基因組中約有1000萬個SNPSTR可變數(shù)目為1-6bp核心單元組成的重復序列，長度一般<200bp基因組中至少有100萬個，約占人DNA序列的3%CNV基因組中從≥1kbp到≥Mb不等的DNA片段的拷貝數(shù)變異，包括倒位、缺失、插入、重復等方式。人群中出現(xiàn)頻率>1%時稱拷貝數(shù)多態(tài)性目前尚不清楚，估計≥50kbp的CNV約占DNA序列的12%常見基因突變類型點突變動態(tài)突變

大片斷突變同義突變錯義突變剪接突變啟動子突變無義突變移碼突變?nèi)笔Р迦胫嘏湃?lián)體重復擴增突變與蛋白活性的關系：遺傳密碼改變蛋白肽鏈中的片段缺失mRNA剪接錯誤影響mRNA修飾影響基因表達常見基因突變突變類型概念生物學效應點突變同義突變發(fā)生在三聯(lián)密碼子的第三位堿基仍編碼相同的氨基酸錯義突變涉及三聯(lián)密碼子前兩位堿基中的一個氨基酸發(fā)生改變，可影響蛋白活性中心，也可無影響無義突變使編碼氨基酸的密碼變成終止密碼子多肽鏈合成提前終止，通常產(chǎn)生無活性的多肽鏈剪接突變位于內(nèi)含子與外顯子交界處，可影響RNA剪接的突變降低剪接效率或產(chǎn)生異常剪接子，抑制正?；虮磉_啟動子區(qū)突變突變位于基因調(diào)控元件結合處影響該基因的轉錄移碼突變插入、缺失非三的整倍數(shù)的堿基突變位點以下的氨基酸序列發(fā)生改變，可使蛋白質失活或功能異常缺失缺失數(shù)十到數(shù)百個堿基對部分結構基因序列丟失造成編碼基因序列重排，也可使整個基因缺如插入插入一段數(shù)十到數(shù)百個bp

DNA片段，可來源于同一染色體，也可來自其他染色體或外源基因若插入發(fā)生在結構基因，序列將發(fā)生重排，導致基因表達失活或激活插入位點附近的基因重排DNA缺失或插入引起，或由于基因擴增使基因序列發(fā)生大的改變通?？墒够虮磉_產(chǎn)物劑量增加，導致細胞功能的紊亂 10DNA突變與基因功能的改變單倍劑量不足（haploinsufficiency）顯性負效應（dominant negative）反義RNA轉錄/基因組修飾轉錄因子基因突變影響mRNA穩(wěn)定性轉錄增強作用增強子的位置效應劑量效應SNP創(chuàng)造新啟動子獲得性RNA堆積基因測序的基本流程抽提核酸-擴增（建庫）-測序-分析一代測序：抽提核酸-PCR擴增-電泳檢測PCR產(chǎn)物-毛細管電泳（Sanger測序）-數(shù)據(jù)分析二代測序：抽提核酸-目標區(qū)域捕獲-各種方式建庫/擴增-各種平臺大規(guī)模平行測序-數(shù)據(jù)分析兩種方法的測序原理與數(shù)據(jù)分析不同細胞破碎沉淀核酸核酸提取抽提去蛋白質DNA為雙鏈線性分子，在細胞中以與蛋白質結合的形式存在RNA為單鏈線性分子并具有不同的結構特點，如mRNA在3＇端有polyA結構分離核酸中應注意避免降解化學降解-酸堿環(huán)境物理降解- DNA的雙鏈剛性生物降解：DNA酶抑制劑金屬二價離子螯合劑-

EDTA-Na2抑制DNA酶活性（DNA酶需要金屬二價離子Mg2+、Ca2+的激活）RNA酶（RNAase)抑制劑DEPC(二乙基焦碳酸鹽) (C2H5OCOOCOOC2H5)RNase阻抑蛋白（RNasin）（可在樣本中長期維持）血液基因組DNA抽提操作規(guī)程（QIAGEN）一、目的：保證抽提的血液基因組DNA質量，以滿足后續(xù)實驗的要求二、血液樣本：外周靜脈血

，EDTA抗凝劑（紫色管）三、所用試劑：QIAamp

DNA

Mini

Kit四、準備工作：首次實驗前將試劑AW1，AW2中加入無水乙醇（體積見瓶上標注），并混勻。首次實驗前將蛋白酶溶解于稀釋液中（50人份試劑盒的蛋白酶中加入1.2ml稀釋液，250人份試劑盒的蛋白酶中加入5.5ml稀釋液）。

注：

稀釋后的蛋白酶液能在2-8

C穩(wěn)定保存2個月。如果試劑AL出現(xiàn)沉淀，放置56

C水浴使其溶解。具體操作步驟：1、200ul全血中加入20ul蛋白酶液，充分混勻（用于芯片分析的標本在加入蛋白酶液前，先加入RNA酶（100mg/ml）4ul）。2、加入200ulAL，渦旋15秒混勻。3、56

C水浴45分鐘（間隔15分鐘震蕩混勻一次），短暫離心。4、加入200ul室溫放置無水乙醇，渦旋15秒，短暫離心。5、標記離心柱，將上述混合液小心的加入柱中，8000

g離心2分鐘。6、將離心柱放置于一干凈的2ml收集管上，棄去盛有濾過液的收集管。加入400ul

AW1液，8000

g離心2分鐘。7、棄去收集管中廢液，重復步驟6（加入400ul

AW1液，8000轉離心2分鐘）。8、將離心柱放置于一干凈的2ml收集管上，棄去盛有濾過液的收集管。加入400ul

AW2液，13000

g離心4分鐘。9、棄去收集管中廢液，重復步驟9（加入400ul

AW2液，13000

g離心4分鐘）。10、棄去盛有濾過液的收集管，將離心柱放置于一干凈的1.5ml離心管上（自備）。室溫（15-25

C）開蓋干燥15min。加入70ul

56度預熱的AE，室溫孵育5分鐘，8000

g離心2分鐘。11、將離心管中的AE吸出重新放入離心柱的膜中央，8000

g離心1分鐘。12、測定收集管中DNA的濃度。記錄260/280，260/230值。-20

C保存。PCR

(Polymerase

chain

reaction)

是用一對寡聚DNA作為引物，通過加溫變性－退火－DNA合成這一周期的多次循環(huán)，使目的DNA片段得到擴增。由于這種擴增產(chǎn)物是以指數(shù)形式積累的，經(jīng)25-30個循環(huán)后，擴增倍數(shù)可達106-9。Dr.

Karry

Mullis

1985年發(fā)明，獲1993年度諾貝爾化學獎；目的:

用于擴增位于兩段已知序列之間的DNA區(qū)段PCR技術PCR的類型巢式PCR多重PCR不對稱PCR共享引物PCR錨定PCR----

-原位PCR定量PCR彩色PCR重組PCRRT-PCR----

-PCR技術的主要用途目的基因的克隆;基因突變;DNA和RNA的微量分析;

DNA序列測定:

將PCR技術引入DNA序列測定，使測序工作大為簡化，也提高了測序的速度基因突變分析:

PCR與其他技術的結合可以大大提高基因突變檢測的敏感性DNA序列分析常用技術一代測序技術及應用二代測序技術進展基因芯片技術：SNP和CNV分析1990 20002010測序技術的發(fā)展歷史1950 1960 1970 1980DevelopmentofSangerSequencing(1977)Invention

ofAutomatedFluorescentSequencer(1985)Invention

ofCapillarySequencerInventionofApplied

BiosystemsSolid

System(2007)Invention

ofIlluminaGenomeAnalyzerSystem(2006)Invention

of454GS

20Sequencer(2005)chemicaldegradationmethodbyMaxam-Gilbertmethod(1977)ChemicaldegradationmethodbyWhitfield(1954)Invention

ofHeliscopesinglemolecularsequencerInventionofSinglemolecule

realtime(SMRT)DNAsequencingInvention

ofNanoporesinglemolecularsequencing(OxfordNanoporecorporation)一代測序：雙脫氧末端終止法(Sanger

測序法)二代測序：合成測序法三代測序：單分子測序二、一代測序技術和臨床應用一代測序技術、單基因遺傳病的基因檢測講 課 大 綱一代測序（Sanger測序）1977年，英國人Frederick

Sanger

發(fā)現(xiàn)在DNA復制過程中摻入ddNTP，會產(chǎn)生一系列末端終止DNA鏈，能通過電泳按長度分辨。1980年獲得諾貝爾化學獎Sanger測序技術PCR末端終止技術+毛細管電泳檢測技術小片段PCR序列測定最高通量：小于4MB/天基于平板膠的測序技術96通道毛細管陣列一代測序結果的分析原始測序圖專業(yè)分析軟件點突變?nèi)笔Р迦爰羟形稽c點突變Sanger測序仍然是目前測序的“金標準”相對于其他分型技術具有最高的準確性能檢測新的突變適用于小突變檢測和驗證Alagille綜合征(MIM118450)又稱先天性肝內(nèi)膽管發(fā)育不良征，是具有表型特征的慢性膽汁淤積的最常見原因，是一種累及多系統(tǒng)（肝臟、心臟、眼、顏面和骨骼等）的顯性遺傳性疾病。單倍劑量不足（haploinsufficiency）：JAG1基因：20p12.1，93%可發(fā)現(xiàn)點突變（/sites/GeneTests/）27Alagille

syndrome

(ALGS,

OMIM#

118450)-JAG1基因突變HGMD數(shù)據(jù)庫（2014-03）已檢測84例，其中病例為65例，39例發(fā)現(xiàn)突變（60%）Basedon92individualswithALGS[Emericketal1999]and117children

withALGS[Subramaniametal2011]-in

GeneTestsGenotype-Phenotype

CorrelationsNogenotype-phenotypecorrelationsexistbetweenclinicalmanifestationsofALGSandspecificJAG1mutationtypesorlocationwithinthe

gene.ThephenotypeofALGScausedbymutationsinJAG1isindistinguishablefromthephenotypecausedbymutationsinNOTCH2.NOTCH2mutationshadsignificantrenaldisease,oftenresultinginend-stage

renal.HeartismoresensitivetoJAG1dosagethanthe

liver.IndividualswithALGSwithmoresevereimpairmentmayhavealargerdeletionofchromosome20p12encompassingtheentireJAG1geneaswellasothergenesinthe

region.Pulmonic

Stenosis；Vascular

AnomaliesBrownSJ,McLeanWH.Oneremarkablemolecule:filaggrin.JInvest

Dermatol.2012Mar;132(3Pt

2):751-62Filaggrin

(FLG)基因-魚鱗病的致病基因AkiyamaM.FLGmutationsinichthyosisvulgarisandatopiceczema:spectrumofmutationsandpopulationgenetics.BrJDermatol.2010

Mar;162(3):472-7.ReviewSanger測序臨床應用實例糖原累積癥1a型-GSDIa型葡萄糖-6-磷酸酯酶缺陷肝臟不能將糖原、乳酸、氨基酸分解成葡萄糖臨床表現(xiàn)：低血糖、肝大、酸中毒、高脂血癥、高尿酸血癥、高乳酸血癥、凝血功能障礙、發(fā)育遲緩等致病基因：G6PC，位于chr：17q21，全長13.6Kb，編碼區(qū)5個外顯子常染色體隱性遺傳，男女發(fā)病幾率均等88%患者可檢測到該基因的突變已報道致病突變位點（CM980780，PMID:9700613）患兒，男，21天。因“肝功能異常一周余”入院查體：肝臟腫大實驗室：肝功能異常，饑餓性低血糖，曾出現(xiàn)酸中毒，血乳酸偏高，空腹血脂偏高，血尿酸偏高G6PC：Exon

1：c.202G>A，p.G68R雙向測序的必要性-排除假陽性實驗室質控和室間質評LDT-需要詳細的SOP實驗室質控室間質評遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷三、二代測序技術和臨床應用二代測序技術、panel測序和全外顯子組測序講 課 大 綱二代測序技術（next-generation

sequencing

或deep

sequencing）單分子測序技術單分子實時測序，無需PCR擴增運行時間更短，讀長達到5-50K，數(shù)據(jù)產(chǎn)出100-1000G；使人類基因組測序成本低于1000美元單細胞測序2008年，Ley等對一位50多歲急性骨髓性白血病(acutemyeloid

leukemia，

AML)患者，通過單細胞分析技術，測得每個腫瘤樣本細胞擁有9個突變。--Nature 2008，456；66-722011年-Nature

Methods

將單細胞測序列為年度值得期待的技術之一--Science 25 May 2012: Vol. 336 no. 6084 pp. 976-9772013年-Science將單細胞測序列為年度最值得關注的六大領域榜首高通量測序4343ACGTGGTAA

CGTATACAC

TAGGCCATAGTAATGGCG CACCCTTAGTGGCGTATA CATA…ACGTGGTAATGGCGTATACACCCTTAGGCCATAShortfragmentsofDNATT..TCAC..GCAC..GC TG..GTTC..CCCG..CAGA..GC

TG..ACCT..TGGT..GC AC..GC AC..GCTT..CCAA..GC AT..ATShortDNA

sequencesACGTGACCGGTACTGGTAACGTACACCTACGTGACCGGTACTGGTAACGTACGCCTACGTGACCGGTACTGGTAACGTATACACGTGACCGGTACTGGTAACGTACACCTACGTGACCGGTACTGGTAACGTACGCCTACGTGACCGGTACTGGTAACGTATACCTCT...Sequenced

genomeGenome44Sanger測序與高通量平行測序比較PolonySangerNext-generationsequencing

technology200520062007Birthday PrinciplePyrosequencingSequencing-by-SynthesisSequencing-by-Ligation2010Semiconductor

SequencingPGM46afew

days2009:Illumina,Helicos40-50K$人類基因組測序Log10(price)20102005Year20001086422012:

100$,<24hrs2008:ABI

SOLiD60K$,2

weeks2010:

5K$,2007:

4541M$,3

months2001:

Celera100M$,3

years2001:

HumanGenomeProject2.7G$,11

yearsDNA打斷并連接接頭后，應用水包油顆粒捕獲DNA。PCR擴增DNA片段，置于29

μm測序板中。應用焦磷酸反應方法進行序列測定454

測序儀,

FLX2005:300Mb/day,250bp,Eachrunin

7.5h.2008:XLR-HDkit,1G/day,450bp,eachrunin

10h.SOLEXA 測序儀單分子陣列測試，邊合成邊測序破碎DNA并加接頭在有接頭的小室內(nèi)擴增靶DNA加不同顏色標記的核苷及DNA合成所需試劑根據(jù)顏色辨別序列每張芯片可測定1G49GenerationofPolonyarray:Bridge-PCR(Solexa)DNAfragmentsareattachedtoarray

andusedasPCR

templates50Sequencing:FluorescentlylabeledNucleotides

(Solexa)Complementarystrandelongation:DNA

Polymerase51測序通量成本比較Read

lengthSequencingTechnologyThroughput(per

run)Cost

(1mbp)*Sanger~800bpSanger400kbp500$454~400bpPolony500Mbp60$Solexa75bpPolony20Gbp2$SOLiD75bpPolony60Gbp2$Helicos30-35bpSinglemolecule25Gbp1$*Source:Shendure&Ji,NatBiotech,

2008454GSJunior：~35

MbpIonTorrentPersonalGenomeMachine

(PGM)：~60M~2

GbpProton:~10-15

GbpIlluminaMiSeq:~10

GbpNextSeq500:~100

Gbp小型二代測序儀（Benchtop

sequencers）二代測序技術流程GeneID:2737（case

B114）DNA

samplesSamplepreparationand

high-throughputsequencingRaw

ReSequencingdataRawdataprocessingSequence

mappingSequence

alignmentSNP

identificationSNP

functionannotationPublic

SNPdatabaseScoreSNPnsSNPof

interestExperimentinformation&Public

diseasedatabaseAssociation

Study數(shù)據(jù)分析流程基因測序對臨床診斷的影響SaundersCJ.SciTranslMed.2012Oct

3;4(154):154ra13WGS技術快速診斷NICU患兒Candiadte

gene

based

Pipeline50 hrs TATGJB2基因突變:c.85_87del, p.Phe29delBCMWGLLaunchesClinicalExomeSequencingOct2011Over3000

samplesreceived,~2500cases

analyzed85%peds;15%

adultMostly

neurologicInaddition:skeletaldisorders,pulmonaryarteryhypertension,cardiovascular

dzVarietyofreferralsources–

academicmedical

centersN=3000~25%

+Dx; ESmolecularDxfitswithclinical

pictureGermlineCancer復旦兒科的工作-高通量測序數(shù)據(jù)分析流程建立59復旦流程60檢測平臺：質譜篩查：串聯(lián)質譜-色譜-高效液相質譜細胞遺傳：染色體、FISH、MLPA、aCGH基因測序：一代測序（Sanger）、二代測序質譜核型二代測序儀一代測序儀arrayCGH分子診斷和基因組研究平臺分子基因診斷實驗室2008年籌建2011年7月試運行2013年兒研所重組分子實驗室、質譜室、新生兒篩查、細胞遺傳臨床醫(yī)師

4人技術人員

7

人研發(fā)人員

5人臨床多?？茖＜覉F隊二代測序平臺建設過程裝機2012.4培訓2012.5First

run2012.72012.12NMDHI2013.42013.8-102013.8-102013.8-10GSDPPHNEAIDP2014.1-2分析流程的篩選準確性研究63中國循證兒科雜志2015年2月第1期64形成產(chǎn)學研的重要基地國家衛(wèi)計委批準的首批國家遺傳病二代測序試點單位中國遺傳學會認定的遺傳咨詢師培訓基地復旦兒科-明碼（上海）聯(lián)合實驗室復旦大學附屬兒科醫(yī)院兒童精準醫(yī)學中心65檢測技術20132015新增單基因測序4910253個MLPA等拷貝數(shù)分析51510個二代測序多基因panel01919個全外顯子組測序（WES）0WES檢測372例基因檢測技術研發(fā)及應用臨床應用典型案例：疑難危重病例診斷和臨床干預IL10RA基因突變患兒表現(xiàn)頑固性類炎癥性腸病（IBD），經(jīng)臍血干細胞移植-國內(nèi)年齡最小、體重最輕的患兒（6M），順利康復Sanger

測序Ion

Torrent

平臺NGS

:

一次對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行測序實驗平臺結果比對波士頓兒童醫(yī)院復旦兒科醫(yī)院楊琳#,王慧君#.Ion Torrent PGMTM平臺在兒童遺傳性疾病診斷中應用初探.中國循證兒科雜志

2013;8(3):210-215已建立的部分二代panel項目名稱檢測指標項目名稱檢測指標新生兒遺傳代謝病篩查89個基因膽汁淤積型肝病60個基因糖原累積癥19個基因尿素循環(huán)障礙8個基因進行性肌營養(yǎng)不良DMD范可尼貧血3個基因神經(jīng)纖維瘤3個基因結節(jié)性硬化TSC1，TSC2新生兒高胰島素血癥9個基因大皰表皮松懈癥14個基因抗體缺陷病22個基因重癥聯(lián)合免疫缺陷41個基因馬凡綜合征4個基因自身炎癥性疾病20個基因重癥EBV感染和噬血相關基因15個基因多囊腎和肝纖維化5個基因肺遺傳相關疾病17基因NOONAN綜合征8個基因糖原累積病(glycogen

storage

disease，GSD)糖原累積病(glycogen

storage

disease，GSD)是一類由于先天性酶缺陷造成的糖原代謝障礙疾病,它可以出現(xiàn)機體能量代謝障礙和糖原異常堆積。多數(shù)屬常染色體隱性遺傳,少數(shù)屬X連鎖隱性遺傳。GSD根據(jù)酶缺陷不同和糖原在體內(nèi)沉積的部位不同分為

13型涉及與糖原合成、分解相關的十幾個基因（已知）。其中Ⅰ、

Ⅲ、

Ⅳ、

Ⅵ、

Ⅸ型

以

肝

臟病變?yōu)橹鳎?/p>

Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ型以肌肉組織受損為主

。臨床以Ⅰ型最多見（25%），

Ⅰ型又可分為Ⅰa（G6PC1）和

Ⅰb型（SLC37A4）。臨床分型困難。一代測序耗時、耗力、耗錢。GSD-panel:涉及19個基因。臨床應用實例糖原累積病基因測序panel設計

GSD2Ampliseq

panel：

19gen