核酸核酸檢測技術(shù)41講解

核酸Nucleicaciddetectiontechnology核酸檢測技術(shù)第二節(jié)

轉(zhuǎn)錄與逆轉(zhuǎn)錄成熟的RNA分子DNA轉(zhuǎn)錄RNA前體加工DNA指導(dǎo)下RNA的合成RNA的轉(zhuǎn)錄后加工一、轉(zhuǎn)錄（DNA指導(dǎo)下RNA的合成）（一）概念轉(zhuǎn)錄：DNA指導(dǎo)下RNA的合成。以DNA為摸板，4種核糖核苷酸（NTP）為底物，在RNA聚合酶的作用下，按照堿基互補規(guī)律，合成RNA鏈的過程。轉(zhuǎn)錄的不對稱性

與轉(zhuǎn)錄出的RNA順序相同的一條鏈（僅T代替U）編碼鏈（codingstrand，+鏈）轉(zhuǎn)錄時，DNA雙鏈不是同時作為模板，而是在一定條件下，只有一條鏈（或其上某些區(qū)域）可作為轉(zhuǎn)錄的模板。

為RNA提供轉(zhuǎn)錄模板的鏈。

模板鏈（templatestrand，-

鏈）編碼鏈（正鏈）模板鏈（負鏈）編碼鏈（正鏈）模板鏈（負鏈）不是所有基因的編碼鏈都位于DNA分子的同一條鏈上。ABCD編碼鏈基因的轉(zhuǎn)錄是有選擇性的。-并不是全部DNA都必須轉(zhuǎn)錄-根據(jù)細胞實際需求，特定的基因“開放”或“關(guān)閉”，具復(fù)雜的調(diào)控機制。一、轉(zhuǎn)錄（DNA指導(dǎo)下RNA的合成）RNA的轉(zhuǎn)錄起始于DNA模板的一個特定位點，并在另一位點處終止，此轉(zhuǎn)錄區(qū)域稱為轉(zhuǎn)錄單位。真核生物例：mRNA編碼的轉(zhuǎn)錄單位原核生物轉(zhuǎn)錄單位（單順反子）（1個基因）轉(zhuǎn)錄mRNA1種蛋白質(zhì)翻譯轉(zhuǎn)錄單位（多順反子）（多個基因）轉(zhuǎn)錄mRNA多種蛋白質(zhì)翻譯（二）轉(zhuǎn)錄單位一、轉(zhuǎn)錄（DNA指導(dǎo)下RNA的合成）（三）RNA聚合酶：大腸桿菌的RNA聚合酶全酶由5個亞基α2ββσ組成，五個亞基的功能分別為：α亞基：具體功能不詳。β亞基：含催化部位，起催化作用，催化形成磷酸二酯鍵。β’亞基：與DNA模板結(jié)合功能。σ亞基：識別起始位點。大腸桿菌RNA聚合酶全酶示意圖真核細胞的RNA聚合酶酶類分布產(chǎn)物α-鵝膏蕈堿對酶的作用I核仁rRNA5.8SrRNA18SrRNA28SrRNA不抑制Ⅱ核質(zhì)mRNAtRNA低濃度抑制Ⅲ核質(zhì)5SrRNA高濃度抑制一、轉(zhuǎn)錄（DNA指導(dǎo)下RNA的合成）RNA聚合酶的特點1、反應(yīng)底物：NTP，DNA為模板、Mg2+促進聚合反應(yīng)。RNA聚合酶不需要引物，合成方向5

3。2、利福平抑制原核生物RNA聚合酶活性；α-鵝膏蕈堿抑制真核生物RNA聚合酶活性。一、轉(zhuǎn)錄（DNA指導(dǎo)下RNA的合成）（四）、RNA的轉(zhuǎn)錄過程：（以大腸桿菌為例）轉(zhuǎn)錄起始鏈的延伸轉(zhuǎn)錄終止RNA的合成不需要引物。1.轉(zhuǎn)錄起始指RNA聚合酶識別、結(jié)合和開始轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列。啟動子-35序列提供了RNA聚合酶全酶識別的信號；-10序列是酶的緊密結(jié)合位點（富含AT堿基，利于雙鏈打開）；第三部分是RNA合成的起始點。啟動子的結(jié)構(gòu)至少由三部分組成AACTGTATATTATTGACATATAAT+1轉(zhuǎn)錄起始點5’3’3’5’－35序列

提供RNA聚合酶全酶識別信號-10序列雙鏈解開區(qū)域DNA序列的書寫方式（編碼鏈）+15

3

轉(zhuǎn)錄起點上游upstream下游downstream轉(zhuǎn)錄單位的起點核苷酸定為+1，起點的左側(cè)為上游，用負的數(shù)碼表示，起點的右側(cè)為下游，即轉(zhuǎn)錄區(qū)。RNA聚合酶全酶掃描解鏈區(qū)，找到起始點，然后結(jié)合第一個核苷三磷酸。加入的第一個核苷三磷酸常是GTP或ATP，很少是CTP，不用UTP。所形成的啟動子、全酶和核苷三磷酸復(fù)合物稱為三元起始復(fù)合物，第一個核苷三磷酸一旦摻入到轉(zhuǎn)錄起始點，σ亞基就會被釋放脫離核心酶。

E-35-10pppG或pppA5‘5‘3‘3‘模板鏈因子僅與起始有關(guān)，RNA的合成一旦開始，便被釋放2.RNA鏈的延伸DNA分子和酶分子發(fā)生構(gòu)象的變化，核心酶與DNA結(jié)合比較松弛，可沿DNA模板移動，并按模板順序選擇下一個核苷酸，將核苷三磷酸加到生長的RNA鏈的3’-OH端，催化形成磷酸二酯鍵。轉(zhuǎn)錄延伸方向從5’

3’在DNA分子上（基因末端）提供轉(zhuǎn)錄停止信號的DNA序列稱為終止子（terminators),它能使RNA聚合酶停止合成RNA并釋放出RNA。3.轉(zhuǎn)錄終止原核生物中RNA的轉(zhuǎn)錄過程模板的識別轉(zhuǎn)錄的起始轉(zhuǎn)錄的延伸轉(zhuǎn)錄的終止3

5

35

3

5

一、轉(zhuǎn)錄（DNA指導(dǎo)下RNA的合成）（五）、真核生物的轉(zhuǎn)錄作用真核生物的轉(zhuǎn)錄與原核生物轉(zhuǎn)錄比較，主要區(qū)別：RNA聚合酶不同啟動子不同轉(zhuǎn)錄后RNA加工修飾不同一、轉(zhuǎn)錄（DNA指導(dǎo)下RNA的合成）（六）、RNA的轉(zhuǎn)錄后加工在細胞內(nèi)，由RNA聚合酶合成的原初轉(zhuǎn)錄物（primarytranscript）往往需要一系列的變化，包括鏈的裂解、5

和3

末端的切除和特殊結(jié)構(gòu)的形成、核苷的修飾、以及拼接和編輯等過程，才轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒斓腞NA分子。此過程總稱為RNA的成熟或稱為RNA的轉(zhuǎn)錄后加工。原核生物的mRNA轉(zhuǎn)錄后一般不需要加工，轉(zhuǎn)錄的同時即進行翻譯。真核生物mRNA需要進一步進行加工修飾轉(zhuǎn)化為成熟的mRNA。加工包括：（1）mRNA前體的剪接，把內(nèi)含子（DNA上非編碼序列）轉(zhuǎn)錄序列剪掉，把外顯子（DNA上的編碼序列）轉(zhuǎn)錄序列拼接上（真核生物一般為不連續(xù)基因）。（2）3’端添加polyA“尾巴”；（3）5’端連接“帽子”結(jié)構(gòu)；（4）分子內(nèi)部的核苷酸甲基化修飾。1、mRNA前體的加工原核與真核生物的tRNA轉(zhuǎn)錄后都需要加工。包括：（1）由核酸內(nèi)切酶切除前體上3

和5

端上多余的核苷酸；（2）由核酸外切酶逐個在3

切去附加序列，進行修剪。（3）3’端添加CCAOH序列，由核苷酰轉(zhuǎn)移酶催化。（接受活化AA）（4）核苷的一些特定的堿基和戊糖進行修飾。2.tRNA前體的加工原核與真核生物的rRNA轉(zhuǎn)錄后也都需要進行加工。原核：剛轉(zhuǎn)錄的rRNA為30S，先在特定的堿基上進行甲基化修飾，然后逐步裂解，最后形成5sRNA、16sRNA、23sRNA。真核：與原核生物相似，但甲基化程度比原核生物高。剛轉(zhuǎn)錄的rRNA為45S，最后形成5.8srRNA、18srRNA、28srRNA。3.rRNA前體的加工二、逆轉(zhuǎn)錄（一）、定義以RNA為模板，按照RNA中的核苷酸順序合成DNA。二、逆轉(zhuǎn)錄（二）、逆轉(zhuǎn)錄酶1970年從致癌RNA病毒中發(fā)現(xiàn)的逆轉(zhuǎn)錄酶。具有三種功能：依賴于RNA的DNA聚合