細(xì)胞骨架染色VIP

一.考馬斯亮藍(lán)R250染色法觀察微絲掌握觀察動物細(xì)胞內(nèi)微絲方法:考馬斯亮藍(lán)R250染色法

試驗?zāi)繕?biāo)細(xì)胞骨架染色第1頁真核細(xì)胞胞質(zhì)中有錯綜復(fù)雜纖維網(wǎng),稱為細(xì)胞骨架。依據(jù)纖維直徑分為微絲,微管和中間纖維。另外,還散布著一些比微絲還細(xì)纖維。本試驗觀察是由微絲平行排列組成纖維束,在動物細(xì)胞里稱作”應(yīng)力纖維”.應(yīng)力纖維在體外培養(yǎng)貼壁細(xì)胞中尤其發(fā)達(dá)。普通當(dāng)細(xì)胞充分鋪展時,經(jīng)考馬斯亮藍(lán)R250染色,可看到沿細(xì)胞長軸伸展粗大纖維束,此即應(yīng)力纖維。試驗原理細(xì)胞骨架染色第2頁儀器、材料和試劑（一）儀器

光學(xué)顯微鏡,溫箱,細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備（二）材料平皿,直徑30mm小染缸,載玻片,蓋玻片,體外培養(yǎng)貼壁細(xì)胞B-cap細(xì)胞。（三）試劑細(xì)胞培養(yǎng)基,磷酸緩沖液(PBS,PH7.4);0.2mol/L磷酸鹽緩沖液(PH7.3);M-緩沖液;1％Triton×-100(用M-緩沖液配);0.2％考馬斯亮藍(lán)R250;3.0％戊二醛(用0.2mol/L磷酸鹽緩沖液配制)。細(xì)胞骨架染色第3頁試驗步驟1.細(xì)胞培養(yǎng)在平皿中蓋玻片上,還未致密時即可使用。取出蓋玻片,用PBS洗滌3次。2.用1％Triton×-100處理25-30min,室溫或37℃均可。3.馬上用M-緩沖液輕輕洗細(xì)胞3次。4.略晾干后,用3.0％戊二醛固定細(xì)胞5-15min。細(xì)胞骨架染色第4頁5.PBS洗數(shù)次,濾紙吸干。6.用0.2％考馬斯亮藍(lán)R250染片子1h。然后小心用水沖洗,蒸餾水沖洗,空氣中略干燥。7.普通光學(xué)顯微鏡下用40×物鏡或油鏡觀察。應(yīng)力纖維成深藍(lán)色。試驗步驟細(xì)胞骨架染色第5頁注意事項

1.洗片時要輕柔，以免把細(xì)胞從載片上洗去。

2.細(xì)胞蓋片注意正反面。

3.染色后應(yīng)沖洗蓋片后面，防止損傷細(xì)胞。

細(xì)胞骨架染色第6頁試驗匯報1.畫出你所觀察到微絲圖像。2.對試驗成功失敗原因進(jìn)行討論。細(xì)胞骨架染色第7頁思索題微絲觀察試驗中,1％Triton×-100處理細(xì)胞作用是什么?此試驗是否能看到微管,中間纖維?為何?M-緩沖液作用是什么?細(xì)胞骨架染色第8頁二.甲基羅丹明標(biāo)識鬼筆環(huán)肽染色法觀察微絲掌握觀察動物細(xì)胞內(nèi)微絲方法:甲基羅丹明標(biāo)識鬼筆環(huán)肽染色法。試驗?zāi)繕?biāo)細(xì)胞骨架染色第9頁鬼筆環(huán)肽是雙環(huán)桿肽,與微絲有強(qiáng)烈親和作用，能使F-actin穩(wěn)定。用熒光燃料甲基羅丹明標(biāo)識鬼筆環(huán)肽能夠清楚地顯示細(xì)胞中微絲。試驗原理細(xì)胞骨架染色第10頁（一）儀器

熒光顯微鏡（二）材料平皿,直徑30mm小染缸,載玻片,蓋玻片,鋁盒,體外培養(yǎng)貼壁細(xì)胞如B-cap細(xì)胞。（三）試劑細(xì)胞培養(yǎng)基,3.7％甲醛-PEMD,磷酸緩沖液(