2024-2025學(xué)年高中生物專題5DNA和蛋白質(zhì)技術(shù)課題2多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段學(xué)案新人教版選修1

PAGE10-課題2多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段學(xué)問點(diǎn)一PCR原理及反應(yīng)過程1．PCR的原理(1)概念：PCR是多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的簡(jiǎn)稱，是一種體外快速擴(kuò)增DNA片段的技術(shù)，它能以極少量的DNA為模板，在幾小時(shí)內(nèi)復(fù)制出上百萬份的DNA拷貝。(2)擴(kuò)增方向：總是從子鏈的5′端向3′端延長(zhǎng)。(3)引物①本質(zhì)：引物是一小段DNA或RNA，它能與DNA母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對(duì)。用于PCR的引物長(zhǎng)度通常為20～30個(gè)核苷酸。②須要引物的緣由：DNA聚合酶不能從頭起先合成DNA，而只能從3′端延長(zhǎng)DNA鏈，因此，DNA復(fù)制須要引物。(4)原理DNA的熱變性原理，即雙鏈DNAeq\o(,\s\up17(變性加熱至80～100℃),\s\do15(復(fù)性緩慢冷卻))單鏈DNA。(5)反應(yīng)條件：①肯定的緩沖溶液；②DNA模板；③分別與兩條模板鏈相結(jié)合的兩種引物；④四種脫氧核苷酸；⑤耐熱的DNA聚合酶，一般用TaqDNA聚合酶；⑥能嚴(yán)格限制溫度改變的溫控設(shè)備。2．PCR的反應(yīng)過程(1)過程①變性：當(dāng)溫度上升到90℃以上時(shí)，雙鏈DNA解聚為單鏈。②復(fù)性：溫度下降到50℃左右時(shí)，兩種引物通過堿基互補(bǔ)配對(duì)與兩條單鏈DNA結(jié)合。③延長(zhǎng)：當(dāng)溫度上升到72℃左右，溶液中的四種脫氧核苷酸在DNA聚合酶的作用下，依據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則合成新的DNA鏈。(2)結(jié)果①PCR一般要經(jīng)驗(yàn)三十多次循環(huán)，每次循環(huán)都包括變性、復(fù)性、延長(zhǎng)三步。②兩個(gè)引物之間的固定長(zhǎng)度的DNA序列呈指數(shù)擴(kuò)增。留意：①可以依據(jù)基因編碼序列兩端的部分堿基序列來設(shè)計(jì)引物；②設(shè)計(jì)引物時(shí)，引物太短會(huì)降低PCR的特異性；③引物自身及兩種引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列；④擴(kuò)增過程中，在第三輪循環(huán)產(chǎn)物中起先出現(xiàn)兩條脫氧核苷酸鏈等長(zhǎng)的DNA片段；⑤擴(kuò)增n次后，含某種引物的DNA片段數(shù)為2n－1。細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制與PCR技術(shù)的比較PCR技術(shù)是一種體外快速擴(kuò)增DNA片段的技術(shù)，與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制的過程相比既有相同點(diǎn)又有不同點(diǎn)，通過列表比較的方法精確駕馭兩者的異同，是防止此類問題出錯(cuò)的重要措施。細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制與體外DNA擴(kuò)增(PCR)的比較：【典題精練1】多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是一種體外快速擴(kuò)增DNA片段的技術(shù)。PCR過程一般經(jīng)驗(yàn)三十多次下述循環(huán)：95℃下變性(使模板DNA解旋)→55℃下復(fù)性(引物與DNA模板鏈結(jié)合)→72℃下延長(zhǎng)(形成新的脫氧核苷酸鏈)。下列有關(guān)PCR過程的敘述不正確的是()A．在PCR的變性過程中破壞的是DNA分子內(nèi)堿基對(duì)之間的氫鍵，DNA在人體細(xì)胞內(nèi)復(fù)制時(shí)可利用解旋酶實(shí)現(xiàn)B．復(fù)性過程中引物與DNA模板鏈的結(jié)合是依據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則完成的C．延長(zhǎng)過程中須要耐高溫的DNA聚合酶、ATP、四種核糖核苷酸D．PCR與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制相比所須要酶的最適溫度較高【答案】C【解析】變性是為了使DNA內(nèi)部的氫鍵斷裂，雙螺旋打開，DNA在人體細(xì)胞內(nèi)復(fù)制時(shí)借助解旋酶來實(shí)現(xiàn)；依據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，引物可與DNA模板鏈結(jié)合；延長(zhǎng)是形成新的DNA分子，須要以四種脫氧核苷酸為原料；PCR過程所需溫度較高，會(huì)導(dǎo)致一般的DNA聚合酶失活，需特定的耐高溫的DNA聚合酶。解題歸納細(xì)胞內(nèi)參加DNA復(fù)制的組分和基本條件及其作用條件組分作用模板DNA的兩條單鏈供應(yīng)DNA復(fù)制的模板原料四種脫氧核苷酸合成DNA子鏈的原料酶解旋酶、DNA聚合酶打開DNA雙螺旋、催化合成DNA子鏈能量ATP為解螺旋和合成子鏈供能引物RNA為DNA聚合酶供應(yīng)合成的3′端起點(diǎn)【典題精練2】下列關(guān)于DNA復(fù)制的敘述，正確的是()A．DNA聚合酶不能從頭起先合成DNA，只能從5′端延長(zhǎng)DNA鏈B．DNA復(fù)制不須要引物C．引物與DNA母鏈通過堿基互補(bǔ)配對(duì)進(jìn)行結(jié)合D．DNA的合成方向總是從子鏈的3′端向5′端延長(zhǎng)【答案】C【解析】DNA聚合酶不能從頭起先合成DNA，只能從引物的3′端延長(zhǎng)DNA鏈；子鏈?zhǔn)且罁?jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，在DNA聚合酶作用下合成的，其合成方向是從子鏈的5′端向3′端延長(zhǎng)。學(xué)問點(diǎn)二PCR的試驗(yàn)操作、結(jié)果分析與評(píng)價(jià)1．試驗(yàn)操作(1)試驗(yàn)用具①PCR儀：參照下表設(shè)計(jì)循環(huán)程序。變性復(fù)性延長(zhǎng)預(yù)變性94℃，5min————30次94℃，30s55℃，30s72℃，1min最終1次94℃，1min55℃，30s72℃，1min提示：若無PCR儀可用恒溫水浴鍋代替。②微量離心管：是一種薄壁塑料管，總?cè)莘e為0.5mL。③微量移液器：用于定量轉(zhuǎn)移PCR反應(yīng)體系配方中的液體，其上的一次性吸液槍頭用一次更換一次。(2)操作步驟①打算：依據(jù)PCR反應(yīng)體系的配方將所需試劑擺放在試驗(yàn)桌上。②移液：用微量移液器按配方向微量離心管中依次加入各組分。③混合：蓋嚴(yán)離心管口的蓋子，用手指輕輕彈擊管壁。④離心：將微量離心管放在離心機(jī)上，離心約10s，目的是使反應(yīng)液集中在離心管底部。⑤反應(yīng)：將微量離心管放入PCR儀中，設(shè)置程序進(jìn)行反應(yīng)。2．結(jié)果分析與評(píng)價(jià)DNA在260nm的紫外線波段有一劇烈的汲取峰，可以利用DNA的這一特點(diǎn)進(jìn)行DNA含量的測(cè)定，以推斷DNA片段的擴(kuò)增是否勝利。詳細(xì)方法如下。(1)稀釋：取2μLPCR反應(yīng)液，加入98μL蒸餾水，即將樣品進(jìn)行50倍稀釋。(2)比照調(diào)零：以蒸餾水作為空白比照，在波長(zhǎng)260nm處，將紫外分光光度計(jì)的讀數(shù)調(diào)整至零。(3)測(cè)定：取步驟(1)中的DNA稀釋液100μL至比色杯中，測(cè)定260nm處的光汲取值。(4)計(jì)算：檢測(cè)DNA片段的擴(kuò)增狀況，可以通過計(jì)算DNA含量來評(píng)價(jià)擴(kuò)增的效果，計(jì)算公式為DNA含量(μg/mL)＝50×(260nm的讀數(shù))×稀釋倍數(shù)。留意：假如擴(kuò)增不勝利，可能的緣由有漏加了PCR的反應(yīng)成分、各反應(yīng)成分的用量不當(dāng)、PCR程序設(shè)置不當(dāng)?shù)取?．PCR試驗(yàn)中的留意事項(xiàng)(1)避開外源DNA污染：所用的器材、緩沖液、蒸餾水等在運(yùn)用前必需進(jìn)行高壓滅菌。(2)緩沖液和酶應(yīng)分裝成小份，在－20℃儲(chǔ)存。(3)每添加一種反應(yīng)成分，應(yīng)更換一個(gè)移液器的槍頭。(4)混勻后離心處理，使反應(yīng)液集中在離心管底部。2．PCR反應(yīng)中比照試驗(yàn)的設(shè)置探究目的試驗(yàn)組比照組PCR反應(yīng)須要四種脫氧核苷酸加四種脫氧核苷酸不加四種脫氧核苷酸PCR反應(yīng)須要兩種引物加兩種引物不加兩種引物PCR反應(yīng)須要DNA模板加DNA模板不加DNA模板PCR反應(yīng)須要TaqDNA聚合酶加TaqDNA聚合酶不加TaqDNA聚合酶【典題精練3】在PCR擴(kuò)增DNA的試驗(yàn)中，預(yù)料一個(gè)DNA分子經(jīng)過30次循環(huán)后，應(yīng)當(dāng)?shù)玫?30個(gè)DNA分子，但是結(jié)果只有約210個(gè)DNA分子，那么出現(xiàn)該現(xiàn)象的緣由不行能是()A．TaqDNA聚合酶的活力不夠，或活性受到抑制B．系統(tǒng)設(shè)計(jì)欠妥C．循環(huán)次數(shù)不夠D．引物不能與親鏈結(jié)合【答案】D【解析】假如TaqDNA聚合酶活力不夠，或活性受到抑制，則導(dǎo)致催化效率降低，得到的產(chǎn)物比預(yù)期的少，A項(xiàng)正確。假如PCR系統(tǒng)設(shè)置不妥，也達(dá)不到預(yù)期的結(jié)果，B項(xiàng)正確。假如循環(huán)次數(shù)過少，產(chǎn)物的量比預(yù)期的少，C項(xiàng)正確。假如引物設(shè)計(jì)不合理，或許不能與模板DNA結(jié)合，造成無法進(jìn)行擴(kuò)增，而結(jié)果得到了210個(gè)DNA分子，則D項(xiàng)錯(cuò)誤。解題歸納做該類題目的關(guān)鍵是駕馭在PCR擴(kuò)增過程中，每一步不同的處理都可能導(dǎo)致錯(cuò)誤，影響DNA的擴(kuò)增。PCR一般要經(jīng)驗(yàn)三十多次循環(huán)，每次循環(huán)可以分為變性、復(fù)性和延長(zhǎng)三步。【典題精練4】下列關(guān)于PCR操作過程的敘述，錯(cuò)誤的是()A．PCR試驗(yàn)中運(yùn)用的微量離心管、槍頭、緩沖液以及蒸餾水等在運(yùn)用前必需進(jìn)行高壓滅菌B．PCR運(yùn)用的緩沖液和酶從冰箱拿出之后，快速溶化C．PCR所用的緩沖液和酶應(yīng)分裝成小份，并在－20℃儲(chǔ)存D．在微量離心管中添加反應(yīng)成分時(shí)，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必需更換【答案】B【解析】在冰箱中放置的緩沖液和酶從冰箱拿出之后，應(yīng)放在冰塊上緩慢溶化，不能快速溶化。一、選擇題1．DNA的復(fù)制須要引物，其主要緣由是(D)A．可加快DNA的復(fù)制速度B．引物可與DNA母鏈通過堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合C．引物的5′端有助于DNA聚合酶延長(zhǎng)DNA鏈D．DNA聚合酶只能從3′端延長(zhǎng)DNA鏈解析：DNA的兩條鏈?zhǔn)欠聪蚱叫械模瑸榱嗣鞔_地表示DNA的方向，通常將DNA的羥基(—OH)末端稱為3′端，磷酸基團(tuán)的末端稱為5′端。DNA聚合酶不能從5′端起先合成DNA，而只能從3′端延長(zhǎng)DNA鏈。因此，DNA復(fù)制須要引物。當(dāng)引物與DNA母鏈通過堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合后，DNA聚合酶就能從引物的3′端起先延長(zhǎng)DNA鏈，DNA的合成方向總是從子鏈的5′端向3′端延長(zhǎng)。2．下圖表示DNA變性和復(fù)性示意圖，下列相關(guān)說法正確的是(A)A．向右的過程為加熱(80～100℃)變性的過程B．向左的過程是DNA雙鏈快速致冷復(fù)性C．變性與在生物體內(nèi)解旋過程的條件、實(shí)質(zhì)都相同D．圖中DNA片段共有4個(gè)游離的磷酸基、4個(gè)3′端解析：向左為緩慢冷卻復(fù)性；變性是在90°C以上時(shí)，DNA雙鏈解旋為單鏈，這一過程在生物體內(nèi)需解旋酶；圖中DNA片段有兩個(gè)游離磷酸基，2個(gè)3′端。3．有關(guān)PCR技術(shù)，下列敘述不正確的是(C)A．聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是用DNA聚合酶在體外擴(kuò)增DNA片段的技術(shù)B．在用PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA時(shí)，DNA的復(fù)制過程與細(xì)胞內(nèi)DNA的復(fù)制類似C．PCR反應(yīng)只需在肯定的緩沖溶液中進(jìn)行，需供應(yīng)：DNA模板以及四種脫氧核苷酸D．PCR一般經(jīng)驗(yàn)三十多次循環(huán)，每次循環(huán)分為變性、復(fù)性和延長(zhǎng)解析：PCR反應(yīng)須要在肯定的緩沖溶液中進(jìn)行，需供應(yīng)DNA模板、分別與兩條模板鏈相結(jié)合的兩種引物、四種脫氧核苷酸、耐熱的DNA聚合酶，同時(shí)通過限制溫度使DNA復(fù)制在體外反復(fù)進(jìn)行。4．下列有關(guān)PCR技術(shù)的說法不正確的是(A)A．PCR技術(shù)是在細(xì)胞內(nèi)完成的B．PCR技術(shù)是一項(xiàng)在生物體外復(fù)制特定DNA的核酸合成技術(shù)C．PCR技術(shù)的原理與DNA復(fù)制的原理相同D．PCR技術(shù)的前提是有一段已知的目的基因的核苷酸序列解析：PCR技術(shù)是在生物體外進(jìn)行DNA復(fù)制的技術(shù)，其原理與DNA復(fù)制的原理相同，但前提是必須要有一段已知的目的基因的核苷酸序列和依據(jù)核苷酸序列合成的引物。5．下列關(guān)于PCR技術(shù)的敘述，正確的是(D)A．PCR技術(shù)建立在對(duì)擴(kuò)增的目的基因序列完全已知的基礎(chǔ)上B．該技術(shù)須要解旋酶和熱穩(wěn)定的DNA聚合酶C．該技術(shù)須要一對(duì)特異性的引物，且要求這一對(duì)引物的序列是互補(bǔ)的D．該技術(shù)應(yīng)用體內(nèi)DNA復(fù)制的原理，也須要模板、原料、酶等條件解析：利用PCR技術(shù)進(jìn)行DNA擴(kuò)增時(shí)，目的基因的序列可以不是已知的，A錯(cuò)誤；由于PCR反應(yīng)須要在高溫條件下進(jìn)行，因此須要耐熱的DNA聚合酶，但PCR過程中DNA的解旋是通過限制溫度實(shí)現(xiàn)的，不須要解旋酶，B錯(cuò)誤；PCR反應(yīng)中的引物可分別與兩條模板鏈相結(jié)合，這對(duì)引物的序列不須要互補(bǔ)，C錯(cuò)誤；PCR技術(shù)應(yīng)用了細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制的原理，也須要DNA模板、原料(4種脫氧核苷酸)、酶(如TaqDNA聚合酶)等條件，D正確。6．下列有關(guān)DNA含量測(cè)定的敘述，錯(cuò)誤的是(C)A．可利用DNA在260nm的紫外線波段有一劇烈的汲取峰這一特點(diǎn)來進(jìn)行DNA含量的測(cè)定B．測(cè)定時(shí)通常須要對(duì)樣品進(jìn)行稀釋C．干脆將樣品放在波長(zhǎng)260nm處，測(cè)定其光汲取值D．可利用“DNA含量＝50×光汲取值×稀釋倍數(shù)”來計(jì)算樣品中的DNA含量解析：對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定前要以蒸餾水作為空白比照，在波長(zhǎng)260nm處，將紫外分光光度計(jì)的讀數(shù)調(diào)整至零，而不能干脆測(cè)定樣品的光汲取值。二、非選擇題7．近年來，PCR(多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))技術(shù)已成為分子生物學(xué)試驗(yàn)室里的一種常規(guī)手段，其原理是利用DNA半保留復(fù)制，在試管中進(jìn)行DNA的人工復(fù)制(如下圖)，在很短的時(shí)間內(nèi)，將DNA擴(kuò)增幾百萬倍甚至幾十億倍，使試驗(yàn)室所須要的遺傳物質(zhì)不再受限于活的生物體。(1)加熱使DNA雙鏈打開，這一步是打開氫鍵，稱為變性。(2)當(dāng)溫度緩慢降低時(shí)，引物與模板3′端結(jié)合，在DNA聚合酶的作用下，引物沿模板延長(zhǎng)，最終合成兩個(gè)DNA分子。此過程中，原料是四種脫氧核苷酸，遵循的原則是堿基互補(bǔ)配對(duì)原則。(3)PCR技術(shù)的必要條件，除了模板、原料、ATP、酶以外，至少還須要三個(gè)，即液體環(huán)境、相宜的溫度和酸堿度，前者由PCR儀自動(dòng)調(diào)控，后者則靠緩沖溶液來維持。(4)通過PCR技術(shù)使DNA分子大量復(fù)制時(shí)，若將一個(gè)用含15N標(biāo)記的模板DNA分子放入試管中，以含14N標(biāo)記的脫氧核苷酸為原料，連續(xù)復(fù)制三次后，則含15N標(biāo)記的DNA鏈占全部DNA總單鏈數(shù)的比例為1/8。解析：本題考查體內(nèi)DNA復(fù)制與PCR技術(shù)的原理以及基本條件。(1)PCR技術(shù)中第一步是利用高溫使DNA雙鏈間的氫鍵斷裂，稱為變性。(2)PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制所須要的原料一樣，為腺嘌呤脫氧核苷酸、鳥嘌呤脫氧核苷酸、胞嘧啶脫氧核苷酸和胸腺嘧啶脫氧核苷酸，遵循的原則是堿基互補(bǔ)配對(duì)原則。(3)PCR技術(shù)與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制不完全相同，除了須要模板、原料、ATP、酶以外，還須要液體環(huán)境、相宜的溫度和酸堿度。相宜的溫度靠PCR儀自動(dòng)調(diào)控，酸堿度靠緩沖溶液來維持。(4)DNA的復(fù)制方式為半保留復(fù)制。1個(gè)DNA分子連續(xù)復(fù)制三次產(chǎn)生23＝8個(gè)DNA分子，共16條單鏈。含15N標(biāo)記的DNA鏈共有2條，所占比例為2/16＝1/8。8．多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是一種體外快速擴(kuò)增DNA片段的技術(shù)，它能以極少量的DNA為模板，在幾小時(shí)內(nèi)復(fù)制出上百萬份相同的DNA片段。請(qǐng)依據(jù)所學(xué)學(xué)問回答下列有關(guān)PCR技術(shù)的基本原理和應(yīng)用的問題。(1)PCR的原理：在80～100℃的溫度范圍內(nèi)，DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)將解體，雙鏈分開，這個(gè)過程稱為變性。當(dāng)溫度緩慢降低后，兩條彼此分別的DNA鏈又會(huì)重新結(jié)合成雙鏈，稱為復(fù)性。PCR利用了DNA的熱變性原理，通過限制溫度來限制雙鏈的解聚與結(jié)合。(2)20世紀(jì)80年頭，科學(xué)家從水生耐熱細(xì)菌Taq中分別得到耐高溫的Taq_DNA聚合酶，解決了高溫導(dǎo)致DNA聚合酶失活的問題，使PCR技術(shù)趨向自動(dòng)化。試驗(yàn)室中微生物的篩選所應(yīng)用的原理是人為供應(yīng)有利于目的菌株生長(zhǎng)的條件，同時(shí)抑制或阻擋其他微生物的生長(zhǎng)，其中用于篩選目的菌株的培育基稱為選擇培育基。(3)PCR反應(yīng)的條件：穩(wěn)定的緩沖液環(huán)境、DNA模板、分別與兩條模板鏈結(jié)合的兩種引物、四種脫氧核苷酸、耐熱的DNA聚合酶、能嚴(yán)格限制溫度改變的溫控設(shè)備等。(4)PCR一般要經(jīng)驗(yàn)三十多次循環(huán)，每次循環(huán)可以分為變性、復(fù)性和延長(zhǎng)三步。從其次輪循環(huán)起先，上一次循環(huán)的產(chǎn)物也作為模板參加反應(yīng)。DNA聚合酶只能特異性地復(fù)制處于兩個(gè)引物之間的DNA序列，使這段固定長(zhǎng)度的序列呈指數(shù)擴(kuò)增。假如在PCR反應(yīng)中只有一個(gè)DNA片段作為模板，在6次循環(huán)后，反應(yīng)體系中共有64個(gè)DNA分子。(5)簡(jiǎn)述目前PCR技