DB21T 3698-2023 飼用微生物制劑中丁酸梭菌的檢測(cè)　VIP

ICS65.120CCSB4621IDB21/T3698—2023 2規(guī)范性引用文件 3術(shù)語(yǔ)和定義 4縮略語(yǔ) 5稀釋液、培養(yǎng)基及試劑 6設(shè)備和實(shí)驗(yàn)器材 7檢驗(yàn)程序 28采樣 39試樣的制備 310操作步驟 311確證試驗(yàn) 412結(jié)果計(jì)算與報(bào)告 5附錄A（規(guī)范性）培養(yǎng)基和試劑 7附錄B（資料性）細(xì)菌DNA提取 9DB21/T3698—2023本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專(zhuān)利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專(zhuān)利的責(zé)任。本文件由遼寧省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出并歸口。本文件起草單位：大連三儀動(dòng)物藥品有限公司、遼寧國(guó)托檢測(cè)有限公司、江蘇三儀生物工程有限公司、大連工業(yè)大學(xué)、彰武縣畜牧業(yè)發(fā)展服務(wù)中心。本文件主要起草人：江國(guó)托、劉艷、單春?jiǎn)?、李娟、劉秋晨、于洪敏、王巖、趙紅秋、翟宏旭、田晶、陳玲、王效禹、宋蕙男、吳怡琦、劉星、冷寒冰。本文件發(fā)布實(shí)施后，任何單位和個(gè)人如有問(wèn)題和意見(jiàn)建議，均可以通過(guò)來(lái)電和來(lái)函等方式進(jìn)行反饋。我們將及時(shí)答復(fù)并認(rèn)真處理，根據(jù)實(shí)際情況依法進(jìn)行評(píng)估及復(fù)審。歸口管理部門(mén)通訊地址：遼寧省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳（沈陽(yáng)市和平區(qū)太原北街2號(hào)聯(lián)系電話(huà)文件起草單位通訊地址：大連三儀動(dòng)物藥品有限公司，遼寧省大連市甘井子區(qū)營(yíng)城子鎮(zhèn)營(yíng)旭路9號(hào)，聯(lián)系電話(huà)1DB21/T3698—2023飼用微生物制劑中丁酸梭菌的檢測(cè)本文件規(guī)定了飼用微生物制劑中丁酸梭菌的檢測(cè)方法。本文件適用于各種飼料添加劑各組分中丁酸梭菌的檢測(cè)。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T4789.2食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T8170數(shù)值修約規(guī)則與極限數(shù)值的表示和判定GB/T14699.1飼料采樣GB/T20195動(dòng)物飼料試樣的制備3術(shù)語(yǔ)和定義本文件沒(méi)有需要界定的術(shù)語(yǔ)和定義。4縮略語(yǔ)下列縮略語(yǔ)適用于本文件。FTGFluidThioglycollate，液體硫乙醇酸鹽5稀釋液、培養(yǎng)基及試劑5.10.85%滅菌生理鹽水。5.2丁酸梭菌培養(yǎng)基：見(jiàn)附錄A中的A.1。5.3革蘭氏染色液：見(jiàn)附錄A中的A.2。5.4細(xì)菌生化鑒定試劑盒。5.5細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒。5.6標(biāo)準(zhǔn)菌株：丁酸梭菌CICC10390。5.7實(shí)驗(yàn)室用水:按照GB/T6682進(jìn)行。6設(shè)備和實(shí)驗(yàn)器材2DB21/T3698—20236.1恒溫培養(yǎng)箱：37℃±1℃。6.2漩渦震蕩器：0～2800rpm。6.3顯微鏡：1000倍。6.4高壓滅菌鍋：105～134℃。6.5無(wú)菌玻璃或塑料培養(yǎng)皿Φ=90mm。6.6無(wú)菌錐形瓶250mL。6.7無(wú)菌玻璃或塑料涂布棒。6.8無(wú)菌吸管：1mL（具0.1mL刻度）和10mL（具0.5mL刻度）。6.9微生物鑒定儀。6.10電子天平：感量為0.1g、0.01g、0.0001g。6.114℃冰箱。6.12pH計(jì)：精確度0.1。6.13量筒：250mL。6.14普通PCR儀。6.15電泳儀。6.16凝膠成像儀。7檢驗(yàn)程序丁酸梭菌檢驗(yàn)程序見(jiàn)圖1。3DB21/T3698—2023圖1丁酸梭菌檢驗(yàn)程序8采樣實(shí)驗(yàn)室樣品真實(shí)，具有代表性。采樣工具，如鏟子、匙、采樣器、試管、廣口瓶、剪子等，應(yīng)是無(wú)菌器皿。采樣后，樣品應(yīng)及時(shí)送至微生物檢驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)。采樣數(shù)量和方式按照GB/T14699.1執(zhí)行。9試樣的制備按照GB/T20195進(jìn)行。10操作步驟10.1檢樣制備與稀釋以無(wú)菌操作取試樣25g(mL)，注入盛有225mL0.85%滅菌生理鹽水的錐形瓶中，均質(zhì)1min～2min或置振蕩器中振蕩30min，制成1︰10的初始菌懸液。吸取1︰10的初始菌懸液1mL，加入9mL0.85%滅菌生理鹽水，經(jīng)充分混勻后制成1︰100的稀釋液。根據(jù)樣品含菌量，按上述操作順序做進(jìn)一步的10倍系列遞增稀釋的稀釋度。10.2接種和培養(yǎng)選擇2個(gè)～3個(gè)適宜稀釋度，每個(gè)梯度3個(gè)平行，用無(wú)菌移液器分別吸取0.1mL稀釋液，接種到改良FTG培養(yǎng)基上，pH7.0±0.2。使用無(wú)菌的涂布棒快速、準(zhǔn)確地涂布接種于培養(yǎng)基表面，涂布棒不應(yīng)接觸平皿邊緣。每個(gè)平皿用一支無(wú)菌涂布棒。將涂布好的平皿蓋好，室溫中放置15min，使接種物完全被培養(yǎng)基吸收，倒置于37℃±1℃培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)24h±1h。10.3菌落計(jì)數(shù)及篩選4DB21/T3698—2023培養(yǎng)后，選取菌落數(shù)在30個(gè)～300個(gè)之間的平板計(jì)數(shù)，若平板中有較大片狀菌落生長(zhǎng)時(shí)，則不宜采用；若片狀菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，即可計(jì)算半個(gè)平板后乘以2以代表全皿菌落數(shù)。培養(yǎng)后的平板內(nèi)的培養(yǎng)基顏色由粉色變成淡黃色，典型丁酸梭菌菌落形態(tài)呈端圓，白色，稍凸，不透明，表面菌落稍有不規(guī)則。11確證試驗(yàn)11.1菌種制備自平板上挑取單菌落，劃線(xiàn)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)于丁酸梭菌改良FTG平板上，37℃±1℃嚴(yán)格厭氧培養(yǎng)24h±1h，從平板上選取至少5個(gè)良好分離的特征菌落，轉(zhuǎn)接保存，進(jìn)行確證試驗(yàn)。11.2形態(tài)觀察自轉(zhuǎn)接平板上挑取典型單菌落，做革蘭氏染色鏡檢。丁酸梭菌為革蘭氏陽(yáng)性菌，顯微鏡觀測(cè)菌體呈梭狀，有芽孢，芽孢呈橢圓形，中生或近中生。11.3生化確認(rèn)試驗(yàn)?zāi)壳吧虡I(yè)上的生化鑒定試劑盒或生化鑒定管，如果采用的培養(yǎng)基與本標(biāo)準(zhǔn)確證試驗(yàn)所用的培養(yǎng)基一致，可以按照商品說(shuō)明書(shū)使用這些試劑盒或生化鑒定管進(jìn)行該項(xiàng)確證試驗(yàn)。將挑選純化的單一菌落，用生化鑒定試劑盒或者生化鑒定管或者微生物鑒定儀按說(shuō)明進(jìn)行鑒定試驗(yàn)。丁酸梭菌生化特征見(jiàn)表1。表1丁酸梭菌生化特征+++-++--+-11.4PCR確證試驗(yàn)11.4.1DNA提取用商用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒或常用提取方法（附錄B）提取試樣DNA，并設(shè)置陰性、陽(yáng)性對(duì)照。11.4.2擴(kuò)增引物序列上游引物：F5′-CTTTATTTGGAGTAGCACCT-3′；5DB21/T3698—2023下游引物：R5′-CTAAAACTGACTGTGGCATT-3′。PCR反應(yīng)體系如表2所示。預(yù)計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物大小為171bp。11.4.3PCR反應(yīng)PCR反應(yīng)體系見(jiàn)表2。表2PCR反應(yīng)體系51311.4.4程序設(shè)定程序設(shè)定如下：①預(yù)變性：95℃5min；②變性：95℃30s；③退火：55℃30s④延伸：72℃30s；⑤保溫：4℃10min。步驟②至④的循環(huán)數(shù)設(shè)為35。11.4.5電泳用電泳緩沖液(1×TAE)制備1.0%瓊脂糖凝膠，加入Gelred染料。取5μLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物，進(jìn)行點(diǎn)樣。用DNA分子量標(biāo)記物做參照。3V/cm～5V/cm恒壓電泳，電泳30min，電泳檢測(cè)結(jié)果用凝膠成像儀記錄并保存。11.4.6確證結(jié)果11.4.6.1當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照孔出現(xiàn)171bp擴(kuò)增帶，陰性對(duì)照孔未出現(xiàn)目的條帶時(shí),試驗(yàn)結(jié)果成立。11.4.6.2被檢樣品出現(xiàn)171bp擴(kuò)增帶，丁酸梭菌陽(yáng)性；未出現(xiàn)相應(yīng)擴(kuò)增帶的樣品判為陰性。12結(jié)果計(jì)算與報(bào)告12.1菌落計(jì)數(shù)只計(jì)算符合10.3的菌落。菌落計(jì)數(shù)后，隨機(jī)挑取5個(gè)菌落進(jìn)行鑒定，根據(jù)證實(shí)為丁酸梭菌菌落數(shù)計(jì)算出該皿內(nèi)的菌數(shù)，然后乘其稀釋倍數(shù)即得每g（mL）樣品中的菌數(shù)，按式（1）計(jì)算：式中：6DB21/T3698—2023A—測(cè)定的丁酸梭菌菌落數(shù)，CFU/g(mL)。B—丁酸梭菌的可疑菌落總數(shù)。C—5個(gè)鑒定的菌落中確認(rèn)為丁酸梭菌的菌落數(shù)。f—稀釋倍數(shù)。最終結(jié)果按照GB/T8170數(shù)值修約規(guī)則修約至整數(shù)。示例：含有丁酸梭菌的樣品中106稀釋液在培養(yǎng)基平板上，生成的丁酸梭菌可疑菌落為100個(gè)，取5個(gè)鑒定，證實(shí)為丁酸梭菌的是4個(gè)，由1g飼料中含丁酸梭菌菌數(shù)為：12.2樣品中丁酸梭菌菌數(shù)的計(jì)算方法與報(bào)告選擇兩個(gè)連續(xù)稀釋度平板（每個(gè)稀釋度至少有一塊平板，其上經(jīng)確證后的丁酸梭菌數(shù)介于30個(gè)～300個(gè)之間），通過(guò)式（2）計(jì)算，即為1mL或1g樣品中的丁酸梭菌菌數(shù)N：式中：N 樣品中丁酸梭菌菌落數(shù)； 所有平板經(jīng)確證后的丁酸梭菌菌數(shù)的總和；V 平板的接種體積，單位為毫升（mL）；n1----------第一個(gè)稀釋度的平板數(shù)；n2----------第二個(gè)稀釋度的平板數(shù)；d----------第一個(gè)稀釋度的稀釋因子（未經(jīng)稀釋的液體樣品的d值）。按照GB/T8170數(shù)值修約規(guī)則將計(jì)算出的結(jié)果保留至兩位有效數(shù)字，也可將樣品的丁酸梭菌菌落數(shù)記錄為1.0--9.9乘以10的指數(shù)冪表示。報(bào)告每mL或每g樣品的丁酸梭菌估計(jì)數(shù)，單位CFU/g（mL）。示例1：若第一個(gè)稀釋度（10-4）經(jīng)確證后的菌落數(shù)為137和201，第二個(gè)稀釋度（10-5）經(jīng)確證后的菌落數(shù)為34和56，則：式中：按照GB/T8170數(shù)值修約規(guī)則得出每克或每毫升樣品中含丁酸梭菌估計(jì)數(shù)為19454545CFU/g（mL）或1.9×107CFU/g（mL）。示例2：若只有最后一個(gè)稀釋液（10-5）經(jīng)證實(shí)含丁酸梭菌菌落數(shù)為121和135，則：式中：按照GB/T8170數(shù)值修約規(guī)則得出每克或每毫升樣品中丁酸梭菌估計(jì)數(shù)為128000000CFU/g（mL）或1.3×108CFU/g（mL）。7DB21/T3698—2023（規(guī)范性）培養(yǎng)基和試劑A.1改良FTG培養(yǎng)基A.1.1成分胰蛋白胨15g酵母粉5g葡萄糖10g硫代乙醇酸鈉3gL-半胱氨酸鹽酸鹽0.5g氯化鈉2.5g瓊脂20g刃天青0.001g蒸餾水1000mLA.1.2制法將上述成分加于蒸餾水中，調(diào)pH值至7.0±0.2，加熱煮沸，121℃高壓滅菌15min。A.2革蘭氏染色A.2.1結(jié)晶紫染色液A.2.1.1成分結(jié)晶紫95%乙醇1%草酸銨水溶液A.2.1.2制法20mL80mL將結(jié)晶紫溶解于乙醇中，然后與草酸銨溶液混合。A.2.2革蘭氏碘液A.2.2.1成分碘碘化鉀蒸餾水300mLA.2.2.2制法將碘與碘化鉀先進(jìn)行混合，加入蒸餾水少許，充分振搖，待完全溶解后，再加蒸餾水至300mL。A.2.3沙黃復(fù)染液8DB21/T3698—2023A.2.3.1成分沙黃0.25g95%乙醇10mL蒸餾水90mLA.2.3.2制法將沙黃溶解于乙醇中，然后用蒸餾水稀釋。A.2.4染色法將涂片在火焰上固定，滴加結(jié)晶紫染色液，染色1min，水洗；滴加革蘭氏碘液，作用1min，水洗；滴加95%乙醇脫色，約30s，水洗；滴加沙黃復(fù)染液，復(fù)染1min，水洗，待干，鏡檢。9DB21/T3698—2023細(xì)菌DNA提取B.1細(xì)菌DNA提取步驟B.1.1細(xì)菌培養(yǎng)細(xì)菌接種于5mL液體培養(yǎng)基中，37℃搖床（300rpm）培養(yǎng)過(guò)夜。B.1.2細(xì)菌收集取1mL培養(yǎng)物于1.5mL無(wú)菌EP管中，室溫8000rpm離心5min，棄上清，沉淀重新懸浮于1mLTE（pH8.0）中或ddH2O中。B.1.3菌體裂解