AbMole熒光染料的詳細講解

AbMole|關(guān)于熒光染料的詳細講解在這個充滿探索與發(fā)現(xiàn)的科研時代，每一個細微的細胞活動都蘊藏著生命的奧秘，熒光染料可以標(biāo)記微觀世界中的精細細胞結(jié)構(gòu)和生物大小分子，使生命科學(xué)研究變得絢爛多彩，為我們開啟了探索之門。AbMole為您介紹熒光染料的發(fā)光原理、主要種類和一些熱門染料的應(yīng)用。熒光染料的發(fā)光原理圖1熒光染料的發(fā)光原理熒光染料是指吸收某一波長的光波后能發(fā)射出另一波長大于吸收光光波的物質(zhì)，它們一般含有若干個芳香族基團，這些基團具有較強的光吸收能力，在吸收激發(fā)光能量后，染料分子的內(nèi)部能量狀態(tài)顯著提升，躍遷至一個不穩(wěn)定的激發(fā)態(tài)（S1’）。由于激發(fā)態(tài)具有較高的能量水平，它傾向于尋求向更穩(wěn)定的狀態(tài)轉(zhuǎn)變。一般有機分子會通過化學(xué)鍵的旋轉(zhuǎn)或振動等機械運動來逐步釋放能量，但經(jīng)過設(shè)計的熒光分子會先通過震動進入S1狀態(tài)隨后直接以光子的形式釋放剩余的能量，即發(fā)出熒光。熒光分子的主要種類熒光分子主要有香豆素類、花菁類染料、BODIPY類、熒光素和羅丹明類等幾種類型。香豆素?zé)晒馊玖戏肿恿亢苄?，可紫外激發(fā)，一般發(fā)藍色熒光，常常作為多色熒光檢測實驗中的藍光染料?；ㄝ既玖?Cyanine，簡寫Cy)是另一類常見的熒光染料，例如Cy3。花菁的核心結(jié)構(gòu)是兩個含氮雜環(huán)通過奇數(shù)的次甲基連接形成，每增加一個乙烯基團，會使得光譜紅移約100nm。熒光素和羅丹明都屬于氧雜蒽染料，它們具有極高的亮度，并且其激發(fā)和發(fā)射波長都位于可見光譜范圍內(nèi)，但是熒光素的pKa值為6.4，因此其光譜特性在很大程度上受環(huán)境pH值的影響，這一類熒光分子種類較多，最常見的包括異硫氰酸熒光素（FITC）、羧基熒光素、羅丹明，羅丹明6G、110、123等。二吡咯烷硼化合物，又名BODIPY，因其卓越的光物理特性而備受歡迎。它們具有高量子產(chǎn)率、出色的亮度、窄半峰寬的吸收和發(fā)射光譜等優(yōu)點。BODIPY的各種衍生物覆蓋了從綠色（BODIPYFL）到紅色（BODIPY650/665）的大部分可見光譜范圍，基于BODIPY的熒光探針目前廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)和環(huán)境科學(xué)領(lǐng)域。圖2常見熒光染料的化學(xué)結(jié)構(gòu)科研常用熒光染料熒光染料在生命科學(xué)和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中起到了重要的作用，它們可以染色細胞核、細胞膜和膜性結(jié)構(gòu)、線粒體、溶酶體等，也可以對細胞的狀態(tài)例如凋亡、活死等進行染色以便于大家分析，下面簡單介紹一些科研中常用的熒光染料。細胞核染色細胞核染料主要有DAPI和Hoechst系列產(chǎn)品。DAPI的最大激發(fā)和發(fā)射波長分別為350和460nm，發(fā)藍色熒光。DAPI無法活染，一般DAPI染色前需要對細胞進行多聚甲醛的固定。Hoechst則可以對活細胞進行染色，一般在延時成像等持續(xù)性的熒光觀察實驗中會用到該產(chǎn)品，其最大激發(fā)和發(fā)射波長與DAPI相接近。圖3Hoechst33342染色效果圖細胞線粒體染色和線粒體膜電位檢測MitoTracker系列染料可以選擇性地積聚在線粒體基質(zhì)中，通過與半胱氨酸殘基的游離硫醇基反應(yīng)來共價結(jié)合線粒體蛋白，從而可以對線粒體進行染色。線粒體膜電位對于細胞的正常能量代謝和功能維持至關(guān)重要，JC-1是一種廣泛用于檢測線粒體膜電位△Ψm的理想熒光探針。在線粒體膜電位較高時，JC-1聚集在線粒體的基質(zhì)中，形成聚合物，可以產(chǎn)生紅色熒光；在線粒體膜電位較低時，JC-1則不能聚集在線粒體的基質(zhì)中，此時JC-1為單體，可以產(chǎn)生綠色熒光，通過流式細胞術(shù)、激光掃描共聚焦顯微鏡等即可對細胞的膜電位進行量化或者定性分析。圖4JC-1染色效果圖活死細胞染色試劑盒：CalceinAM/PI當(dāng)需要對細胞的存活和死亡進行分析時，可以使用CalceinAM/PI雙重染色法。Calcein-AM可透過細胞膜但其自身并不是熒光分子，通過活細胞內(nèi)的酯酶作用，Calcein-AM能脫去AM基，產(chǎn)生的Calcein能發(fā)出強綠色熒光

(激發(fā):490nm，發(fā)射:515nm)。因此Calcein-AM僅對活細胞染色；而PI無法染色活細胞，只能穿過死細胞膜的無序區(qū)域而到達細胞核，并嵌入細胞的DNA雙螺旋從而產(chǎn)生紅色熒光

(激發(fā):535nm，發(fā)射:617nm)。通過上述兩種熒光染料的雙重染色即可分辨出細胞群體中死亡和存活的細胞。圖5活死細胞染色效果圖凋亡檢測試劑盒：AnnexinV-FITC/PI細胞在凋亡的早期會發(fā)生磷脂酰絲氨酸（PS）的外翻，而AnnexinV是一種磷脂結(jié)合蛋白，與PS有高度親和力，利用FITC標(biāo)記AnnexinV孵育細胞即可以檢測出早期凋亡的細胞，而用PI則可以檢測出已經(jīng)死亡的細胞。通常該試劑盒被用于凋亡細胞的流式定量。圖6AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測活性氧探針DCFH-DA活性氧（ReactiveOxygenSpecies，ROS）是機體進行正常有氧代謝的產(chǎn)物，含氧并且性質(zhì)活潑的一類物質(zhì)的總稱。包含超氧陰離子（O2-）、過氧化氫（H2O2）、羥自由基（OH-）、臭氧（O3）和單線態(tài)氧（1O2）等，由于它們含有不成對的電子，因此具有很高的化學(xué)反應(yīng)活性。DCFH-DA具有較強的非極性可以自由進出細胞膜，但當(dāng)它被胞內(nèi)的酯酶水解后則無法透過細胞膜，并且在被ROS氧化成DCF后具有熒光發(fā)光的能力。圖7DCFH-DA檢測ROS脂質(zhì)過氧化物探針BODIPYC11581/591可用于檢測細胞的脂質(zhì)過氧化情況。該染料可以插入細胞膜中，如果在細胞膜中發(fā)生氧化，則該染