焦磷酸：果糖-6-磷酸-1-磷酸轉(zhuǎn)移酶試劑盒說明書

第第頁焦磷酸：果糖-6-磷酸-1-磷酸轉(zhuǎn)移酶試劑盒說明書焦磷酸：果糖6磷酸1磷酸轉(zhuǎn)移酶（Pyrophosphate:fructose6–phosphate1phosphoricacidtransferase，PFP）試劑盒說明書微量法100T/96S注意：正式測定之前選擇23個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。測定意義：焦磷酸：果糖6磷酸1磷酸轉(zhuǎn)移酶（PFP，EC2.7.1.90）是一種胞質(zhì)酶，廣泛存在于植物組織中，催化果糖6磷酸與果糖1,6二磷酸之間的可逆轉(zhuǎn)化，在光合作用碳代謝中起重要作用。測定原理：PFP催化6磷酸果糖轉(zhuǎn)化為1,6二磷酸果糖，它在醛縮酶和磷酸丙糖異構(gòu)酶的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)?磷酸甘油醛，再由3磷酸甘油醛脫氫酶和NADH催化生成3磷酸甘油酸、NAD和磷酸，340nm處的吸光度變化反映了PFP的活性的高低。自備實驗用品及儀器：天平、低溫離心機、研缽、紫外分光光度計/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板。試劑組成和配制：提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存。試劑一：液體10mL×1瓶，4℃避光保存。試劑二：粉劑×1瓶，20℃避光保存。臨用前加2mL蒸餾水充分溶解；用不完的試劑分裝后20℃保存，禁止反復(fù)凍融。試劑三：粉劑×1瓶，20℃避光保存。臨用前加2mL蒸餾水充分溶解；用不完的試劑分裝后20℃保存，禁止反復(fù)凍融。試劑四：液體1mL×1瓶，4℃避光保存。試劑五：液體1mL×1瓶，4℃避光保存。試劑六：液體2mL×1瓶，4℃避光保存。酶液提?。?.組織：按照質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g，加入1mL提取液）加入提取液，冰浴勻漿后于4℃，10000g離心10min，取上清置冰上待測。2.細胞：按照細胞數(shù)量（104個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然后4℃，10000g離心10min，取上清置冰上待測。3.液體：直接檢測。測定操作：1.紫外分光光度計/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min，調(diào)節(jié)波長至340nm，蒸餾水調(diào)零。2.取微量石英比色皿/96孔板，依次加入100μL試劑一，20μL試劑二，20μL試劑三，10μL試劑四，10μL試劑五，20μL試劑六，20μL粗酶液，充分混勻，記錄340nm處10s的吸光值A(chǔ)1和310s的吸光值A(chǔ)2，△A=A1A2計算公式：a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下（1）按照樣本蛋白濃度計算酶活單位定義：每毫克組織蛋白每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個酶活力單位。PFP（nmol/min/mgprot）=ΔA÷（ε×d）×V反總÷(V樣×Cpr)÷T=321.54×ΔA÷Cpr（2）按照樣本質(zhì)量計算酶活單位定義：每克組織每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個酶活力單位。PFP（nmol/min/g鮮重）=ΔA÷（ε×d）×V反總÷(W×V樣÷V樣總)÷T=321.54×ΔA÷W（3）按照細胞數(shù)量計算酶活單位定義：每104個細胞每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個酶活力單位。PFP（nmol/min/104cell）=ΔA÷（ε×d）×V反總÷(V樣×細胞數(shù)量÷V樣總)÷T=321.54×ΔA÷細胞數(shù)量（4）按照液體體積計算酶活單位定義：每毫升液體每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個酶活力單位。PFP（nmol/min/mL）＝ΔA÷（ε×d）×V反總÷V樣÷T=321.54×ΔAV反總：反應(yīng)體系總體積，0.2mL；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×103L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.02mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時間，5min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，gb.使用96孔板測定的計算公式如下（1）按照樣本蛋白濃度計算酶活單位定義：每毫克組織蛋白每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個酶活力單位。PFP（nmol/min/mgprot）＝ΔA÷（ε×d）×V反總÷(V樣×Cpr)÷T=643.08×ΔA÷Cpr（2）按照樣本質(zhì)量計算酶活單位定義：每克組織每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個酶活力單位。PFP（nmol/min/g鮮重）＝ΔA÷（ε×d）×V反總÷(W×V樣÷V樣總)÷T=643.08×ΔA÷W（3）按照細胞數(shù)量計算酶活單位定義：每104個細胞每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個酶活力單位。PFP（nmol/min/104cell）=ΔA÷（ε×d）×V反總÷(V樣×細胞數(shù)量÷V樣總)÷T=643.08×ΔA÷細胞數(shù)量（4）按照液體體積計算酶活單位定義：每毫升液體每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個酶活力單位。PFP（nmol/min/mL）＝ΔA÷（ε×d）×V反總÷V樣÷T=643.08×ΔAV反總：反應(yīng)體系總體積，0.2mL；ε：NADH