遺傳實驗報告骨髓

實驗七小鼠骨髓細胞染色體標(biāo)本的制備和觀察生64王攀2006030026同組實驗人：池月實驗日期：2008年11月3日實驗?zāi)康?、解利用動物骨髓進行細胞染色體制片的一般方法，比較與其他制片方法的區(qū)別。2、正確掌握細胞收集、低滲、滴片等技術(shù)手段，觀察和了解小鼠染色體的數(shù)目及形態(tài)特征。實驗原理染色體的數(shù)目及形態(tài)特征在一個物種內(nèi)是相對穩(wěn)定的，染色體上的基因決定了一個物種生長發(fā)育的全部信息。因此通過染色體分析，可以了解某一物種最基本的遺傳指標(biāo)。進行染色體標(biāo)本的制備一般取自細胞分裂旺盛的組織，如骨髓、淋巴細胞以及通過人工培養(yǎng)的懸浮液。動物的骨髓是重要的造血器官，它通過細胞分裂不斷補充體內(nèi)的需要，如將秋水仙素注射到動物的腹腔內(nèi)，經(jīng)腸系膜吸收并可轉(zhuǎn)運到骨髓，結(jié)果使正在分裂的細胞不能形成紡錘體，使得染色體停在中期狀態(tài)，經(jīng)過處理和制片后就可以清楚地觀察到染色體。這種制片方法雖然也經(jīng)過許多步驟，但是效果非常好。而且省去了細胞培養(yǎng)的階段，可以獲得大量分裂細胞，但是屬于侵害性的，因此這種方法適用于動物來源豐富、動物個體較小的材料。實驗儀器、材料和用具實驗材料體重20克左右的小鼠一只儀器用具恒溫水浴槽、離心管2支、刀片、解剖盤、解剖剪、鑷子、離心機、光學(xué)顯微鏡、帶數(shù)碼相機的光學(xué)顯微鏡藥品試劑0.075mKCl低滲液、固定液（甲醇：醋酸＝3:1）、0.4%秋水仙素、改良苯酚品紅溶液實驗步驟ProceduresAttention腹腔注射秋水仙素溶液：在做實驗前2~3小時，對實驗用小鼠按0.1ml/20g小鼠的量對其進行0.4％的秋水仙素注射。（此步由老師完成）取材：實驗時，用斷頸法迅速將小鼠處死，通過解剖取出股骨，用刀片將附著在股骨上的肉剝離干凈，剪開股骨頭，暴露骨髓腔。用注射器吸取低滲液1~2毫升，將針頭插入骨髓腔中沖洗骨髓，使沖洗液從股骨的另一端流出。收集沖洗液到5ml刻度的離心管中。低滲液需要在37℃下保溫。低滲：用吸管將沖洗液吹打幾次，然后把離心管放在37℃恒溫水浴槽內(nèi)低滲20分鐘。時間稍長比較合適。固定：之后取出并加1ml的固定液，吹打之后放入37℃恒溫水浴槽內(nèi)固定10分鐘。離心：然后將1000rpm離心10分鐘，棄去上清。再固定：加入固定液繼續(xù)固定10分鐘。先吹打，再放入恒溫水浴槽離心：再1000rpm的速度離心10分鐘。棄去上清。制備細胞懸液：離心結(jié)束后，棄去上清。小心操作，避免將沉淀懸起，最后留大約與沉淀等量的上清液，滴冰片：從冰箱里取出預(yù)冷的載玻片，根據(jù)細胞懸液體積的大小在鋪了報紙的地上將4張載玻片并排擺在一起，將細胞懸液吸入吸管內(nèi)，手持吸管在載玻片上方向下滴片。載玻片一定要是預(yù)冷過的；滴片的高度越高越好。干燥：讓其自然晾干。注意在干燥后用記號筆將滴有液體的部分標(biāo)記，可以在載玻片的背面標(biāo)記。染色：用改良苯酚品紅溶液染色15分鐘左右。去浮色：清水沖洗，風(fēng)干。注意洗玻片的時候不要將水直接沖到做過標(biāo)記的位置，而應(yīng)該是靠水流來洗。鏡檢：先用低倍鏡找到一好的分裂相區(qū)域，然后轉(zhuǎn)用高倍鏡觀察。實驗結(jié)果（使用的5號機觀察）經(jīng)秋水仙素處理的小鼠（Musmusculus）骨髓細胞染色體照片：100×10（油鏡，數(shù)碼相機）在考試的十分鐘內(nèi)，就拍了這么一張，之前看到的比較好的都沒有找到。這里主要有個小插曲，我在自己的顯微鏡看好之后，就繼續(xù)找有沒有更好的，這時候老師就突然叫到我的名字（主要是我前面那位朋友突然要求先不考了，實在以外啊）。有點不知所措，但是還是決定去考。由于我的片其實本來做得不是很好，主要表現(xiàn)在視野中并沒有特別多的染色體，而且相當(dāng)一部分還沒有散開，所以到考試的時候，自己有點準(zhǔn)備不足，憑著印象看了一圈還是沒有找到，就拍了這個不太好的。我拍的這張只能說是染色體，但是由于沒有散開，所以數(shù)量是沒有法數(shù)了。我做的片子能夠數(shù)的其實很少，我看到過的最好的是能夠數(shù)的，但是就總體來講這個片子還是做得很不好的。對于其中最關(guān)鍵的三個步驟：低滲、預(yù)冷和滴片。前面兩個都是老師提前準(zhǔn)備好的，我們也是按照步驟來做，問題應(yīng)該不大，要說的話有一點，就是預(yù)冷的載玻片，我們是直接用手取的，后來想起來，手是有溫度的，應(yīng)該用鑷子效果更好，但是其實玻璃并不是熱的良導(dǎo)體，所以短時間應(yīng)該不會造成很大的影響；至于滴片的步驟，我們可是保證了相當(dāng)高的高度，唯一我覺得遺憾的是，我們之前沒有用水來試滴。結(jié)果由于離片太遠，滴的時候不太好控制方向，最后雖然勉強滴到了板上，但是我認為效果肯定是欠佳的，比如我們一共用了4張片，有一張是沒有滴到的，而且有幾滴是滴到了外面的，我們最后的液體本來就不多，這樣一來，也就只能勉強拿片子往下面做了。我們的片子中最后看來染色體的數(shù)量不是很多，這個可能就與取材、離心等步驟有關(guān)系了。比如取材，我們按照書上說的方法做的，但是這樣的效果好不好就不能評估了。在離心的步驟中，去掉上清液的過程也可能導(dǎo)致我們把細胞不小心去除了一部分，以至于最后的染色體數(shù)量不多。還有一種可能，就是我在去浮色的時候，不小心把水沖到了滴片的位置，這也可能是造成染色體數(shù)量少的原因。最后就是染色體分開的問題了，在我們做的片子里，有一部分是仍舊被細胞核包裹的染色體，這個應(yīng)該就是滴片的關(guān)系了，滴片給我的感覺是絕不僅僅是高度就完全決定的，應(yīng)該考慮包括角度在內(nèi)的其他因素吧，還有就是預(yù)冷的玻片取出來以后，一定要馬上就滴片，否則一旦恢復(fù)了溫度，那么效果肯定就不好了。實驗討論1、關(guān)于實驗處死動物的原則：在不影響動物實驗結(jié)果的前提下，使實驗動物短時間無痛苦地死亡。本實驗使用的是脊椎脫臼法：右手抓住鼠用力向后拉，同時左手拇指與食指用力向下按住鼠頭，將脊髓與腦髓拉斷，鼠便立即死亡。其優(yōu)點是比較易于掌握，而且大多數(shù)情況下要求不高，容易致死。不過我們在操作的時候，可能是心沒有足夠狠，小鼠并沒有立即死亡，后肢還會動，繼續(xù)重復(fù)剛才的操作，情況還是沒有很大的改變，反復(fù)幾次后小鼠終于死去。事實證明，力大并不是就好，比如我們旁邊的一組同學(xué)，就直接把小鼠拉成了兩半。2、低滲和高空滴片其共同目的都是使染色體能夠分散開。低滲液的作用是使細胞充分吸水膨脹而不破裂，從而一直保持在脹得很大而又沒有破裂的狀態(tài)。進而使得細胞內(nèi)的中期染色體就能夠足夠分散開來，從而使得經(jīng)固定等步驟后仍然處于膨脹狀態(tài)。之后經(jīng)過滴片時的摔打和驟降溫過程，使細胞很快破碎，染色體進一步分散開。在滴片的時候就能夠獲得一團僅屬于一個細胞的分散的中期染色體的片子，易于在顯微鏡下觀察和對染色體進行計數(shù)。而如果開始時就直接用蒸餾水使細胞破裂，這樣雖然染色體更分散，但是為數(shù)很少的染色體都分散到大量的溶液中去，視野里就沒幾條染色體了；就無法對染色體數(shù)目進行統(tǒng)計。為了保持細胞的活性，所以需要對低滲液保溫。低滲時間上應(yīng)該也是長點較好，使細胞充分膨脹。老師說滴片是越高越好。為了保證滴片的成功，如果有條件的話，多拿幾塊載玻片排起來肯定滴到其中一塊上的概率會大一些。思考題1、找到一個分裂相好的區(qū)域，進行顯微照相。前面已經(jīng)完成。2、統(tǒng)計小鼠2n染色體的數(shù)目，仔細觀察其形態(tài)特征。由前所述，照的這張片子染色體沒有分開，所以無法進行有效計數(shù)。小鼠染色體的形態(tài)是兩個臂比較均勻，每一個臂都是較短且較粗，由一個著絲粒連接。3、低滲液起到什么作用，在使用的過程中應(yīng)該注意什么問題。低滲液的作用是使細胞充分吸水膨脹而不破裂，從而一直保持在脹得很大而又沒有破裂的狀態(tài)。進而使得細胞內(nèi)的中期染色體就能夠足夠分散開來，從而使得經(jīng)固定等步驟后仍然處于膨脹狀態(tài)。之后經(jīng)過滴片時的摔打和驟降溫過程，使細胞很快破碎，染色體進一步分散開。在滴片的時候就能夠獲得一團僅屬于一個細胞的分散的中期染色體的片子，易于在顯微鏡下觀察和對染色體進行計數(shù)。而如果開始時就直接用蒸餾水使細胞破裂，這樣雖然