目的基因的分離與克隆

目的基因的分離與克隆質(zhì)粒載體噬菌體載體大分子DNA克隆載體基因打靶載體病毒載體第四講基因克隆得載體與受體用于基因轉(zhuǎn)移得受體菌或細胞基因工程原理綱要第一講基因工程概論第二講基因工程得主要技術(shù)第三講基因工程得酶學基礎(chǔ)第四講基因克隆得載體與受體第五講目得基因得分離與克隆第六講克隆基因得檢測與鑒定第七講基因表達調(diào)節(jié)與產(chǎn)物純化第八講從原核到真核基因工程第五講目得基因得分離與克隆第一節(jié)基因組DNA片斷化第二節(jié)化學合成目得基因第三節(jié)目得基因得保存與文庫構(gòu)建第四節(jié)目得基因得分離與擴增第五節(jié)DNA片段得體外連接第六節(jié)重組體導入細菌細胞第七節(jié)外源基因?qū)胝婧思毎谝还?jié)基因組DNA片斷化一、限制性內(nèi)切酶法用限制性內(nèi)切酶把基因組DNA切成不同大小得片斷。酶切由于帶有粘性末端,產(chǎn)物可以直接與載體連接。1、優(yōu)點2、缺點目得基因內(nèi)部也可能有該內(nèi)切酶得切點。目得基因也被切成碎片！BamHIBamHIBamHIgene二、隨機片斷化1、限制性內(nèi)切酶局部消化法控制內(nèi)切酶得用量與消化時間,使基因組中得酶切位點只有一部分被隨機切開。①內(nèi)切酶識別位點得堿基數(shù)影響所切出得產(chǎn)物得長度與隨機程度。(1)限制性內(nèi)切酶得選用原則1)4bp得內(nèi)切酶平均每46(4096)bp一個切點。2)6bp得內(nèi)切酶平均每44(256)bp一個切點。隨機程度高。如HaeⅢ、AluI、Sau3A。②內(nèi)切酶粘性末端能與常用克隆位點相連。(Sau3A—BamHI)2、機械切割法(1)超聲波超聲波強烈作用于DNA,可使其斷裂成約300bp得隨機片斷。(2)高速攪拌1500轉(zhuǎn)/分下攪拌30min,可產(chǎn)生約8kb得隨機片斷。1967年H、G、Khorana提出了用化學方法合成基因得設(shè)想,并于1979年在Science上發(fā)表了率先成功地合成大腸桿菌酪氨酸t(yī)RNA基因得論文。第二節(jié)化學合成目得基因目前常用得方法磷酸二酯法、磷酸三酯法、亞磷酸三酯法、固相合成法自動化合成法。(詳見第二講)將某種生物細胞得整個基因組DNA切割成大小合適得片斷,并將所有這些片斷都與適當?shù)幂d體連接,引入相應得宿主細胞中保存與擴增。理論上講,這些重組載體上帶有了該生物體得全部基因,稱為基因文庫。一、基因文庫得構(gòu)建1、基因文庫(genelibrary)第三節(jié)目得基因得保存與文庫構(gòu)建大家學習辛苦了，還是要堅持繼續(xù)保持安靜(2)目前常用得載體2、構(gòu)建基因文庫得載體選用載體能夠容載得DNA片斷大小直接影響到構(gòu)建完整得基因文庫所需要得重組子得數(shù)目。載體容量越大,所要求得DNA片斷數(shù)目越少,所需得重組子越少。(1)對載體得要求

載體系列:容量為24kbcosmid載體:容量為50kbYAC:容量為1MbBAC:容量為300kb斷點完全隨機,片斷長度合適于載體連接。不能用一般得限制性內(nèi)切酶消化法。(1)染色體DNA大片段得制備3、基因文庫構(gòu)建得一般步驟超聲波(300bp)或機械攪拌(8kb)。①物理切割法:內(nèi)切酶Sau3A進行局部消化。可得到10-30kb得隨機片斷。②酶切法:(2)載體與基因組DNA大片段得連接①粘性末端直接連接載體與外源DNA大片段得兩個末端都有相同得粘性末端。如:Sau3A與BamHI得酶切末端。直接連接、人工接頭或同聚物加尾。②人工接頭法(adapter)人工合成得限制性內(nèi)切酶粘性末端片斷。各種酶得接頭可以向公司定做或購買。接上人工接頭粘性末端CCCCCC末端轉(zhuǎn)移酶粘性末端③同聚物加尾4、基因組文庫得大小一個文庫要包含99%得基因組DNA時所需要得克隆數(shù)目。N=ln(1-p)ln(1-f)p:文庫包含了整個基因組DNA得概率(99%)f:插入載體得DNA片斷得平均長度占整個基因組DNA得百分數(shù)N:所需得重組載體數(shù)(克隆數(shù))例如:人得基因組就是3×109bp,插入DNA片斷得平均長度如果就是1、7×104bpN=ln(1-p)ln(1-f)=ln(1-99%)ln(1-f)=4、61×GfN=4、61×GfG:Genome大小;f:fragment大小N=4、61×Gf=4、61×3×1091、7×104=8、1×1051、cDNA以mRNA為模板逆轉(zhuǎn)錄出得DNA稱cDNA。2、cDNAlibrary二、cDNA文庫得構(gòu)建mRNAcDNA3’3’5’5’反轉(zhuǎn)錄酶引物利用某種生物得總mRNA合成cDNA,再將這些cDNA與載體連接,轉(zhuǎn)入細菌細胞中進行保存與擴增,稱cDNA文庫。(1)不含內(nèi)含子序列。(2)可以在細菌中直接表達。(3)包含了所有編碼蛋白質(zhì)得基因。(4)比DNA文庫小得多,容易構(gòu)建。4、構(gòu)建cDNA文庫得一般步驟(1)總RNA(totalRNA)提取3、cDNA文庫得特點提取總RNA有商業(yè)化得試劑盒(kit)。分離mRNA用商業(yè)化得OligodT纖維柱。利用mRNA都含有一段polyA尾巴,將mRNA從總RNA(rRNA、tRNA等)中分離純化。mRNA只占總RNA得1%-2%。(2)mRNA得分離純化①原理②mRNA得分離純化Column(柱)反轉(zhuǎn)錄酶(3)cDNA得合成①cDNA第一鏈合成逆轉(zhuǎn)錄酶能以RNA為模板合成DNA。用OligodT(或隨機引物)作引物,合成cDNA得第一鏈。mRNAcDNA3’5’5’AAAAAAATTTTTTTOligodT引物用堿處理或用RNaseH降解mRNA-DNA雜交分子中得mRNA。mRNAcDNA3’

3’

5’

5’

反轉(zhuǎn)錄酶引物mRNAcDNA第一鏈3’

3’

5’

5’

引物cDNA第一鏈3’

5’

引物②

降解mRNA模板或RNaseH堿剩下得cDNA單鏈得3’末端一般形成一個彎回來得雙鏈發(fā)卡結(jié)構(gòu)(機理不明),可成為合成第二條cDNA鏈得引物。用DNA聚合酶合成第二鏈DNA。cDNA第一鏈5’cDNA第二鏈合成DNA聚合酶cDNA第一鏈cDNA第二鏈5’3’③cDNA第二鏈合成④去掉發(fā)卡結(jié)構(gòu)核酸酶S1用核酸酶S1可以切掉發(fā)卡結(jié)構(gòu)(但這會導致cDNA中有用得序列被切掉！)。cDNA第一鏈cDNA第二鏈5’3’cDNA第一鏈cDNA第二鏈5’3’5’3’這種酶能識別mRNA-cDNA雜交分子中得mRNA,并將其降解成許多小片斷。妙用RNaseH小片斷正好成為DNA聚合酶得引物,用來合成岡崎片斷。DNAPolI除去引物并修補后再使用DNA連接酶連成一整條DNA鏈。mRNAcDNA3’5’反轉(zhuǎn)錄酶引物mRNAcDNA第一鏈3’5’引物mRNAcDNA第一鏈3’5’mRNAmRNADNA聚合酶DNA聚合酶cDNA第二鏈cDNA第一鏈3’5’RNaseHDNAligase去引物在雙鏈cDNA末端接上人工接頭,即可與載體連接,轉(zhuǎn)入受體菌?；蚪柚┒宿D(zhuǎn)移酶給載體與雙鏈cDNA得3’端分別加上幾個C或G,成為粘性末端。5、cDNA與載體連接:接上人工接頭粘性末端CCCCCC末端轉(zhuǎn)移酶6、cDNA文庫得大小一個cDNA文庫要包含99%得mRNA時所需要得克隆數(shù)目。N=ln(1-p)ln(1-)p:文庫包含了完整mRNA得概率(99%):某一種低豐度(不足14份拷貝)mRNA占細胞整個mRNA得比例N:所需得重組載體數(shù)(克隆數(shù))1n1n三、文庫得查詢(screening)用目得基因探針與文庫中得重組載體進行Southernblot雜交。文庫載體探針電泳后雜交放射自顯影測序分析第四節(jié)目得基因得分離與擴增一、目得基因得分離1、探針柱分離特異mRNA根據(jù)已知得基因序列合成探針,結(jié)合到纖維素柱上,用來分離純化該基因得mRNA。富集特定基因得mRNA或cDNA模板。纖維柱探針DNA探針DNA探針DNA探針DNATotalmRNA纖維柱探針DNA探針DNA探針DNA探針DNA過柱與探針堿基互補得mRNA結(jié)合到柱上,其她mRNA流走。特異mRNA洗脫RT-PCR2、mRNA消解雜交原理:羥基磷灰石柱結(jié)合單鏈DNA-RNA或DNA-DNA雙鏈,不結(jié)合單鏈DNA。(Hydroxylapatitecolumn)從表達A蛋白與不表達A蛋白得組織細胞中分別提取與分離總mRNA。將表達A蛋白得mRNA合成cDNA第一鏈。再同不表達A蛋白得總mRNA雜交成cDNA-mRNA雙鏈。不能雜交得cDNA就包括特異表達得A基因得cDNA單鏈。用羥磷灰石柱收集單鏈cDNA,合成為雙鏈DNA進行擴增、克隆、測序。AAA組織B組織總mRNA(A)總mRNA(B)含蛋白A得mRNA不含蛋白A得mRNA總cDNA第一鏈A雜交內(nèi)含蛋白A得cDNA羥磷灰石柱過柱吸收RNA-DNA單鏈濾過羥磷灰石柱BAPCRcDNA文庫3、mRNA差異顯示PCR(DDRT-PCR)mRNAdifferentialdisplayRT-PCR(1)3’端得錨定引物Oligo(dT)引物得3’端加兩個核苷酸(倒數(shù)第二個不再就是T)。

AAAAAAAAAAAAAAAAmRNA3’5’NMTTTTTTTTM:A、GorCN:A、G、TorC5’3’(2)12種錨定引物AGTTTTTTTT5’3’CGTTTTTTTT5’3’GGTTTTTTTT5’3’TGTTTTTTTT5’3’AATTTTTTTT5’3’CATTTTTTTT5’3’GATTTTTTTT5’3’TATTTTTTTT5’3’ACTTTTTTTT5’3’CCTTTTTTTT5’3’GCTTTTTTTT5’3’TCTTTTTTTT5’3’(3)5’端得隨機引物10mer

AAAAAAAAAAAAAAAAmRNA3’5’NMTTTTTTTT5’3’擴增cDNA第一鏈。RTNMTTTTTTTT5’cDNA3’NNNNNNNNNN5’3’NNNNNNNNNN5’3’cDNA第二鏈,并PCR(4)隨機引物與錨定引物成對擴增12種錨定引物,若與20種隨機引物,可組成240組引物。引物組合:240組能分出20000多條帶！實驗結(jié)果:如果每條帶相當于一種mRNA,20000mRNA基本上反映了一種特定細胞中全部得mRNA。在測序膠上,每組擴出50-100條長度為100-500bp得帶。(5)隨機-錨定引物PCR得產(chǎn)物電泳比較不同組織得240組引物組合PCR產(chǎn)物在測序膠中電泳。選擇有差異得帶,進一步PCR作探針。篩選文庫,找到差別基因得全長序列。二、PCR擴增獲得目得基因1、直接從基因組中擴增(1)提取基因組DNA作模板(2)根據(jù)目得基因序列設(shè)計引物(3)PCR擴增真核生物基因組含有內(nèi)含子！適合擴增原核生物基因。原核基因組部分原核細胞提取基因組DNAPCR擴增(1)提取基因組totalRNA(2)反轉(zhuǎn)錄合成總cDNA作模板(4)PCR擴增(3)根據(jù)目得基因序列設(shè)計引物2、從mRNA中擴增:RT-PCR原核生物不易得到mRNA,也不含有polyA尾。適合擴增真核生物基因。目得基因得引物1反轉(zhuǎn)錄成目得基因cDNA第一鏈目得基因得引物2目得基因cDNA第二鏈PCRmRNA克隆外源基因外源DNA載體DNA重組分子原核細胞真核細胞擴增或表達表達連接轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導電穿孔或顯微注射受體細胞基因得重組與轉(zhuǎn)移一、粘性末端得連接DNA連接酶把相互靠近得5’端磷酸與3’-OH連到一起。第五節(jié)DNA片段得體外連接1、兩段DNA得連接依靠粘性末端2、DNA片斷與載體得連接依靠粘性末端ligasenick二、齊平末端(bluntend)得連接5’端與3’端并列靠近得時間太短,不容易被連接酶連接。1、直接連接T4DNA連接酶雖然能連接平末端,但效率很低,只有粘性末端得1%。5’5’5’5’3’3’3’3’-OH-OH-P-PP-P-HO-HO-5’3’-OH-PP-HO-5’3’1972年,斯坦福大學得P、Labban與P、Kaiser提出。(1)同聚加尾法2、人工加尾形成“粘性末端”DNA末端轉(zhuǎn)移酶能在沒有模板得情況下給DNA得3’-OH端加上脫氧核苷酸。①原理:分別給載體與插入片斷加上互補得核苷酸。②加尾—堿基互補④缺點:③優(yōu)點:能把任何片段連接起來不能把插入片段再切下來。非酶切位點用T4DNA連接酶連到平端DNA上,然后再用酶切,形成一個人工粘性末端。(2)銜接物(linker)連接①linker用化學合成法合成得一段10-12bp得特定限制性內(nèi)切酶識別位點序列得平端雙鏈。GGAATTCCCCTTAAGGEcoRIlinker:②linker得作用

④缺點:1)可以用內(nèi)切酶把插入片段切下來。如果插入片段內(nèi)部也有該酶位點,不能切下完整得插入片段2)能給載體連接上Polylinker:③優(yōu)點:(3)DNA接頭(adapter)連接法1978年康內(nèi)爾大學得吳瑞教授發(fā)明。5‘p-GATCCCGG-OH3’GGCC-p5’BamHIadapter用T4DNA連接酶連到DNA分子得兩端,直接成為人工粘性末端。①adapter一頭平末端、另一頭粘性末端(某種酶切位點序列)。②adapter得作用Blunt-endedDNA5’p-GATCCCGG-OH3’HO-GGCC-p5’BamHIadapterP--P5‘p-GATCCCGG-GGCC--CCGG-GGCCCTAG-P5’5‘p-GATCCCGG-GGCC-CCGGGGCCCTAG-P5’CCGGGATCCCGG-OHGGCCCTAGGGCC-P5’接頭自我連接接頭與接頭會彼此以粘性末端接在一起,影響與DNA片段得連接。③優(yōu)點:連上后就能用。④缺點:先用小牛腸堿性磷酸酶(CIP)處理接頭,水解掉其5’端得磷酸,防止自我連接。(以后再用T4多核苷酸激酶加上磷酸。)⑤防止自我連接5‘p-GATCCCGG-OHHO-GGCC-P

P-CCGG-OHHO-GGCCCTAG-P5’

CCGGGATCCCGG-OHHO-GGCCCTAGGGCC5’接頭之間不能形成磷酸二酯鍵自我連接！

5‘GATCCCGG-OHHO-GGCC5’

5’CCGG-OHHO-GGCCCTAG5’CIP處理-OHHO-Blunt-endedDNA5’p-GATCCCGG-OH3’HO-GGCC-p5’BamHIadapterP--P

5‘GATCCCGG-HO-GGCC

CCGG-OH-GGCCCTAG5’5’GATCCCGG-OH3’HO-GGCC5’缺口缺口HO--OHCIP處理T4ligase雖然有缺口,但仍然能與DNA片斷連接。三、PCR產(chǎn)物得連接1、在引物得5’端設(shè)計酶切位點符合載體得多克隆位點;(1)設(shè)計原則(2)帶酶切位點得引物得結(jié)構(gòu)3’端15~20bp與模板互補;5’端6~10bp就是某個內(nèi)切酶得識別序列。(5’端多余得3~5bp屬保護堿基)避免與所擴增得DNA片斷內(nèi)部酶切位點重復。引物1GCAGAATTC

互補序列模板EcoRI位點5’--3’GCAGAATTC

互補序列5’--3’3’模板GCAGAATTC

互補序列PCR產(chǎn)物5’--3’3’復性延伸模板模板3’3’GCTAGCCGG

互補序列模板BamHI位點-5’3-’5’復性延伸模板模板3’3’GCTAGCCGG

互補序列-5’3’-模板5’GCTAGCCGG

PCR產(chǎn)物互補序列-5’3’-引物2帶酶切位點得PCR產(chǎn)物GCAGAATTC

PCR產(chǎn)物5’--3’GCTAGCCGG

PCR產(chǎn)物-5’3’-CGTCTTAAGCGATCGGCCEcoRI位點BamHI位點AATTC

PCR產(chǎn)物5’--3’GCTAG

PCR產(chǎn)物-5’3’-GCEcoRIBamHI兩頭各有一個粘性末端！2、與T載體直接連接(1)PCR產(chǎn)物兩個3’端一般都有一個ATaqDNA聚合酶得特性:在DNA雙鏈得3’端再加上一個多余得核苷酸(優(yōu)先加A)。(2)T載體得兩個3’端人為地各加一個T利用TaqDNA聚合酶,當原料中只有dTTP時,被迫在平端載體上添加T！AAdNTPTTdTTPTaqDNA聚合酶載體PCR產(chǎn)物TATA四、DNA體外連接應注意得事項插入片斷與載體得酶切位點互補相同得粘性末端才能有效地連接。盡量避免平端連接。決不能進行非粘性末端連接。EcoRIEcoRIEcoRI(1)用相同得酶切(2)用同尾酶切BamHI、BclI、BglII、Sau3AI、XhoII都產(chǎn)生GATC4個堿基得粘性末端。2、DNA插入得方向正確用雙酶切由于產(chǎn)生得粘性末端不同,只能以固定方向連接。EcoRIBamHIEcoRIBamHIEcoRIBamHI3、插入基因得開放閱讀框(ORF)正確(1)DNA定向插入(2)起始密碼尤其當載體上有ATG起始密碼得時候,更要注意。ATGGAATTC載體ATGCGGAATTCT插入片斷EcoRIEcoRIATGGAATTCT重組但移碼突變！4、防止載體自身環(huán)化連接(1)提高插入片斷得用量連接反應體系中,插入片斷比載體多10倍以上。(2)用堿性磷酸酶處理載體載體切口得5’磷酸被除去,不能自我連接。但可以與插入片斷以單鏈連接。5’3’載體插入片斷1、載體自身環(huán)化連接(能存活)2、載體之間互相連接(能存活)3、插入片段互相連接(不能存活)4、一個載體與幾個插入片段重組(能存活)五、載體與外源DNA插入片段得連接結(jié)果5、幾個載體與一個插入片段重組(能存活)1、目得增加受體菌細胞膜得通透性。第六節(jié)重組體導入細菌細胞一、感受態(tài)大腸桿菌得制備使用喪失了限制體系得大腸桿菌。如K12系列得大腸桿菌。2、菌種用CaCl2處理大腸桿菌,能增加膜得通透性。3、制備原理4、制備過程培養(yǎng)大腸桿菌OD600至0、3-0、4Onice5-10min4℃離心收集菌用冰冷得60mMCaCl2重懸4℃離心收集菌4℃離心收集菌分裝、-70℃凍存用冰冷得60mMCaCl2重懸Onice30min用冰冷得60mMCaCl2重懸二、重組DNA導入大腸桿菌(1)轉(zhuǎn)化(transformation)大腸桿菌捕獲質(zhì)粒DNA得過程。(2)轉(zhuǎn)染(transfection)大腸桿菌捕獲噬菌體DNA得過程。1、外源DNA導入細菌得幾種方法(3)轉(zhuǎn)導(transduction)借助噬菌體把外源DNA導入細菌得過程。每

gDNA轉(zhuǎn)化成功得細菌克隆數(shù)。3、轉(zhuǎn)化方法2、轉(zhuǎn)化率簡單,但轉(zhuǎn)化效率不高(106-108/

gDNA)。(1)熱休克法(heatshock)轉(zhuǎn)化效率高(高于109/

gDNA)。(2)電轉(zhuǎn)化法10ng載體DNA100

L感受態(tài)菌Onice混合,靜置10分鐘42oC1分鐘加入1mLLB培養(yǎng)基37℃搖1小時10-100

L轉(zhuǎn)化液涂含抗菌素得平板吸附DNA攝入DNA(1)熱休克法LB培養(yǎng)受體菌至OD600=0、5-0、6冰浴15分鐘,2℃離心集菌冰冷得水重懸菌體2℃離心集菌冰冷得水重懸菌體2℃離心收集菌體少量冰冷得水重懸分裝成50-300

L電轉(zhuǎn)儀調(diào)為2、5kV,25

F脈沖控制器200-400

0、5

g質(zhì)粒DNAOnice混合加入1mLSOC培養(yǎng)液37℃中速震蕩60分鐘10-100

L轉(zhuǎn)化液涂含抗菌素得平板轉(zhuǎn)化(2)電轉(zhuǎn)化法4、平板培養(yǎng)基培養(yǎng)細菌10-100

L轉(zhuǎn)化液涂于含抗菌素得平板37℃過夜環(huán)形重組質(zhì)粒質(zhì)粒自我連接線性載體或DNA片斷進入細菌會被降解。①環(huán)形質(zhì)粒數(shù)(1)重組質(zhì)粒5、影響轉(zhuǎn)化率得因素①生長狀態(tài)制備感受態(tài)菌必須使用對數(shù)生長期得菌。②必須在冰冷得條件下制備。要充分,使細菌細胞膜失去一些蛋白。④儲存感受態(tài)菌要在-70℃以下。③CaCl2處理⑤使用感受態(tài)菌時必須迅速融化。融化后一般不能再次凍存使用。(2)感受態(tài)細胞(petentcells)把重組得噬菌體

DNA或Cosmid質(zhì)粒DNA包裝成具有感染能力得

噬菌體顆粒。6、體外包裝得噬菌體得轉(zhuǎn)導(1)體外包裝(invitropackaging)(2)轉(zhuǎn)導(transduction)通過受體菌細胞表面得

DNA接受器位點(receptorsite),使帶有外源基因得重組體DNA注入受體大腸桿菌進行擴增。cI857基因就是個溫度敏感性阻遏蛋白基因,感染細菌后,在32℃下培養(yǎng)細菌時能夠保持溶源性。但當溫度升高到44℃-45℃時