備課素材：植物雜種細(xì)胞的篩選 高二上學(xué)期生物人教版選擇性必修3

植物雜種細(xì)胞的篩選2020版高中生物學(xué)選擇性必修三說(shuō)，融合后得到的雜種細(xì)胞再經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)可形成愈傷組織，并可進(jìn)一步發(fā)育成完整的雜種植株：然而，兩個(gè)不同親本的原生質(zhì)體經(jīng)誘導(dǎo)融合后,實(shí)際得到的是各種原生質(zhì)體的混合物,包括未融合的、同種細(xì)胞融合的和不同種細(xì)胞融合的原生質(zhì)體。因此,雜種細(xì)胞的篩選是獲得真正雜種的關(guān)鍵過(guò)程。高考題中常會(huì)考到篩選雜種細(xì)胞的方法。那么，如何篩選雜種細(xì)胞？1.物理特性篩選法物理特性篩選法又稱機(jī)械分離法,指的是利用親本原生質(zhì)體的大小、顏色、漂浮密度及電泳遷移率等的差異來(lái)篩選雜種細(xì)胞的方法。該方法主要包括天然顏色標(biāo)志分離法和雙熒光標(biāo)記選擇法。①天然顏色標(biāo)志分離法指的是用不同顏色的原生質(zhì)體進(jìn)行融合,一個(gè)親本通常選含有葉綠體或其他色素質(zhì)體的組織細(xì)胞,如葉片、莖、花等,另一個(gè)親本則選用不含色素的細(xì)胞,在異源原生質(zhì)體融合后能明顯識(shí)別。如非綠色原生質(zhì)體與含有葉綠體的原生質(zhì)體的融合,在融合初期根據(jù)雜種細(xì)胞兼有綠色和白色,可以在顯微鏡下用微量吸管將雜種細(xì)胞吸出來(lái),在帶有小格的Cuprak培養(yǎng)皿中進(jìn)行培養(yǎng)。②雙熒光標(biāo)記選擇法。對(duì)于形態(tài)、顏色上都不能區(qū)分的情況,可以用不同的熒光素分別標(biāo)記雙親細(xì)胞,如異硫氰酸熒光素(綠色熒光)和堿性蕊香紅熒光素(紅色熒光)。經(jīng)融合處理后,雜種細(xì)胞有兩種熒光標(biāo)記,在熒光顯微鏡下,用微量吸管吸出雜種細(xì)胞,但此方法效率較低。目前還可用熒光活性細(xì)胞分類器進(jìn)行自動(dòng)分揀,當(dāng)細(xì)胞群體通過(guò)細(xì)胞分類器時(shí),產(chǎn)生的微滴中只有單個(gè)細(xì)胞,經(jīng)電子掃描確定微滴的熒光特征并分類。這種技術(shù)準(zhǔn)確高效,但儀器較貴,目前尚難普及。例1、為了便于觀察細(xì)胞融合的狀況,通常用不同顏色的原生質(zhì)體進(jìn)行融合,若甲植物原生質(zhì)體采用幼苗的根為外植體,則乙植物可用幼苗的葉片為外植體。分析:用不同顏色的原生質(zhì)體進(jìn)行融合,以便于觀察和選擇雜種細(xì)胞,因?yàn)榧字参镞x用無(wú)葉綠體的根細(xì)胞,則乙選用有葉綠體的葉片細(xì)胞,融合初期雜種細(xì)胞為半綠半白,據(jù)此進(jìn)行選擇。例2、研究者通過(guò)體細(xì)胞雜交技術(shù),探索利用條斑紫菜和擬線紫菜培育雜種紫菜。下列相關(guān)敘述正確的是(D)A.從食用紫菜的動(dòng)物消化道內(nèi)提取蛋白酶,用于去除細(xì)胞壁B.原生質(zhì)體需在低滲溶液中長(zhǎng)期保存,以防止過(guò)度失水而死亡C.檢測(cè)原生質(zhì)體活力時(shí)可用苯酚品紅或甲紫溶液處理,活的原生質(zhì)體被染色D.

聚乙二醇促進(jìn)原生質(zhì)體融合后,以葉綠體顏色等差異為標(biāo)志可識(shí)別雜種細(xì)胞分析:D選項(xiàng)中,原生質(zhì)體融合后,可根據(jù)2種紫菜的葉綠體顏色差異,識(shí)別選出雜種細(xì)胞。2.低密度植板選擇法如果融合產(chǎn)物在失掉可鑒別的特征之前,無(wú)法分離出來(lái)單獨(dú)培養(yǎng),則可在融合處理之后,將原生質(zhì)體以很低的密度植板在瓊脂培養(yǎng)基上,原生質(zhì)體會(huì)彼此分散開(kāi),以便追蹤個(gè)別雜種細(xì)胞及其后代。采用這種選擇方法,以后就無(wú)須再進(jìn)行突變系的分離。例3、將融合原生質(zhì)體懸浮液和液態(tài)的瓊脂糖混合,在凝固前倒入培養(yǎng)皿,融合原生質(zhì)體分散固定在平板中,并獨(dú)立生長(zhǎng)、分裂形成愈傷組織。同一塊愈傷組織所有細(xì)胞源于1個(gè)融合原生質(zhì)體。分析:將融合原生質(zhì)體以很低的密度在平板中進(jìn)行培養(yǎng),1個(gè)融合原生質(zhì)體會(huì)獨(dú)立分裂形成一塊愈傷組織。3.互補(bǔ)選擇法互補(bǔ)選擇法是研究得最多、發(fā)展最快的一種選擇方法,包括隱性突變互補(bǔ)選擇、顯性抗性互補(bǔ)選擇和顯隱性雙突變體選擇。①隱性突變互補(bǔ)選擇指的是當(dāng)兩個(gè)非等位隱性基因控制的突變體細(xì)胞融合后,由于每一個(gè)親本貢獻(xiàn)一個(gè)功能正常的等位基因,糾正了親本對(duì)方的缺陷,使雜種細(xì)胞表現(xiàn)正常。該方法包括葉綠素缺失互補(bǔ)和營(yíng)養(yǎng)缺陷互補(bǔ)。其原理可分別表示為白化(aaBB)+白化(AAbb)→綠色(AAaaBBbb)、營(yíng)養(yǎng)缺陷(aaBB)+營(yíng)養(yǎng)缺陷(AAbb)→正常(AAaaBBbb)。②顯性抗性互補(bǔ)選擇。很多情況下,植物對(duì)抗生素、除草劑或其他有毒藥物的抗性為顯性。當(dāng)兩個(gè)親本各有1個(gè)顯性基因控制的單抗性狀時(shí),單抗的雙親細(xì)胞融合后產(chǎn)生雙抗的雜種細(xì)胞,可用選擇培養(yǎng)基將其選出來(lái)。例如,以抗5甲基色氨酸的胡蘿卜原生質(zhì)體和抗S氨乙基半胱氨酸的煙草原生質(zhì)體作親本,融合處理后通過(guò)對(duì)雙抗融合體的選擇,目前已獲得了這兩個(gè)親本的體細(xì)胞雜種。③顯-隱性雙突變體是指通過(guò)有性雜交的方法,將硝酸鹽還原酶缺陷的突變體(隱性)與鏈霉素抗性突變體(顯性)綜合在一個(gè)突變系中建立同時(shí)具有顯、隱性突變的雙突變體。它可以與任何一種無(wú)選擇標(biāo)記的原生質(zhì)體融合,根據(jù)親本對(duì)方對(duì)鏈霉素敏感以及雙突變體特殊的營(yíng)養(yǎng)需要(還原氮),用加有鏈霉素但不含還原態(tài)氮的培養(yǎng)基可將雜種細(xì)胞選擇出來(lái)。構(gòu)成雙突變體的隱性性狀目前都是用硝酸鹽還原酶缺陷,顯性性狀除鏈霉素抗性外,還有抗5-甲基色氨酸、卡那霉素抗性、抗鈴蘭氨酸等。由于與雙突變體融合的親本無(wú)需具有選擇標(biāo)記,這類雙突變體可以作為通用的雜交親本,擴(kuò)大了研究范圍。例4、現(xiàn)有甲、乙兩個(gè)煙草品種,其基因型分別為aaBB和AAbb,在光強(qiáng)大于800勒克斯時(shí)都不能生長(zhǎng),這是aa或bb作用的結(jié)果。取甲、乙的花粉分別培養(yǎng)成植株,將其葉肉細(xì)胞制成原生質(zhì)體,并將兩者相混,使之融合,誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞團(tuán)。然后放到大于800勒克斯光照下培養(yǎng),結(jié)果有的細(xì)胞團(tuán)不能分化,有的能分化發(fā)育成植株。能分化的細(xì)胞團(tuán)是由甲、乙兩品種的原生質(zhì)體融合來(lái)的。分析:甲、乙單倍體植株的原生質(zhì)體的基因型分別為aB和Ab,兩者融合后的雜種細(xì)胞基因型為AaBb,兩者隱性突變互補(bǔ),因此雜種細(xì)胞能在光強(qiáng)大于800勒克斯時(shí)正常生長(zhǎng)分化。4.

雙失活篩選法將一個(gè)親本的原生質(zhì)體用50—300Gy的X射線或γ射線輻射處理,使細(xì)胞核部分或全部失活,作為細(xì)胞質(zhì)供體,這項(xiàng)處理可以使未融合的胞質(zhì)供體細(xì)胞不能分裂。另一個(gè)親本用碘乙酸或碘乙酰胺處理,這兩種物質(zhì)能抑制糖酵解中的磷酸甘油醛脫氫酶的活性,使細(xì)胞質(zhì)暫時(shí)失活,因此未融合的受體細(xì)胞也不能分裂。融合處理后得到的雜種細(xì)胞只有一方親本的細(xì)胞核,形成不對(duì)稱雜種。在篩選時(shí),親本無(wú)論是細(xì)胞核失活還是細(xì)胞質(zhì)失活,均無(wú)法分裂,只有雜種細(xì)胞發(fā)生互補(bǔ)作用可以分裂形成愈傷組織,因此這種篩選方法稱為雙失活篩選法。此方法由于不需要雙親具有選擇標(biāo)志,雜種細(xì)胞即可被篩選出來(lái),所以應(yīng)用較廣泛。據(jù)統(tǒng)計(jì),現(xiàn)在90%以上的體細(xì)胞雜交為不對(duì)稱融合。例5、甲植物細(xì)胞核基因具有耐鹽堿效應(yīng),乙植物細(xì)胞質(zhì)基因具有高產(chǎn)效應(yīng)。在原生質(zhì)體融合前,需對(duì)原生質(zhì)體進(jìn)行處理,分別使甲原生質(zhì)體和乙原生質(zhì)體的細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核失活。兩種原生質(zhì)體1:1混合后,通過(guò)添加適宜濃度的PEG進(jìn)行融合。將融合原生質(zhì)體懸浮液和液態(tài)的瓊脂糖混合,在凝固前倒入培養(yǎng)皿,融合原生質(zhì)體分散固定在平板中,并獨(dú)立生長(zhǎng)、分裂形成愈傷組織。下列各項(xiàng)中能說(shuō)明這些愈傷組織只能來(lái)自雜種細(xì)胞的理由是(ABD)A.

甲、乙原生質(zhì)體經(jīng)處理后失活,無(wú)法正常生長(zhǎng)、分裂B.

同種融合的原生質(zhì)體因甲或乙原生質(zhì)體失活而不能生長(zhǎng)、分裂C.培養(yǎng)基含有抑制物質(zhì),只有雜種細(xì)胞才能正常生長(zhǎng)、分裂D.

雜種細(xì)胞由于結(jié)構(gòu)和功能完整可以生長(zhǎng)、