第3章 基因工程（知識(shí)清單）期中考點(diǎn)大串講VIP

學(xué)而優(yōu)·教有方PAGEPAGE1第三章基因工程第一節(jié)重組DNA技術(shù)的基本工具一、DNA基因工程的基本工具DNA基因工程至少需要三種工具：“分子手術(shù)刀”——限制性核酸內(nèi)切酶（限制酶）；“分子縫合針”——DNA連接酶；“分子運(yùn)輸車”——基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體。（1）“分子手術(shù)刀”——限制性核酸內(nèi)切酶（限制酶）①來(lái)源：主要是從原核生物中分離純化出來(lái)的。②功能：能識(shí)別雙鏈DNA分子的某種特定的核苷酸序列，且使每一條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開(kāi)，因此具有專一性。③結(jié)果：經(jīng)限制酶切割產(chǎn)生的DNA片段末端通常有兩種形式：粘性末端和平末端。（2）“分子縫合針”——DNA連接酶①兩種DNA連接酶（E·coliDNA連接酶和T4DNA連接酶）的比較：a.相同點(diǎn)：都縫合磷酸二酯鍵。b.區(qū)別：E·coliDNA連接酶來(lái)源于T4噬菌體，只能將雙鏈DNA片段互補(bǔ)的粘性末端之間的磷酸二酯鍵連接起來(lái)；而T4DNA連接酶能縫合兩種末端，但連接平末端的之間的效率較低。②與DNA聚合酶作用的異同：DNA聚合酶只能將單個(gè)核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯鍵。DNA連接酶是連接兩個(gè)DNA片段的末端，形成磷酸二酯鍵。（3）DNA連接酶——“分子縫合針”①作用:將雙鏈DNA片段“縫合”起來(lái)，恢復(fù)被限制酶切開(kāi)的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵。②

種類:種類來(lái)源特點(diǎn)E.coliDNA連接酶大腸桿菌只能“縫合”具有互補(bǔ)粘性末端的雙鏈DNA片段T4DNA連接酶T4噬菌體既可以“縫合”雙鏈DNA片段互補(bǔ)粘性末端，又可“縫合”雙鏈DNA片段的平末端。（4）“分子運(yùn)輸車”——載體①載體具備的條件：a.能在受體細(xì)胞中復(fù)制并穩(wěn)定保存。b.具有一至多個(gè)限制酶切點(diǎn)，供外源DNA片段插入。c.具有標(biāo)記基因，供重組DNA的鑒定和選擇。②最常用的載體是質(zhì)粒，它是一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的、獨(dú)立于細(xì)菌染色體之外，并具有自我復(fù)制能力的雙鏈環(huán)狀DNA分子。③其它載體：噬菌體的衍生物、動(dòng)植物病毒二、DNA的粗提取與鑒定1.

實(shí)驗(yàn)原理:(1)DNA、

RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等在物理和化學(xué)性質(zhì)方面有差異,

選用適當(dāng)?shù)奈锢砘蚧瘜W(xué)方法對(duì)它們進(jìn)行提取。①DNA

不溶于酒精,

某些蛋白質(zhì)溶于酒精,

分離

DNA

和蛋白質(zhì)。②DNA

能溶于

2mol/L

的

NaCl

溶液。(2)DNA

遇二苯胺試劑會(huì)呈現(xiàn)藍(lán)色。2.

方法步驟:(1)

研磨:取

30g

洋蔥切碎,

倒入

10mL

研磨液研磨。(2)

除雜:

漏斗中墊上紗布過(guò)濾后,

在

4℃冰箱靜置后取上清液,

1500r/min

的轉(zhuǎn)速下離心后取上清液。(3)

提取:

加入體積相等、體積分?jǐn)?shù)

95%酒精,

溶液出現(xiàn)白色的絲狀物是

DNA。方法一:

用玻璃杯按一個(gè)(填“一個(gè)”

或“兩個(gè)”)

方向攪拌，卷起絲狀物，用濾紙吸去上面的水分。方法二:

10000r/min

的轉(zhuǎn)速下離心

5min,

取沉淀物晾干。（4）鑒定:項(xiàng)目AB2mol/L的Nacl溶液5mL絲狀物或沉淀物不加加入二苯胺試劑4mL沸水中加熱5分鐘現(xiàn)象無(wú)色藍(lán)色DNA

的鑒定和還原糖的鑒定都需要加熱,

它們有什么不同?提示:還原糖加斐林試劑后,

置于

55～65℃熱水中加熱;

而

DNA

加二苯胺試劑后,

置于沸水中加熱。第二節(jié)基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序主要包括四個(gè)步驟：目的基因的獲取、基因表達(dá)載體的構(gòu)建、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞、目的基因的檢測(cè)與鑒定。1.第一步：目的基因的獲?。?）目的基因是指：

編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因

。（2）原核基因采取直接分離獲得，真核基因是人工合成。人工合成目的基因常用方法有反轉(zhuǎn)錄法和化學(xué)合成法（3）PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因①原理：DNA雙鏈復(fù)制②過(guò)程：a：加熱至90-95℃DNA解鏈；b：冷卻到55-60℃，引物結(jié)合到互補(bǔ)DNA鏈；c：加熱至70-75℃，熱穩(wěn)定DNA聚合酶從引物起始互補(bǔ)鏈的合成。2.第二步：基因表達(dá)載體的構(gòu)建（1）目的：使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳至下一代，使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。（2）組成：目的基因＋啟動(dòng)子＋終止子＋標(biāo)記基因①啟動(dòng)子：是一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終獲得所需的蛋白質(zhì)。②終止子：也是一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA片段

，位于基因的尾端。③標(biāo)記基因的作用：是為了鑒定受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細(xì)胞篩選出來(lái)。常用的標(biāo)記基因是抗生素基因。3.第三步：將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞（1）轉(zhuǎn)化的概念：是目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過(guò)程。（2）常用的轉(zhuǎn)化方法：①將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞：采用最多的方法是

農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法，其次還有

基因槍法和

花粉管通道法等。②將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞：最常用的方法是

顯微注射技術(shù)。此方法的受體細(xì)胞多是

受精卵。③將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞：Ca2+處理法(感受態(tài)細(xì)胞法或CaCl2法)（3）重組細(xì)胞導(dǎo)入受體細(xì)胞后，篩選含有基因表達(dá)載體受體細(xì)胞的依據(jù)是標(biāo)記基因是否表達(dá)。4.第四步：目的基因的檢測(cè)和表達(dá)（1）首先要檢測(cè)

轉(zhuǎn)基因生物的染色體DNA上是否插入了目的基因，方法是采用

DNA分子雜交技術(shù)。（2）其次還要檢測(cè)

目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA，方法是采用

用標(biāo)記的目的基因作探針與mRNA雜交。（3）最后檢測(cè)

目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)，方法是從轉(zhuǎn)基因生物中提取

蛋白質(zhì)，用相應(yīng)的抗體進(jìn)行抗原－抗體雜交。（4）有時(shí)還需進(jìn)行

個(gè)體生物學(xué)水平的鑒定。如轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)植物是否出現(xiàn)抗蟲(chóng)性狀。第三節(jié)胚胎工程基因工程的應(yīng)用1.

植物基因工程：抗蟲(chóng)、抗病、抗逆轉(zhuǎn)基因植物，利用轉(zhuǎn)基因改良植物的品質(zhì)。2.

動(dòng)物基因工程：提高動(dòng)物生長(zhǎng)速度、改善畜產(chǎn)品品質(zhì)、用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)藥物。3.

基因治療：把正常的外源基因?qū)氩∪梭w內(nèi)，使該基因表達(dá)產(chǎn)物發(fā)揮作用。4.基因工程在農(nóng)牧業(yè)方面的應(yīng)用(1)發(fā)展:①農(nóng)牧業(yè):1996-2017

年,

全世界轉(zhuǎn)基因作物的種植面積增加了一百多倍,

美國(guó)是世界上轉(zhuǎn)基因作物種植面積最大的國(guó)家。

2017

年,

我國(guó)轉(zhuǎn)基因作物種植面積居世界第八位。②動(dòng)物:

第一種用于食用的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物——轉(zhuǎn)基因大西洋鮭在美國(guó)獲得批準(zhǔn)上市。(2)實(shí)例:連一連:

基于基因工程在改良動(dòng)植物品種、提高作物和畜產(chǎn)品的產(chǎn)量等方面的應(yīng)用,

將下列轉(zhuǎn)基因生物和選用的目的基因連線5.基因工程在醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域的應(yīng)用(1)

生產(chǎn)藥物:①常見(jiàn)的藥物:細(xì)胞因子、

抗體、

疫苗和激素等。

我國(guó)生產(chǎn)的重組人干擾素、

血小板生成素、

促紅細(xì)胞生成素和粒細(xì)胞集落刺激因子等基因工程藥物均已投放市場(chǎng)。②

批量生產(chǎn)藥物:乳腺(房)

生物反應(yīng)器。a.目的基因:藥用蛋白基因。b.啟動(dòng)子:乳腺中特異性表達(dá)的基因的啟動(dòng)子。c.受體細(xì)胞:受精卵。(2)移植器官:

在器官供體的基因組中導(dǎo)入某種調(diào)節(jié)因子,

以抑制抗原決定基因的表達(dá),

或設(shè)法除去抗原決定基因,

培育出不會(huì)引起免疫排斥反應(yīng)的轉(zhuǎn)基因克隆豬器官。(3)培養(yǎng)乳腺生物反應(yīng)器轉(zhuǎn)基因動(dòng)物時(shí)為什么要選用乳腺中特異性表達(dá)的基因的啟動(dòng)子?乳腺生物反應(yīng)器通過(guò)分泌的乳汁提取相應(yīng)的基因表達(dá)的產(chǎn)品,

乳腺中特異性表達(dá)的啟動(dòng)子可讓目的基因在乳腺細(xì)胞中表達(dá)。6.基因工程在食品工業(yè)方面的應(yīng)用(1)

氨基酸:

利用轉(zhuǎn)基因生物合成阿斯巴甜的原料——天冬氨酸和苯丙氨酸。(2)

酶:

利用轉(zhuǎn)基因生物生產(chǎn)奶酪的凝乳酶;

利用轉(zhuǎn)基因生物加工轉(zhuǎn)化糖漿的淀粉酶;

利用轉(zhuǎn)基因生物加工烘烤食品、制造生物能源的脂酶等。(3)

維生素。第四節(jié)蛋白質(zhì)工程的原理和應(yīng)用1.蛋白質(zhì)工程的概念:蛋白質(zhì)工程是指以蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)規(guī)律及其生物功能的關(guān)系作為基礎(chǔ)，通過(guò)基因修飾或基因合成，對(duì)現(xiàn)有蛋白質(zhì)進(jìn)行改造，或制造一種新的蛋白質(zhì)，以滿足人類的生產(chǎn)和生活的需求?；蚬こ淘谠瓌t上只能生產(chǎn)自然界已存在的蛋白質(zhì)2.

蛋白質(zhì)工程崛起的緣由(1)基因工程的實(shí)質(zhì)和不足:①

實(shí)質(zhì):

將一種生物的基因轉(zhuǎn)移到另一種生物體內(nèi),

后者可以產(chǎn)生它本不能產(chǎn)生的蛋白質(zhì),

進(jìn)而表現(xiàn)出新的性狀。②基因工程存在的不足:原則上只能生產(chǎn)自然界已存在的蛋白質(zhì)。(3)

蛋白質(zhì)工程的崛起:①理論和技術(shù)條件:分子生物學(xué)、晶體學(xué)以及計(jì)算機(jī)技術(shù)的迅猛發(fā)展。②天然蛋白質(zhì)存在不足:天然蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能符合特定物種生存的需要,

卻不一定完全符合人類生產(chǎn)和生活的需要。③實(shí)例:蛋白質(zhì)缺陷改造措施改造后果玉米中賴氨酸含量低賴氨酸合成中兩種酶的氨基酸背替換葉片和種子中游離的賴氨酸分別提高5倍和2倍3.蛋白質(zhì)工程的基本原理：（1）它可以根據(jù)人的需求來(lái)設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，又稱為第二代的基因工程。（2）基本途徑：從預(yù)期的蛋白質(zhì)功能出發(fā)，設(shè)計(jì)預(yù)期的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，推測(cè)應(yīng)有的氨基酸序列，找到相對(duì)應(yīng)的脫氧核苷酸序列（基因）。下圖中是蛋白質(zhì)工程的循序的是E、F、G、A、B、C、D；（3）設(shè)計(jì)中的困難：如何推測(cè)非編碼區(qū)以及內(nèi)含子的脫氧核苷酸序列4.蛋白質(zhì)工程的應(yīng)用（1）醫(yī)藥工業(yè)方面:①速效胰島素類似物:

改變氨基酸序列,

抑制胰島素的聚合。②干擾素:一個(gè)半胱氨酸替換為絲氨酸,

延長(zhǎng)保存時(shí)間。③單克隆抗體:將小鼠抗體上結(jié)合抗原的區(qū)域“嫁接”

到人的抗體上,

降低誘發(fā)免疫反應(yīng)的強(qiáng)度。（2）其他工業(yè)方面:

廣泛用于改進(jìn)酶的性能或