PCR引物的設(shè)計(jì)與實(shí)驗(yàn)操作技巧

微生物基因工程李剛副教授教學(xué)內(nèi)容一、PCR引物的設(shè)計(jì)與實(shí)驗(yàn)操作技巧聚合酶鏈?zhǔn)椒错憽⒎肿涌寺〖癉NA序列分析這三大類實(shí)驗(yàn)方法幾乎構(gòu)成了現(xiàn)代分子生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)工作的根底。而三者中，PCR方法在理論上出現(xiàn)最早，在實(shí)踐中應(yīng)用得最廣泛。PCR反響的七種根本成份熱穩(wěn)定DNA聚合酶。一對(duì)特異的引導(dǎo)DNA合成的寡核苷酸引物。dNTP〔混合液：標(biāo)準(zhǔn)PCR反響包含4種等摩爾濃度的脫氧核苷三磷酸，即dATP、dTTP、dCTP和dGTP。二價(jià)陽(yáng)離子。所有的熱穩(wěn)定DNA聚合酶都要求有游離的二價(jià)陽(yáng)離子，通常是Mg2+用于激活。一價(jià)陽(yáng)離子。標(biāo)準(zhǔn)PCR緩沖液內(nèi)包含有50mmol/L的KCl，它對(duì)于擴(kuò)增大于500bp的DNA片段是有益的，提高KCl濃度在約70－100mmol/L范圍內(nèi)對(duì)改善擴(kuò)增較短的DNA片段產(chǎn)物是有利的。模板DNA。含有靶序列的模板DNA科研單鏈或雙鏈形式參加PCR混合液中。閉環(huán)DNA模板的擴(kuò)增效率略低于線性DNA。盡管模板DNA的長(zhǎng)短不是PCR擴(kuò)增的關(guān)鍵因素，但當(dāng)使用高分子量的DNA〔>10kb〕作模板時(shí)，如用限制性內(nèi)切酶先行消化〔此酶不應(yīng)切割其中的靶序列〕，那么擴(kuò)增效果更好。PCR引物設(shè)計(jì)的幾條原那么：①引物長(zhǎng)度一般引物長(zhǎng)度為18-30堿基就足夠了。特殊情況下〔比方Tm值或GC含量不適宜〕可以進(jìn)一步延長(zhǎng)到50-60bp長(zhǎng)度。但超過(guò)60bp的引物長(zhǎng)度比較少見(jiàn)。原因一是超過(guò)60bp長(zhǎng)度的引物比較難以合成，因此合成價(jià)格大幅度增加。另外長(zhǎng)引物在合成的時(shí)候出錯(cuò)率也顯著增加。上下游引物的長(zhǎng)度應(yīng)該根本相等，最好相差不要超過(guò)3bp。2.堿基組成G＋C含量應(yīng)在40％到60％之間，4種堿基要在引物中分配均勻。假設(shè)是引物存在嚴(yán)重的GC傾向或AT傾向那么可以在引物5’端加適量的A、T或G、C尾巴。3.重復(fù)和自身互補(bǔ)序列不能有大于3bp的重復(fù)序列或自身互補(bǔ)序列存在。這種序列可形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，如果這種結(jié)構(gòu)在PCR條件下穩(wěn)定，它會(huì)非常有效地阻止寡聚核苷酸和靶DNA之間的復(fù)性。4．上下游引物的互補(bǔ)性一個(gè)引物的3‘端不允許結(jié)合到另一個(gè)引物的任何位點(diǎn)上。因?yàn)樵赑CR中引物的濃度往往是比較高，所以即使引物間微弱的互補(bǔ)，都會(huì)導(dǎo)致引物間形成雜交，隨后是引物二聚體的形成和擴(kuò)增。如果引物二聚體在PCR早期形成，它將和DNA聚合酶、引物及核苷酸競(jìng)爭(zhēng)進(jìn)而抑制靶DNA的擴(kuò)增。精心進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，應(yīng)用熱啟動(dòng)PCR或降落PCR或特制的DNA聚合酶〔如：AmpliGold，Perkin－Elmer〕都可以防止引物二聚體的形成。當(dāng)在一個(gè)PCR中應(yīng)用多對(duì)引物時(shí)，請(qǐng)注意檢查任何一個(gè)3’末端都不能和其他任何引物互補(bǔ)。5.解鏈溫度〔Tm〕解鏈溫度〔Tm〕：也稱熔化溫度。計(jì)算出來(lái)的兩個(gè)引物的Tm值相差不能大于5C。擴(kuò)增產(chǎn)物的Tm值與引物的Tm值相差不能大于10C。這些特性保證了擴(kuò)增產(chǎn)物在每個(gè)PCR循環(huán)可有效地變性。為什么要計(jì)算引物的解鏈溫度解鏈溫度的計(jì)算方法6.3‘末端

3’末端的性質(zhì)非常關(guān)鍵。如果可能的話，每個(gè)引物的3‘末端堿基應(yīng)為G或C，不能為A。然而，并不推薦使用3’端有NNCG或NNGC序列的引物，因?yàn)槟┒薌C堿基高的自由能可以促進(jìn)發(fā)夾結(jié)構(gòu)的形成，還可能產(chǎn)生引物二聚體。7．向引物的5‘端添加限制性酶切位點(diǎn)，噬菌體啟動(dòng)子等序列有用而又不與靶DNA序列互補(bǔ)的序列一般加到引物的5’末端。一般來(lái)說(shuō)，這些序列的存在不會(huì)顯著地影響寡核苷酸和靶DNA之間的復(fù)性。這些附加序列包括噬菌體啟動(dòng)子和GC夾子。限制性酶切位點(diǎn)是一個(gè)特殊情況。因?yàn)槲挥贒NA分子5‘末端的限制性酶切位點(diǎn)的切割效率比較低，所以引物應(yīng)當(dāng)超出限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)至少3個(gè)核苷酸。保護(hù)堿基確實(shí)定保護(hù)堿基確實(shí)定不是隨意的，通常每一種限制性內(nèi)切酶都有自己最正確的保護(hù)堿基。每一種限制性內(nèi)切酶與其對(duì)應(yīng)的最正確保護(hù)堿基請(qǐng)到NEB公司網(wǎng)站或互聯(lián)網(wǎng)上查詢。8.引導(dǎo)位點(diǎn)的設(shè)置根據(jù)實(shí)驗(yàn)的不同目的，引導(dǎo)位點(diǎn)的設(shè)置可能會(huì)受到突變位點(diǎn)、限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)、編碼序列、微衛(wèi)星序列和順式作用元件的影響。當(dāng)針對(duì)cDNA模板設(shè)計(jì)引物時(shí)，正向和反向引物最好結(jié)合到不同外顯子的不同區(qū)域。這些可以很容易地把來(lái)源于cDNA的擴(kuò)增產(chǎn)物和來(lái)源于污染的基因組DNA的擴(kuò)增產(chǎn)物區(qū)分開(kāi)。PCR設(shè)計(jì)軟件推薦PrimerPremier5WDNASISOligo7

PCR高保真酶推薦PE公司〔ABI〕Parken－ElmerDNA聚合酶，TakaRa公司的PrimeSTARHSPolymerase，ToYoBo公司的Kod－PlusPolymerase。PCR產(chǎn)物的克隆

在許多研究中,需要將PCR產(chǎn)物克隆,以獲得目的DNA片段。此時(shí),所用PCR循環(huán)數(shù)應(yīng)盡量小,以減少平臺(tái)效應(yīng)或非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的干擾。通常將PCR產(chǎn)物插入到載體中有以下一些方法。1.平末端連接：由于TaqDNA聚合酶往往在PCR產(chǎn)物3'端加上多余的非模板依賴堿基,在用平末端連接克隆PCR產(chǎn)物前,可用Klenow片段或T4DNA聚合酶處理補(bǔ)平末端。2.在PCR產(chǎn)物克隆載體尾部加dT或ddT：TaqDNA聚合酶會(huì)在3'端加上多余的非模板依賴堿基,而且對(duì)A優(yōu)先聚合,所以PCR產(chǎn)物末端的多余堿基大局部都是A.。利用這一特點(diǎn),可以經(jīng)限制酶切割產(chǎn)生的平末端用酶加上dT或ddT,使載體與PCR產(chǎn)物末端互補(bǔ)并進(jìn)行連接.載體末端加dT尾可直接用TaqDNA聚合酶和dTTP或ddTTP,ddTTP因缺少3-OH而不能再形成磷酸二酯鍵,保證在載體3'端只加上一個(gè)ddTTP,而其5'端所含的磷酸基團(tuán)可與PCR產(chǎn)物的3'端OH連接,連接產(chǎn)物在載體和PCR產(chǎn)物之間的雙鏈上帶兩個(gè)切口,這種重組DNA仍可轉(zhuǎn)化適宜的受體菌,并在細(xì)菌體內(nèi)修復(fù).目前很多公司已開(kāi)發(fā)出可直接用于克隆PCR產(chǎn)物的帶3'-T的T-Vector。3.粘性末端連接：利用引物中附加在5'端的限制酶位點(diǎn),直接將PCR產(chǎn)物經(jīng)適當(dāng)?shù)南拗泼盖懈詈螽a(chǎn)生粘性末端,與載體連接,產(chǎn)生重組DNA.如果下游兩個(gè)引物中含有兩個(gè)不同的限制酶位點(diǎn).經(jīng)酶切后可定向克隆到載體中。PCR反響有哪些關(guān)鍵環(huán)節(jié)？①模板核酸的制備，②引物的質(zhì)量與特異性，③酶的質(zhì)量④PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應(yīng)針對(duì)上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析研究。

模板最容易出現(xiàn)的問(wèn)題一、模板含有雜質(zhì)：①模板中含有雜蛋白質(zhì)；②模板中含有Taq酶抑制劑；③模板中蛋白質(zhì)沒(méi)有消化除凈，特別是染色體中的組蛋白；④在提取制備模板時(shí)喪失過(guò)多，或吸入酚；⑤模板核酸變性不徹底。在酶和引物質(zhì)量好時(shí)，不出現(xiàn)擴(kuò)增帶，極有可能是標(biāo)本的消化處理，模板核酸提取過(guò)程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應(yīng)固定,不宜隨意更改。

二、模板發(fā)生變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補(bǔ)序列，其PCR擴(kuò)增是不會(huì)成功的。通常模板發(fā)生變異的主要原因是模板切膠回收時(shí)間過(guò)長(zhǎng)〔一般應(yīng)控制在1分鐘以內(nèi)〕或無(wú)意中將模板置于超凈工作臺(tái)中滅菌所致。

PCR引物常見(jiàn)的問(wèn)題引物：引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對(duì)稱，是PCR失敗或擴(kuò)增條帶不理想、容易彌散的常見(jiàn)原因。有些批號(hào)的引物合成質(zhì)量有問(wèn)題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對(duì)稱擴(kuò)增，對(duì)策為：①選定一個(gè)好的引物合成單位。②引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無(wú)條帶，此時(shí)做PCR有可能失敗，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時(shí)要平衡其濃度。③引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止屢次凍融或長(zhǎng)期放冰箱冷藏，導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。④引物設(shè)計(jì)不合理，如引物長(zhǎng)度不夠，引物之間形成二聚體等。

DNA聚合酶的問(wèn)題酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時(shí)使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導(dǎo)致假陰性。需注意的是有時(shí)PCR失敗是由于忘加了酶。

Mg2+濃度Mg2+離子濃度對(duì)PCR擴(kuò)增效率影響很大，濃度過(guò)高可降低PCR擴(kuò)增的特異性，濃度過(guò)低那么影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使PCR擴(kuò)增失敗而不出擴(kuò)增條帶。對(duì)于一些難以擴(kuò)增的模板，建議買(mǎi)PCRBuffer中Mg2+free的PCR試劑，以便自己通過(guò)一些預(yù)實(shí)驗(yàn)找出PCR反響中最正確的Mg2+濃度。

PCR反響體積通常進(jìn)行PCR擴(kuò)增采用的體積為20ul、30ul、50ul?；?00ul，應(yīng)用多大體積進(jìn)行PCR擴(kuò)增，是根據(jù)科研和臨床檢測(cè)不同目的而設(shè)定，在做小體積如20ul后，再做大體積時(shí)，一定要模索條件，否那么容易失敗。如果不愿重新摸索條件，一個(gè)最簡(jiǎn)單可行的方法是按照小體積的條件多做幾管，最后將PCR產(chǎn)物聚集在一起。

另外，PCR管有普通管和薄壁管〔thinwallPCRtubes〕之分。普通管和薄壁管的熱傳導(dǎo)效率是不同的。熱蓋與非熱蓋PCR儀早期的PCR儀均為非熱蓋，因此每個(gè)PCR反響管中需要參加無(wú)菌石蠟油，以防止溶液的蒸發(fā)?，F(xiàn)在的PCR儀大局部都有熱蓋〔及頂部加熱器〕，會(huì)阻止溶液的蒸發(fā)，因此PCR反響管中不需參加石蠟油了。

PCR出現(xiàn)假陽(yáng)性的原因？

假陽(yáng)性：出現(xiàn)的PCR擴(kuò)增條帶與目的靶序列條帶一致，有時(shí)其條帶更整齊，亮度更高。出現(xiàn)假陽(yáng)性的原因主要有：

〔1〕引物設(shè)計(jì)不適宜：選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性，因而在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性。需重新設(shè)計(jì)引物。

〔2〕靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個(gè)基因組或大片段的交叉污染，導(dǎo)致假陽(yáng)性。這種假陽(yáng)性可用以下方法解決：操作時(shí)應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及樣進(jìn)槍頭等均應(yīng)一次性使用。必要時(shí)，在加標(biāo)本前，反響管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性?？苫ハ嗥唇?，與引物互補(bǔ)后，可擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物，而導(dǎo)致假陽(yáng)性的產(chǎn)生，這種污染可以通過(guò)更換實(shí)驗(yàn)場(chǎng)地來(lái)解決，有時(shí)也可用巢式PCR方法來(lái)減輕或消除。

非特異性擴(kuò)增帶出現(xiàn)的原因非特異性擴(kuò)增帶出現(xiàn)的對(duì)策〔一〕非特異性擴(kuò)增帶出現(xiàn)的對(duì)策〔二〕采用熱啟動(dòng)PCR：把PCR混合物在顯著低于Tm值的溫度下作哪怕短暫的保溫，也可能產(chǎn)生引物二聚體和非特異性配對(duì)。熱啟動(dòng)PCR那么可以大大減少這些麻煩。其目標(biāo)是在第一個(gè)循環(huán)中等溫度升到超過(guò)反響物的Tm值后才允許反響中的一兩種關(guān)鍵成分進(jìn)入反響。例如在覆蓋有礦物油的小試驗(yàn)中，所有反響管的一種公共成分〔如Taq酶〕可以先不加，而到第一個(gè)循環(huán)的變性階段溫度超過(guò)80℃以后再加。最近有一種熱啟動(dòng)的方法是在參加TaqDNA聚合酶前先在管中參加其單克隆抗體〔Clonetech公司的TaqStartAntibody，或者ToYoBo公司的KodPlusDNA聚合酶〕，在溫度升高到將中和抗體變性失活之前，抗體阻遏聚合酶的活性，防止反響開(kāi)始。非特異性擴(kuò)增帶出現(xiàn)的對(duì)策〔三〕嵌套式和半嵌套式PCR對(duì)于減少或消除不需要的產(chǎn)物同時(shí)提高靈敏度經(jīng)常是很成功的。首先在常規(guī)條件下用第一套跨越目的DNA片段的引物擴(kuò)增，假象產(chǎn)物經(jīng)常會(huì)與引物中的一條或兩條配對(duì)，但其內(nèi)部卻是無(wú)關(guān)序列。接著對(duì)一局部反響物－產(chǎn)物混合物進(jìn)行新一輪擴(kuò)增，采用的引物與第一對(duì)引物內(nèi)側(cè)的序列配對(duì)，在這一輪擴(kuò)增中只有真正的產(chǎn)物被擴(kuò)增。這種方法即使在目的產(chǎn)物開(kāi)始用EB染色檢測(cè)不到而且有假象帶時(shí)也常常獲得成功。半嵌套式PCR，只第二條引物在目的片段一端的內(nèi)側(cè)，也同樣有效。在基因步行或企圖進(jìn)行5‘或3’端RACE時(shí)，由于只有一條引物內(nèi)部的序列是的，經(jīng)常需要作這種變動(dòng)。采用嵌套式PCR方法，第一、二輪擴(kuò)增在第20個(gè)循環(huán)左右終止而不是象通常的在第30－35個(gè)循環(huán)終止會(huì)獲得更好的結(jié)果，這樣做減少了產(chǎn)生不需要的高分子量帶和成片產(chǎn)物的