醫(yī)學(xué)教案GPC3-CAR-T回輸制劑生產(chǎn)工藝的研究資料及驗證資料

申請分類：新藥注冊分類：治療用生物制品1類藥品名稱靶向GPC3的自體CAR-T細胞回輸制劑資料項目名稱生產(chǎn)工藝的研究資料及驗證資料資料項目編號申請機構(gòu)：申請機構(gòu)地址：申請機構(gòu)電話：申請機構(gòu)主要研究者姓名：試驗者姓名：試驗起止日期：原始資料的保存地點：聯(lián)系人姓名、電話：藥品注冊申請人名稱：目錄1靶向GPC3的自體CAR-T細胞 頁共11頁靶向GPC3的自體CAR-T細胞回輸制劑生產(chǎn)工藝研究資料及驗證資料本注冊申報資料擬對靶向GPC3的自體CAR-T細胞回輸制劑的生產(chǎn)工藝和貯藏條件進行研究，采用懸浮培養(yǎng)法，經(jīng)過分離、分選、培養(yǎng)、激活、擴增、收獲等步驟制得的細胞懸液，含適量保存液。建立了一套從分離培養(yǎng)至細胞制劑的標(biāo)準(zhǔn)生產(chǎn)工藝方案和質(zhì)控方法，為靶向GPC3的自體CAR-T細胞回輸制劑成品提供質(zhì)量可控的細胞來源。1靶向GPC3的自體CAR-T細胞本產(chǎn)品屬于基因改造的免疫細胞，以GPC3為靶點，通過將靶向GPC3的單鏈抗體GC33與共刺激分子CD28、CD137和CD3ζ鏈的胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域進行融合重組，構(gòu)建抗-GPC3-CD28-CD137-CD3ζ的慢病毒表達載體，制備GPC3-CAR分子修飾的T細胞。2培養(yǎng)基的選擇2.1研究背景細胞培養(yǎng)是指模擬體內(nèi)環(huán)境，使細胞在體外生長繁殖，并維持其結(jié)構(gòu)和功能的一種培養(yǎng)技術(shù)。常用的細胞培養(yǎng)體系包括細胞培養(yǎng)基，無菌無毒環(huán)境，恒定的溫濕度等等。培養(yǎng)基的主要成份為氨基酸，碳水化合物，無機鹽，維生素，血清，生長因子以及其它成份。胎牛血清是細胞體外擴增時常常采用的培養(yǎng)成份，這種血清帶有動物來源的抗原，會在臨床上引起很多潛在的危險，移植到人體內(nèi)后可能會產(chǎn)生嚴重的過敏反應(yīng)和免疫排斥反應(yīng)ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA。其他的危險性包括病毒和細菌感染、朊病毒和未知的動物傳染病ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[1-3]。有報道采用異基因的人血清、富含血小板的血漿和人血小板裂解物ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA來培養(yǎng)擴增干細胞ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[4-6]。然而，血清因為批次之間的差異性影響體外培養(yǎng)細胞的可重復(fù)性。為了培養(yǎng)質(zhì)量可控，使用安全，重復(fù)性高的細胞產(chǎn)品，本項目選擇了無血清無抗生素成份的細胞培養(yǎng)體系，避免以往使用的含人或動物血清培養(yǎng)體系,導(dǎo)致不同程度的異種蛋白混入而引起的排異反應(yīng)，以及抗生素殘留對人體的影響。本研究擬對不同培養(yǎng)基進行篩選，通過考察細胞的收獲量，形態(tài)等指標(biāo)，最終確定最優(yōu)化的細胞培養(yǎng)基體系，為臨床應(yīng)用提供支持。根據(jù)培養(yǎng)基臨床應(yīng)用的需要，選擇了以下3種國內(nèi)外市場上常見的無血清培養(yǎng)基（見下表9-1），作為細胞的備用培養(yǎng)基進行考察。表9-1培養(yǎng)基選擇方案一覽表編號無血清培養(yǎng)基貨號廠商A免疫細胞無血清培養(yǎng)基ALyS505N珠海貝索BPC-1TM培養(yǎng)基77232Lonza（龍沙）集團CFasGrow10150北京百樂通2.2儀器設(shè)備醫(yī)用潔凈工作臺SW-CJ-2F蘇州凈化設(shè)備有限公司離心機8420KUBOTA(日本久保田)生物顯微鏡CX21OLYMPUS(奧林巴斯公司)倒置相差顯微鏡IX71OLYMPUS(奧林巴斯公司)細胞培養(yǎng)箱MCO-20AICSANYO(三洋電機有限公司)2.3實驗方案(1)將外周血分離所得的單個核細胞取樣，用countstar全自動細胞計數(shù)儀進行計數(shù)；(2)按照免疫磁珠分選試劑盒（Dynabeads?人T細胞活化劑CD3/CD28）的說明書的方法，按照1:1的比例加入偶聯(lián)CD3/CD28抗體的磁珠(beads)，輕輕震蕩20min，利用磁力架，得到CD3陽性的T細胞。(3)將CD3陽性T細胞用上述三種培養(yǎng)基進行分別培養(yǎng)，按照1*106/ml細胞接種，進行培養(yǎng)，加入300U/mLIL-2、50ng/mLIL-7、100ng/mLPHA，進行培養(yǎng)。(4)72小時后，細胞激活，且得到純度比較高的T細胞，可以用流式細胞儀檢測CD69/CD8的細胞的比例。此時，可以用含CAR的慢病毒對培養(yǎng)的細胞進行感染。(5)再過12小時后，進行全量換液，以去除感染用的病毒，然后繼續(xù)培養(yǎng)；根據(jù)細胞長勢在后續(xù)的培養(yǎng)過程中進行細胞半換液，以補充細胞生長過程中所需的營養(yǎng)物質(zhì)。2.4結(jié)果討論通過A/B/C三種不同培養(yǎng)系統(tǒng)下培養(yǎng)的實驗研究，考察不同培養(yǎng)體系下不同細胞的形態(tài)，融合度，計數(shù)等指標(biāo)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：1)細胞培養(yǎng)結(jié)果表明：B，C培養(yǎng)基細胞生長較差，不適合本生產(chǎn)工藝。2)細胞融合情況：A的細胞生長較密集，培養(yǎng)72小時后，融合度達到85%-95%左右；而B和C就相對長得比較稀松，融合度在70%-75%左右。3)計數(shù)結(jié)果：收獲量最大的是A培養(yǎng)基。B培養(yǎng)的細胞出現(xiàn)了很多亮點，已經(jīng)呈現(xiàn)老化現(xiàn)象。實驗表明,隨著培養(yǎng)代次的增加，C培養(yǎng)體系下細胞形態(tài)逐漸老化。綜上所述，細胞在A培養(yǎng)基下培養(yǎng)都能獲得最多的細胞收獲量和較佳的細胞形態(tài)，同時A培養(yǎng)基培養(yǎng)出來的細胞也符合GPC3-CAR-T細胞的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，故A培養(yǎng)基為優(yōu)選培養(yǎng)基。2.5培養(yǎng)基主要成分試劑中文名試劑英文名來源供應(yīng)商L-谷氨酸L-Glutamine非動物源invitrogenDMEM/F12DMEM非動物源invitrogen胰蛋白酶TRYPSIN0.25%EDTA非動物源invitrogen人轉(zhuǎn)鐵蛋白HumanHoloTransferrin人源R&DPBSPBS非動物源invitrogenDME/F12培養(yǎng)基DME/F12非動物源hyclone羥乙基哌嗪乙硫磺酸緩沖液HEPES非動物源sigma重組人血小板源性生長因子PDGF-BB非動物源R&D成纖細胞生長因子bFGF非動物源R&D人轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β1非動物源R&D3制備工藝路線的選擇根據(jù)國內(nèi)外有關(guān)CAR-T細胞的分離培養(yǎng)研究方法，結(jié)合本公司實際情況，研究出一套生產(chǎn)可行，質(zhì)量可控的靶向GPC3的自體CAR-T細胞回輸制劑的分離、培養(yǎng)、傳代、收獲等一系列的制備工藝和質(zhì)控方法，并在該工藝下對培養(yǎng)出來的細胞純度，形態(tài)，鑒別，檢查以及相關(guān)生物學(xué)特性進行質(zhì)量研究，制訂本產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。3.1實驗方案采集外周血50mL，以2000r·min-1離心l0min，收集上層自體血漿，56℃水浴滅活30min，置于4℃冷藏備用。下層血液與磷酸鹽緩沖液（PBS）按1∶1稀釋吹打均勻，加入2倍體積的淋巴細胞分離液，以2000r·min-1離心30min。吸取單個核細胞層，PBS洗滌細胞2次，以1500r·min-1離心10min。將細胞沉淀用含10%自體血漿的ALyS505N無血清培養(yǎng)基重懸，添加終濃度為50ng·mL-1抗CD3單克隆抗體、1000U·mL-1IFN-γ，放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。于第2天，添加CD3/CD28抗體偶聯(lián)磁珠激活T淋巴細胞（CD3/CD28抗體偶聯(lián)磁珠與T淋巴細胞的比例為3:1），同時添加終濃度為100U·mL-1IL-1α、300U·mL-1IL-2、30ng·mL-1IL-7。于第3天，按病毒和培養(yǎng)基的體積比1：500添加病毒液，病毒感染10天后，采用流式細胞術(shù)檢測CAR的表達情況。儀器設(shè)備：醫(yī)用潔凈工作臺SW-CJ-2F蘇州凈化設(shè)備有限公司離心機8420KUBOTA(日本久保田)生物顯微鏡CX21OLYMPUS(奧林巴斯公司)倒置相差顯微鏡IX71OLYMPUS(奧林巴斯公司)細胞培養(yǎng)箱MCO-20AICSANYO(三洋電機有限公司)3.1.1實驗步驟（1）設(shè)計GPC3-CAR分子。選擇可特異性識別GPC3的單鏈抗體GC33、CD8α鉸鏈區(qū)、CD28的穿膜結(jié)構(gòu)域，以及共刺激分子CD28、CD137和CD3ζ鏈的胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域為模版，通過柔性連接鏈將這些結(jié)構(gòu)串聯(lián)，獲得完整的可固定表達于Ｔ細胞膜上的CAR分子。此外，在遵循偏愛密碼子的基礎(chǔ)上，根據(jù)氨基酸密碼子的簡并性在保證氨基酸序列不變的情況下對基因序列進行改造，以增強CAR分子的表達效率。（2）構(gòu)建GPC3-CAR慢病毒表達載體。利用PCR和分子克隆技術(shù)按上述設(shè)計將識別GPC3抗原的單鏈抗體GC33與共刺激分子CD28、CD137和CD3ζ鏈的胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域進行基因重組，隨后通過人工合成和拼接技術(shù)，獲得靶向GPC3抗原的GPC3-CAR基因片段，再以XbaⅠ和BamHⅠ限制性酶切位點為克隆位點，利用亞克隆技術(shù)將GPC3-CAR基因片段插入慢病毒表達載體pCDH-CMV-MCS-EF1α-copGFP中，最終獲得攜帶GPC3-CAR基因片段的慢病毒表達載體pCDH-CMV-GPC3-CAR-EF1α-copGFP。（3）包裝GPC3-CAR慢病毒。用DMEM-HG培養(yǎng)基培養(yǎng)293FT細胞，將匯合度70%~80%的培養(yǎng)細胞接種到10cm培養(yǎng)皿中，含10%胎牛血清的DMEM-HG培養(yǎng)基換液。取2個1.5mlEP管，各加入500μl無血清DMEM-HG培養(yǎng)基，將3種慢病毒包裝質(zhì)粒pLP1、pLP2和pLP/VSVG與慢病毒表達載體按1∶1∶1∶1的比例混合后加入到1個EP管，另1個EP管加入PolyJetTM，3種包裝質(zhì)粒加上慢病毒表達載體的質(zhì)量與PolyJetTM體積比為1∶3。將2個EP管各自混勻后靜置5min，隨后將裝有Poly-JetTM的EP管中的液體緩緩加入裝有質(zhì)粒的EP管中，輕輕混勻后室溫靜置20min。然后將此復(fù)合物加入到培養(yǎng)的293FT細胞中，培養(yǎng)16h后棄掉上清液，加入含10%胎牛血清的DMEM-HG培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。24h后熒光顯微鏡觀察綠色熒光的發(fā)光情況，48h后收取上清液，于4℃條件下12000×g離心20min，0.45μm濾器過濾后用1.5mlEP管分裝后-80℃凍存?zhèn)溆?。?）制備GPC3-CAR慢病毒感染T細胞。取健康志愿者外周血，用Ficoll淋巴細胞分離液和密度梯度離心法分離得到PBMC。用含10%胎牛血清的KBM551培養(yǎng)基重懸細胞（2×106個/ml），并接種于T25培養(yǎng)瓶內(nèi)，加入IFN-γ（1000IU/ml），24h后加rIL-2（300IU/ml）和抗CD3抗體（50ng/ml）。72h后用GPC3-CAR慢病毒按8PFU慢病毒/細胞的感染復(fù)數(shù)感染T細胞。感染后的T細胞（5×105/ml）繼續(xù)培養(yǎng)，每隔1d加rIL-2(300U/ml)。（6）流式細胞術(shù)鑒定GPC3-CAR分子陽性Ｔ細胞比率。將GPC3-CAR慢病毒感染組T細胞收集到15ml離心管中，200×g離心5min后棄上清，加入1mlPBS重懸細胞，200×g離心5min后棄上清，再加入0.2mlPBS重懸細胞（5×106個/ml）后流式細胞儀檢測T細胞的綠色熒光表達情況，以表達綠色熒光的T細胞為GPC3-CAR表達陽性。（7）ELISA檢測GPC3-CAR-T細胞IFN-γ的分泌水平。將GPC3陽性的Huh-7細胞與GPC3陰性的SK-HEP-1細胞接種于12孔板（5×104個/孔），待細胞貼壁后，CAR-T組按照效靶比0.5∶1、1∶1和2∶1分別加入2.5×104、5×104和1×105個GPC3-CAR-T細胞，空載病毒組按照效靶比0.5∶1、1∶1和2∶1分別加入2.5×104、5×104和1×105個空載病毒感染的T細胞，對照組只加入2.5×104、5×104和1×105個GPC3-CAR-T細胞。每組設(shè)3個復(fù)孔，共培養(yǎng)24h后3000×g離心10min，收集上清液，用ELISA試劑盒檢測IFN-γ水平。將100μl收集的各組上清液加入到相應(yīng)孔中，之后按試劑盒說明書操作，測量450nm波長處光密度（D）值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算各樣本的IFN-γ（μl/ml）水平。3.2實驗結(jié)果4.2.1Westernblotting檢測GPC3-CAR分子在CAR-T細胞內(nèi)表達（屬于定性檢測）Westernblotting檢測結(jié)果（圖1）顯示，在GPC3-CAR-T細胞中可見蛋白相對分子質(zhì)量約為16kD和55kD蛋白帶2條，而對照組T細胞僅見16kD內(nèi)源性CD3ζ條帶，而GPC3-CAR的相對分子質(zhì)量為55kD，提示GPC3-CAR-T細胞確實能表達GPC3-CAR分子。3.2.2流式細胞術(shù)檢測慢病毒感染T細胞后表達的GPC3-CAR分子GPC3-CAR重組的慢病毒感染T細胞后，用流式細胞術(shù)檢測T細胞中GPC3-CAR分子表達結(jié)果（圖2）顯示，約54.88%GPC3-CAR慢病毒感染的T細胞（GPC3-Tcell）表達GPC3-CAR分子。3.2.3ELISA檢測GPC3-CAR-T細胞IFN-γ的分泌水平在ELISA檢測細胞因子釋放實驗中，與GPC3陽性Huh-7細胞共培養(yǎng)，GPC3-CAR-T細胞組CAR-T細胞比空載慢病毒感染的空載病毒組產(chǎn)生更多的IFN-γ[(21371.4±1808.3)vs(152.8±12.5)pg/ml,P<0.01]（圖A）。然而，當(dāng)這兩組T細胞與GPC3的SK-HEP-1細胞共培養(yǎng)時，IFN-γ的分泌量僅輕微增加[(153.9±13.2)vs(150.6±21.9)pg/ml,P>0.05]（圖B）。4生產(chǎn)過程主要工藝參數(shù)和質(zhì)控參數(shù)4.1生產(chǎn)過程主要工藝參數(shù)見下表4-1。表4-1主要生產(chǎn)過程工藝參數(shù)一覽表序號工序關(guān)鍵控制項目控制參數(shù)1GPC3-CAR分子設(shè)計scfv的親和力10-4-10-8M胞內(nèi)區(qū)共刺激分子數(shù)量2添加酶切位點序列5’端和3’端添加不同的酶切位點，以便定向克隆2GPC3-CAR慢病毒表達載體構(gòu)建GPC3-CAR質(zhì)粒酶切和慢病毒轉(zhuǎn)移載體酶切酶切時間2hGPC3-CAR質(zhì)粒酶切和慢病毒轉(zhuǎn)移載體連接GPC3-CAR質(zhì)粒酶切和慢病毒轉(zhuǎn)移載體摩爾比為3:1連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化熱激時間90s293T細胞密度接種密度為50%，轉(zhuǎn)染時細胞密度為70%培養(yǎng)基要求含110mg/L丙酮酸鈉、10%FBS的高糖DMEM慢病毒轉(zhuǎn)染效率80%以上慢病毒收集時間48h和72h慢病毒過濾雜質(zhì)0.45微米的過濾器過濾4GPC3-CAR慢病毒感染T細胞制備Ficoll分離單個核細胞CD3/CD28磁珠與T細胞比例 3:1感染滴度5感染時間10-14d4.2生產(chǎn)過程主要質(zhì)控參數(shù)見下表4-1。表4-1主要生產(chǎn)過程質(zhì)控參數(shù)一覽表類別樣品質(zhì)控項目質(zhì)控方法標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定頻次處理樣本檢測血液篩查HIV-1/2抗體酶聯(lián)免疫法陰性每份HBsAg酶聯(lián)免疫法陰性每份HCVAb酶聯(lián)免疫法陰性每份Anti-TP酶聯(lián)免疫法陰性每份細胞制備過程檢測細胞末次洗滌上清需氧菌及真菌全自動細菌分枝桿菌培養(yǎng)監(jiān)測系統(tǒng)檢測法陰性每批厭氧菌及真菌全自動細菌分枝桿菌培養(yǎng)監(jiān)測系統(tǒng)檢測法陰性每批細胞培養(yǎng)D5細胞形態(tài)鏡下觀察圓球狀細胞，呈集落狀聚團每批含細胞的培養(yǎng)液無菌直接培養(yǎng)法不得檢出每批細胞凍存收集細胞前細胞形態(tài)鏡下觀察呈懸浮，應(yīng)為集落圓團細胞每批細胞懸液細胞計數(shù)細胞計數(shù)儀檢測標(biāo)示量的90%～120%每批細胞懸液細胞活率細胞計數(shù)儀檢測≥85%每批細胞懸液無菌需氧菌及真菌全自動細菌分枝桿菌培養(yǎng)監(jiān)測系統(tǒng)檢測法陰性每批厭氧菌及真菌全自動細菌分枝桿菌培養(yǎng)監(jiān)測系統(tǒng)檢測法陰性每批細胞懸液及上清支原體培養(yǎng)法及DNA染色法陰性每批細胞懸液細胞表面抗原分析流式細胞術(shù)（FCM）符合規(guī)定每批細胞懸液GPC3-CAR分子表達率流式細胞術(shù)檢測符合規(guī)定每批細胞懸液IFN-γ的分泌水平ELISA檢測符合規(guī)定每批5生產(chǎn)工藝的驗證6生產(chǎn)過程的無菌控制本品作為注射用生物制品，成品具有生物活性無法進行常規(guī)的滅菌程序，為保證靶向GPC3的自體CAR-T細胞的無菌，細胞在生產(chǎn)制備過程中分別通過人、機、料、法、環(huán)等幾個方面進行無菌的管控工作。――人員：制備全過程涉及的制備人員、檢測人員均應(yīng)持有公司技術(shù)部門核發(fā)的《上崗證》，經(jīng)過相關(guān)無菌操作的培訓(xùn)及考核合格上方可上崗工作；制備期間，其個人健康及衛(wèi)生均應(yīng)符合相關(guān)規(guī)定，各項操作均需參照《無菌操作管理規(guī)程》《潔凈室衛(wèi)生管理規(guī)程》執(zhí)行；――儀器：制備全過程涉及的儀器設(shè)備均應(yīng)運行正常且應(yīng)及時填寫《設(shè)備運行記錄》；需滅菌使用的容器具，其滅菌過程應(yīng)處于受控狀態(tài)，滅菌符合規(guī)定，且在規(guī)定有效期內(nèi)。――物料：細胞制備全過程所用原、輔料應(yīng)經(jīng)確認來自合格供應(yīng)商，關(guān)鍵物料應(yīng)有廠家出具的全檢報告，無外源性污染。物料進出潔凈區(qū)按照《物料進入潔凈區(qū)標(biāo)準(zhǔn)操作程序》進行消毒或滅菌后方可進入潔凈工作區(qū)和用于生產(chǎn)制備。――環(huán)境：細胞制備區(qū)域環(huán)境監(jiān)控應(yīng)符合規(guī)定要求，定期對潔凈制備區(qū)的沉降菌、塵埃粒子以及潔凈空調(diào)系統(tǒng)的換氣、平均風(fēng)速等開展檢測；如有傳染病原體或污染物，均應(yīng)得到有效隔離，并按照《實驗室發(fā)現(xiàn)細胞污染的標(biāo)準(zhǔn)操作程序》執(zhí)行。――操作：細胞制備工藝操作過程應(yīng)符合對應(yīng)SOP的規(guī)定；操作過程應(yīng)滿足無菌要求，制備現(xiàn)場應(yīng)無污染及交叉污染。細胞制備各工序完畢后均應(yīng)及時清場，符合《清場管理規(guī)程》的要求。制備記錄、監(jiān)控記錄填寫應(yīng)符合規(guī)定要求，并與制備過程相符，有操作者，復(fù)核者簽名，細胞制備檔案內(nèi)容應(yīng)完整并經(jīng)復(fù)核。依據(jù)《細胞制備過程質(zhì)量控制點》的要求送樣并按規(guī)定要求進行檢測，通過生產(chǎn)工藝各過程質(zhì)控點監(jiān)控產(chǎn)品是否受到微生物的污染，檢測結(jié)果應(yīng)符合規(guī)定。QA人員依照《過程控制管理規(guī)程》，確保細胞制備過程相關(guān)因素受控，確保細胞質(zhì)量的安全。7參考文獻[1]WANGHL,ANATELLIF,ZHAIQJ,etal.Glypican-3asausefuldiagnosticmarkerthatdistinguisheshepatocellularcarcinomafrombenignhepatocellularmasslesions[J].ArchPatholLabMed,2008,132(11):1723-1728.DOI:10.1043/1543-2165-132.11.1723.[2]TOPALIANSL,WEINERGJ,PARDOLLDM.Cancerimmuno-therapycomesofage[J].JClinOncol,2011,29(36):4828-4836.DOI:10.1038/ncponc0101.[3]DRAKECG,JAFFEEE,PARDOLLDM.Mechanismsofim-muneevasionbytumors[J].AdvImmunol,2006,90:51-81.DOI:10.1016/S0065-2776(06)90002-9.[4]DAVILAML,RIVIEREI,WANGX,etal.