二十一章基因重組技術(shù)

基因重組和基因工程

GeneticbinationandGeneticEngineering第21章第二節(jié)

重組DNA技術(shù)

又稱DNA克隆或分子克隆

DNAbinationTechniqueisalsoCalledDNACloningorMolecularCloneDNA研究史1865年G.Mendel的豌豆雜交實(shí)驗(yàn)，提出遺傳因子概念，并總結(jié)出孟德?tīng)栠z傳定律。1868年Miescher.從膿細(xì)胞中提取“核素”1909年丹麥植物學(xué)家和遺傳學(xué)家約翰遜首次提出“基因”這一名詞，用以表達(dá)Mendel的遺傳因子概念。1944年O.TAvery等的肺炎球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，說(shuō)明DNA是遺傳物質(zhì)。

1953年Watson和Crick.發(fā)現(xiàn)DNA雙螺旋結(jié)

構(gòu)。具有劃時(shí)代的意義。DNA克隆、測(cè)序與重組技術(shù)的歷史近十幾年來(lái)，出現(xiàn)轉(zhuǎn)基因技術(shù)、基因剔除技

術(shù)、核轉(zhuǎn)移技術(shù)一、重組DNA技術(shù)相關(guān)概念克隆(clone):來(lái)自同一始祖的相同副本或拷貝(copy)的集合。獲取同一拷貝的過(guò)程稱為克隆化(cloning)，即無(wú)性繁殖。（一）DNA克隆技術(shù)水平：分子克隆(molecularclone)

（即DNA克隆）

細(xì)胞克隆個(gè)體（組織）克?。▌?dòng)物或植物）

應(yīng)用酶學(xué)的方法，在體外將各種來(lái)源的遺傳物質(zhì)（同源的或異源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）與載體DNA接合成一具有自我復(fù)制能力的DNA分子——復(fù)制子(replicon)，繼而通過(guò)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，再進(jìn)行擴(kuò)增提取獲得大量同一DNA分子，也稱基因克隆或重組DNA(binantDNA)。DNA克隆

目的：①分離獲得某一感興趣的基因或DNA②獲得感興趣基因的表達(dá)產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）基因工程(geneticengineering)

——實(shí)現(xiàn)基因克隆所用的方法及相關(guān)的工作稱基因工程，又稱重組DNA工藝學(xué)（重組DNA

技術(shù)）。生物技術(shù)工程:

基因工程、蛋白質(zhì)工程、酶工程、細(xì)胞工程、組織工程等

理論基礎(chǔ)：①限制性核酸內(nèi)切酶（簡(jiǎn)稱限制酶）

②基因載體（簡(jiǎn)稱載體）

（二）工具酶

限制性核酸內(nèi)切酶

DNA聚合酶Ⅰ

逆轉(zhuǎn)錄酶

T4DNA連接酶堿性磷酸酶末端轉(zhuǎn)移酶

TaqDNA聚合酶限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionendonuclease)

限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionendonuclease,RE)是識(shí)別DNA的特異序列,并在識(shí)別位點(diǎn)或其周圍切割雙鏈DNA的一類內(nèi)切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ定義：與甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌的限制－修飾系統(tǒng)，限制外源DNA，保護(hù)自身DNA。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技術(shù)中常用Ⅱ型）分類：作用：第一個(gè)字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名，用大寫；第二、第三個(gè)字母是該細(xì)菌的種名，用小寫；第四個(gè)字母代表株；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。命名：Hin

dⅢ

屬

系

株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血桿菌d株的第三種酶Ⅱ類酶識(shí)別序列特點(diǎn)——

回文結(jié)構(gòu)(palindrome)

切口：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGGBamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口名稱識(shí)別序列及切割位點(diǎn)名稱識(shí)別序列及切割點(diǎn)切割后產(chǎn)生５’突出末端:BamHⅠ5’…G▼GATCC...3’BglⅡ

5’…A▼GATCT...3’EcoRⅠ

5’…G▼AATTC...3’HindⅢ

5’…A▼AGCTT...3’

HpaⅡ

5’…C▼CGG...3’

MboⅠ

5’…▼GATC...3’

NdeⅠ

5’…GA▼TATG...3’切割后產(chǎn)生3’突出末端:ApaⅠ

5’…GGGCC▼C...3’HaeⅡ

5’…PuGCGC▼Py...3’KpnⅠ

5’…GGTAC▼C...3’PstⅠ

5’…CTGCA▼G...3’SphⅠ

5’…GCATG▼C...3’切割后產(chǎn)生平末端:AluⅠ

5’…AG▼CT...3’EcoRⅤ

5’…GAT▼ATC...3’HaeⅢ

5’…GG▼CC...3’PvuⅡ

5’…CAG▼CTG...3’SmaⅠ

5’…CCC▼GGG...3’

限制性內(nèi)切核酸酶（三）基因載體

定義為攜帶目的基因，實(shí)現(xiàn)其無(wú)性繁殖或表達(dá)有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些DNA分子。

常用載體質(zhì)粒DNA噬菌體DNA病毒DNA克隆載體(cloningvector)為使插入的外源DNA序列被擴(kuò)增而特意設(shè)計(jì)的載體稱為克隆載體。表達(dá)載體(expressionvector)為使插入的外源DNA序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成多肽鏈而特意設(shè)計(jì)的載體稱為表達(dá)載體。載體的選擇標(biāo)準(zhǔn)：能自主復(fù)制；具有兩個(gè)以上的遺傳標(biāo)記物，便于重組體的篩選和鑒定；有克隆位點(diǎn)（外源DNA插入點(diǎn)），常具有多個(gè)單一酶切位點(diǎn)，稱為多克隆位點(diǎn)；分子量小，以容納較大的外源DNA。質(zhì)粒

(plasmid)特點(diǎn):能在宿主細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立自主復(fù)制；帶有某些遺傳信息,會(huì)賦予宿主細(xì)胞一些遺傳性狀。

λ噬菌體DNA改造系統(tǒng)

λgt系列（插入型，適用cDNA克?。?/p>

EMBL系列（置換型，適用基因組克?。┦删w(phage)

M13噬菌體DNA改造系統(tǒng)（含lacZ基因）

M13mp系列

pUC系列3.粘性質(zhì)粒(cosmid)

酵母人工染色體

(yeastartificialchromosome,YAC)

細(xì)菌人工染色體

(bacterialartificialchromosome,BAC)

動(dòng)物病毒DNA改造的載體（如腺病毒，腺病毒相關(guān)病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒）其他（四）目的基因(targetgene)

cDNA(complementaryDNA)

指經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成的、與RNA(通常指mRNA或病毒RNA)互補(bǔ)的單鏈DNA。以單鏈cDNA為模板、經(jīng)聚合反應(yīng)可合成雙鏈cDNA。

基因組DNA(genomicDNA)

指代表一個(gè)細(xì)胞或生物體整套遺傳信息(染色體及線粒體)的所有DNA序列。

二、重組DNA技術(shù)基本原理基本原理目的基因的獲取DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞外源基因與載體的連接克隆載體的選擇和構(gòu)建重組體的篩選克隆基因的表達(dá)

（一）目的基因的獲取化學(xué)合成法基因組DNA文庫(kù)(genomicDNAlibrary)cDNA文庫(kù)(cDNAlibrary)聚合酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreaction,PCR)（二）克隆載體的選擇和構(gòu)建目的不同，操作基因的性質(zhì)不同，載體的選擇和改建方法也不同。（三）外源基因與載體的連接方式：(1)同一限制酶切位點(diǎn)連接

(2)不同限制酶切位點(diǎn)連接配伍末端連接非配伍末端連接粘性末端連接平端連接

限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的平端粘端補(bǔ)齊或切平形成的平端適用于：在末端轉(zhuǎn)移酶(terminaltransferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再進(jìn)行粘端連接。同聚物加尾連接由平端加上新的酶切位點(diǎn)，再用限制酶切除產(chǎn)生粘性末端，而進(jìn)行粘端連接。

人工接頭(linker)連接受體菌條件：安全宿主菌限制酶和重組酶缺陷處于感受態(tài)(competent)

導(dǎo)入方式：轉(zhuǎn)化(transformation)轉(zhuǎn)染(transfection)感染(infection)（四）重組DNA導(dǎo)入受體菌指將質(zhì)粒DNA或以它為載體構(gòu)建的重組子直接導(dǎo)入細(xì)菌細(xì)胞的過(guò)程。特指“將外源基因?qū)氩溉閯?dòng)物細(xì)胞的一系列技術(shù)的通稱。如脂質(zhì)體包裹DNA轉(zhuǎn)染法、磷酸鈣轉(zhuǎn)染法、DEAE－葡聚糖介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法、電擊法。1.直接選擇法(1)抗藥性標(biāo)記選擇(2)標(biāo)志補(bǔ)救(markerrescue)(3)分子雜交法原位雜交Southern印跡2.免疫學(xué)方法如免疫化學(xué)方法及酶免檢測(cè)分析等（五）重組體的篩選重組DNA技術(shù)操作過(guò)程可形象歸納為：小結(jié)分分離目的基因切限制酶切目的基因與載體接拼接重組體

轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞篩篩選重組體

重組DNA技術(shù)操作的主要步驟載體質(zhì)粒噬菌體病毒目的基因（外源基因）基因組DNA

cDNA人工合成PCR產(chǎn)物限制酶消化開(kāi)環(huán)載體DNA目的基因連接酶重組體轉(zhuǎn)化體外包裝，轉(zhuǎn)染帶重組體的宿主篩選表型篩選酶切電泳鑒定菌落原位雜交表達(dá)體系的建立：表達(dá)載體的構(gòu)建受體細(xì)胞的建立表達(dá)產(chǎn)物的分離純化（六）克隆基因的表達(dá)

標(biāo)準(zhǔn)：選擇標(biāo)志 強(qiáng)啟動(dòng)子翻譯調(diào)控序列 多接頭克隆位點(diǎn)

E.coli表達(dá)體系的不足：不宜表達(dá)真核基因組DNA；不能加工表達(dá)的真核蛋白質(zhì)；表達(dá)的蛋白質(zhì)常形成不溶性包涵體(inclusionbody)

；很難表達(dá)大量可溶性蛋白。1.原核表達(dá)體系(E.coli表達(dá)體系最為常用)

優(yōu)點(diǎn)：可表達(dá)克隆的cDNA及真核基因組DNA

可適當(dāng)修飾表達(dá)的蛋白質(zhì)表達(dá)產(chǎn)物分區(qū)域積累缺點(diǎn)：操作技術(shù)難、費(fèi)時(shí)、經(jīng)濟(jì)

轉(zhuǎn)染

——將表達(dá)載體導(dǎo)入真核細(xì)胞的過(guò)程方法：磷酸鈣轉(zhuǎn)染

DEAE葡聚糖介導(dǎo)轉(zhuǎn)染電穿孔脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染顯微注射2.真核表達(dá)體系（酵母、昆蟲(chóng)、乳類動(dòng)物細(xì)胞）第三節(jié)

重組DNA技術(shù)與醫(yī)學(xué)的關(guān)系非常密切并前景遠(yuǎn)大DNAbinationTechniqueisCloslyRelatedwithMedicineandhasaGoodPerspective一、疾病基因的發(fā)現(xiàn)與克隆根據(jù)基因定位克隆之并研究其性質(zhì)，而認(rèn)識(shí)疾病的分子機(jī)制。

疾病基因發(fā)現(xiàn)的兩個(gè)典型例子:脆性X綜合征Kallmann綜合征二、生物制藥利用基因工程生產(chǎn)有藥用價(jià)值的蛋白質(zhì)、多肽產(chǎn)品已成為當(dāng)今世界一項(xiàng)重大產(chǎn)業(yè)，并將有望成為21世紀(jì)的支柱產(chǎn)業(yè)。美國(guó)EliLilly公司于1982年首先利用重組DNA技術(shù)合成人胰島素并投放市場(chǎng)，標(biāo)志著生物工程藥物時(shí)代的開(kāi)始。迄今為止，已有50多種基因工程藥物上市，近千種處于研發(fā)狀態(tài)，形成一個(gè)巨大的高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)，產(chǎn)生了不可估量的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。

重組DNA醫(yī)藥產(chǎn)品產(chǎn)品功能組織胞漿素原激活劑抗凝血液因子VIII促進(jìn)凝血顆粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落剌激因子剌激白細(xì)胞生成促紅細(xì)胞生成素剌激白細(xì)胞生成生長(zhǎng)因子(bFGF,EGF)刺激細(xì)胞生長(zhǎng)與分化生長(zhǎng)素治療侏儒癥胰島素治療糖尿病干擾素(

1b,

2a,

2b,

)抗病毒感染及某些腫瘤白細(xì)胞介素激活、剌激各類白細(xì)胞超氧化物歧化酶抗組織損傷單克隆抗體利用其結(jié)合特異性進(jìn)行診斷試驗(yàn)、腫瘤導(dǎo)向治療乙肝疫苗(CHO,酵母)預(yù)防乙肝