載體構建流程

關于載體構建流程I載體構建流程cDNA提取mRNA得到目的基因

RTPCRPCR產(chǎn)物純化

酶切目的基因和載體

純化酶切產(chǎn)物連接

轉化

菌落PCR

挑取陽性克隆去測序

測序正確的搖菌提質(zhì)粒

保菌導入表達宿主測試表達情況第2頁,共23頁，2024年2月25日，星期天第3頁,共23頁，2024年2月25日，星期天提取mRNA如果可能，實驗室應辟出專門RNA操作區(qū)，離心機、移液槍、試劑等均應專用。RNA操作區(qū)應保持清潔，并定期進行消毒。.操作過程中應自始至終佩戴口罩和手套，并經(jīng)常更換，以避免將手、臂上的細菌和真菌以及人體自身分泌的RNA酶帶入試管或污染用具。操作過程所用器材都要經(jīng)過特殊處理。一次性槍頭、離心管等塑料制品采用連續(xù)滅菌兩次來滅活RNA酶。研缽180℃，4h。第4頁,共23頁，2024年2月25日，星期天RT由于真核基因是由非編碼的內(nèi)含子將ORF分隔開來的斷裂基因，若以基因組為模板PCR得到的片段克隆進載體，不能在原核細胞剪接內(nèi)含子，也不能在非對象真核細胞中正確剪接表達。所以要克隆真核蛋白基因，需以不含內(nèi)含子的連續(xù)編碼的mRNA為模板。PCR耐熱酶不能直接以mRNA為模板擴增，必須通過逆轉錄酶將mRNA逆轉錄為cDNA,再以cDNA為模板擴增目的基因。根據(jù)不同的目的，可有三類引物選擇第5頁,共23頁，2024年2月25日，星期天第6頁,共23頁，2024年2月25日，星期天PCR得到目的基因

剛開始摸條件時，都會先做一個梯度PCR，選出最適條件。由于此步為獲取正確的目的基因，所以盡量避免PCR的突變格外重要。其中所采取的措施有：使用高保真酶、循環(huán)次數(shù)控制在300cycle左右、引物設計合理等。1234522557294時間（min）溫度（℃）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復1~3步25~30輪目的DNA片段擴增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍第7頁,共23頁，2024年2月25日，星期天第8頁,共23頁，2024年2月25日，星期天PCR常出現(xiàn)的問題

1.假陽性：出現(xiàn)的PCR擴增條帶與目的靶序列條帶一致，有時其條帶更整齊，亮度更高

2.出現(xiàn)非特異性擴增帶：PCR擴增后出現(xiàn)的條帶與預計的大小不一致，或大或小，或者同時出現(xiàn)特異性擴增帶與非特異性擴增帶

3.什么條帶都沒有第9頁,共23頁，2024年2月25日，星期天解決方法假陽性的原因及解決方法：可能引物設計不合適：選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而在進行PCR擴增時，擴增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽性。需重新設計引物。還有就是靶序列或擴增產(chǎn)物的交叉污染。非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不完全互補、或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環(huán)次數(shù)過多有關。其次是酶的質(zhì)和量，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶則不出現(xiàn)，酶量過多有時也會出現(xiàn)非特異性擴增。其對策有：①必要時重新設計引物。②減低酶量或調(diào)換另一來源的酶。③降低引物量，適當增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。④適當提高退火溫度或采用二溫度點法(93℃變性，65℃左右退火與延伸)。

什么條帶都沒有，其原因可能是少加東西，酶已經(jīng)失活了，或退火溫度太高等。解決方法：檢查是否少加東西了，換一下酶，降低退火溫度或做個梯度，摸一下條件。第10頁,共23頁，2024年2月25日，星期天PCR產(chǎn)物純化倘若直接對PCR產(chǎn)物進行酶切，體系的雜蛋白、離子等會造成酶切困難或星活性，殘余的聚合酶也會填平粘性末端，造成克隆失敗。所以此步對整個分子克隆都至關重要，可適當用酚抽提、柱純化，必要的話也可以膠回收。第11頁,共23頁，2024年2月25日，星期天

酶切目的基因和載體第12頁,共23頁，2024年2月25日，星期天酶切注意事項

兩種酶切的條件不同時，分別進行兩次酶切，切完一個純化后再切：溫度要求不同，先酶切低溫要求的，再酶切高溫要求的；若鹽濃度要求不同，先酶切低鹽濃度要求的，再酶切高鹽濃度要求的。只要其中一種酶需要添加BSA，則應在雙酶切反應體系中加入BSA。BSA不會影響任何內(nèi)切酶的活性。注意將甘油的終濃度控制在10%以下，以避免出現(xiàn)星號活性，可通過增加反應體系的總體積的方法實現(xiàn)這一要求。第13頁,共23頁，2024年2月25日，星期天酶切常見問題第14頁,共23頁，2024年2月25日，星期天純化酶切產(chǎn)物通常此步是必要的，可以對比未經(jīng)純化的酶切產(chǎn)物進行連接后獲得的陽性克隆大大低于膠回收酶切產(chǎn)物連接所得陽性克隆。此步的目的是去除多余的片段，得到單一純化的目的基因與載體骨架，使之連接不受其他序列干擾。另外酶切后純化前，均需熱滅活，以免殘余的限制性內(nèi)切酶干擾后續(xù)連接反應，降低陽性率。第15頁,共23頁，2024年2月25日，星期天回收前回收后酶切目的條帶酶切載體帶第16頁,共23頁，2024年2月25日，星期天

連接催化DNA中相鄰的5′磷酸基和3′羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個DNA分子或片段連接。PCR產(chǎn)物最好進行切膠回收純化，以去除PCR產(chǎn)物中的非特異性片段和引物等雜質(zhì)。切膠回收PCR產(chǎn)物時，避免DNA在紫外線下暴露時間過長從而形成嘧啶二聚體，造成PCR產(chǎn)物不能連接。凝膠電泳檢測純化后的PCR產(chǎn)物的濃度，優(yōu)化連接反應時插入片段與載體摩爾比例為2:1~10:1（通常為3:1）。PCR產(chǎn)物及載體應盡量避免反復凍融，否則易造成3’末端殘基的丟失。一般連接25度2小時，16或4度過夜。第17頁,共23頁，2024年2月25日，星期天第18頁,共23頁，2024年2月25日，星期天轉化基本步驟：（1）將100μl感受態(tài)細胞于冰上解凍。（2）取5μl連接產(chǎn)物加入到感受態(tài)細胞中，輕輕旋轉幾次以混勻內(nèi)容物。在冰上放置30分鐘。（3）將管放入預加溫到42℃的水浴中，熱激90秒。快速將管轉移到冰浴中，使細胞冷卻1~2分鐘。（4）每管中加700μlLB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1小時，進行復蘇。（5）室溫4,000rpm離心5分鐘，棄去上清后，用剩余100μl培養(yǎng)基重懸細胞并涂布到含抗性的LB瓊脂平板表面。注意：細胞用量應根據(jù)連接效率和感受態(tài)細胞的效率進行調(diào)整。（6）將平板置于室溫直至液體被吸收。（7）倒置平皿，于37℃培養(yǎng)，12~16小時后可出現(xiàn)菌落。第19頁,共23頁，2024年2月25日，星期天菌落PCR此步以適應現(xiàn)代分子生物學實驗室批量工作的高效性，通常只需挑半個菌落直接作為模板進行常規(guī)PCR就能初步檢測陽性克隆。初步檢菌的陽性克隆接種提質(zhì)粒，供后續(xù)酶切分析以及測序檢測。第20頁,共23頁，2024年2月25日，星期天酶切檢測陽性克隆將菌檢的陽性克隆所得質(zhì)粒進行酶切分析，獲得預期條帶的即為陽性克隆。要進一步確認是否有因PCR所帶來的點突變，插入，缺失等改變目的基因的序列，還需要對陽性克隆進行測序。選用的酶通常為設計引物的兩個酶，因為它能完整切下ORF和載體骨架，可以通過條帶大小以判斷陽性克隆。第21頁,共23頁，2024年2月25日，星期天挑取陽性克隆去測序測序是構建載體的最后一個關鍵的環(huán)節(jié)，只有測序正確的陽性克隆才