DB22-T3375-2022-高血壓用藥指導基因檢測實時熒光定量PCR法-吉林省

ICS11.020DB22CCSC05吉林省地方標準DB22/T3375—2022高血壓用藥指導基因檢測實時熒光定量PCR法Real-timefluorescentquantitativePCRforthedetectionofhypertensionmedicationguidelinesgenetictestingtechnicalguidelines吉林省市場監(jiān)督管理廳發(fā)布DB22/T3375—2022前言本文件按照GB/T1.1-2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件中的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔識別專利的責任。本文件由吉林省衛(wèi)生健康委員會提出并歸口。本文件起草單位：吉林大學。本文件主要起草人：姜艷芳、胡馨元、郝思嘉、胡欣彤、何佳雪、劉勇、劉思文、張鵬、鄒紅雁、王多、肖云萍。IDB22/T3375—2022高血壓用藥指導基因檢測實時熒光定量PCR法1范圍本文件規(guī)定了高血壓用藥基因檢測原理、生物安全要求、材料與試劑、樣本、檢測、數(shù)據(jù)處理、質(zhì)量控制、結(jié)果判定與表述、檢測報告、廢棄物處理與防止污染的措施。本文件適用于高血壓用藥基因檢測。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB19489實驗室生物安全通用要求WS/T230臨床診斷中聚合酶鏈式反應（PCR）技術(shù)的應用衛(wèi)醫(yī)發(fā)〔2006〕73號醫(yī)療機構(gòu)臨床實驗室管理辦法國務院令第588號醫(yī)療廢物管理條例下列術(shù)語和定義適用于本文件。deoxyribonucleicacid，DNA核酸的一種，是由特殊序列的脫氧核糖核苷酸單元（dNTP）構(gòu)成的多聚核苷酸，起攜帶遺傳信息的功能。DNA為一種雙鏈分子，通過核苷酸堿基對間的氫鍵維系。DNA包含的4種核苷酸包括：腺嘌呤（A）、鳥嘌呤（G）、胸腺嘧啶（T）和胞嘧啶（G）。人類存在兩種類型的DNA：來自染色體的基因組DNA（gDNA）藥物基因組學pharmaeogenomies，PGx藥理學或基因組學的一個分支，是在遺傳學、基因組學、遺傳藥物學基礎上發(fā)展起來的，是研究基因組或基因變異對藥物在人體內(nèi)吸收、代謝、療效及不良反應的影響，利用基因組學信息解答不同個體對同一藥物反應上存在差異的原因的一門學科。聚合酶鏈式反應法polymerasechainreaction，PCR一種分子生物學技術(shù),用于放大特定的DNA片段.可看作生物體外的特殊DNA復制。3.41DB22/T3375—2022在DNA擴增反應中加入熒光基團，以熒光信號累積實時檢測每次PCR循環(huán)后產(chǎn)物總量，進而對待測樣品中的目的序列進行定量分析的方法。3.5基因gene遺傳物質(zhì)的最小功能單位，是指具有一定生物學意義的一段DNA。3.6單核苷酸多態(tài)性singlenucleotidepolymorphism，SNP由單個核苷酸—A、T、C或G的改變而引起的DNA序列的改變，造成包括人類在內(nèi)的物種之間染色體基因組的多樣性。3.7閾值threshold計算機根據(jù)基線的變化所任意選擇的，是指3到15個循環(huán)的基線熒光信號均值標準差的10倍。3.8內(nèi)標基因endogenousreferencegene在反應體系中加入的一段在所有細胞類型都正常表達的基因，不受實驗處理的影響，可以正常表達。3.9Ct值cyclethreshold，Ct熒光定量PCR反應的熒光強度超過設定的閾值所需的循環(huán)數(shù)。Ct值位于PCR反應的指數(shù)期初期，與標本中待測核酸分子的原始拷貝數(shù)呈反比，即樣本中原始拷貝數(shù)越多，熒光強度升高的就越多，相應的Ct值就越小。EDTA:四元羧酸乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid)。PCR:聚合酶鏈式反應(polymerasechainreaction)。DNA:脫氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid)。SNP:單個核苷酸多態(tài)性（singlenucleotidepolymorphism）采用細胞裂解方法從外周血細胞中將基因組DNA提取出來后，針對人類CYP2D6、CYP2C9、ADRB1、AGTR1、ACE、CYP3A5、NPPA基因各個SNP位點的不同多態(tài)性，基于熒光定量PCR平臺，首先針對SNP位點上下游設計特異性引物，分別針對野生型及突變型位點設計不同熒光基團標記的特異性探針，然后對引物及探針進行科學的配比組合，配置SNP位點檢測體系，通過熒光定量PCR儀對臨床樣本DNA進行PCR擴增，同時收集擴增信號，如果信號為野生型探針信號，那么樣本為純合野生型；如果信號為突變型探針信號，那么樣本為純合突變型；如果信號同時有野生型及突變型探針信號，那么樣本為雜合突變型。高血壓相關(guān)基因參見附錄A。2DB22/T3375—20227材料與試劑7.1儀器與耗材7.1.1II級生物安全柜。7.1.2渦旋混合儀。7.1.3金屬浴或水浴鍋。7.1.4高壓滅菌器。7.1.5微量移液器：10μL、100μL、200μL、1000μL。7.1.6微量帶濾芯吸頭：10μL、100μL、200μL、1000μL。7.1.7醫(yī)用冰箱：2℃～8℃、-20℃、-80℃。7.1.8低溫高速離心機，最高離心力達15000g/min以上。7.1.9低速離心機，最高離心力達3000g/min以上。7.1.10熒光定量PCR儀。7.1.11離心管：200μL、1.5mL、15mL。7.2試劑7.2.1試劑級別：除另有規(guī)定，本方法試驗用水應符合GB/T6682規(guī)定的二級水，所用化學試劑均為分析純。7.2.2DNA提取試劑：對樣本進行DNA提取。7.2.3DNA擴增試劑。7.2.4對照品：弱陽性對照是一段基因型為AGTR11166A、AGTR11166C、ACEI、ACED、ADRB11165G、ADRB11165C、CYP2D6*10C、CYP2D6*10T、CYP2C9*3A、CYP2C9*3C、CYP3A5*3A、CYP3A5*3G、NPPA2338T和NPPA2338C的質(zhì)?；旌弦??？瞻讓φ帐荰ris-HCL緩沖液。7.2.5質(zhì)控品：陰性質(zhì)控樣本可以是無相關(guān)基因的同類樣本和不含任何核酸的水樣本。陽性樣本可以為已確認的CYP2D6、CYP2C9、ADRB1、AGTR1、ACE、CYP3A5、NPPA基因分型樣本或體外構(gòu)建的已含CYP2D6、CYP2C9、ADRB1、AGTR1、ACE、CYP3A5、NPPA基因分型的質(zhì)粒。采血前核對病人姓名、性別、年齡、編號及檢驗項目等。使用含有EDTA抗凝劑的真空采血管采集受檢者靜脈全血樣本2mL，采集后將采血管顛倒混勻數(shù)次，保證抗凝效果，并在抗凝管外部標簽紙上詳細登記好血樣信息，包括住院號或門診號、姓名、性別、采樣日期和時間、樣本類型等。樣本接收記錄表參見附錄B。8.2.1抗凝全血在室溫保存不超過7天，2℃～8℃不超過1個月，-20℃不超過7周，血液樣品反3DB22/T3375—2022實驗室應安排專人接收樣本，接收人在接收樣本時應進行仔細檢查。首先確認送檢樣本的相關(guān)信息是否完全，樣本標識清楚。到達時需要確認樣本使用符合要求的的容器進行采集，有無開蓋，全血樣本量是否達到2mL，樣本接收時送樣人和接收人在樣本接收登記表見附錄B，實行雙簽名制度。8.3.2拒收樣本主要包括以下情況對于不符合要求的樣本應該拒收，并在樣本接收登記表中予以登記。a)申請單信息填寫不完整，不清楚，與樣本標識不符；b)樣本采集容器不符合要求，送檢過程中容器有破損或者開蓋情況；c)全血樣本量少于2mL，血液樣本出現(xiàn)凝血或溶血。8.4檢測8.4.1樣本DNA提取參考血液基因組DNA提取試劑盒說明書進行操作，所提取DNA需測定濃度及純度，要求DNA的A260/280在1.8～2.0之間，-20℃以下保存，避免反復凍融。待測樣本的基因組DNA推薦濃度為5ng/μL～15ng/μL。8.4.2樣本DNA擴增8.4.2.1試劑準備8.4.2.1.1從冰箱中取出試劑盒，平衡至室溫，各組分充分融解混勻。8.4.2.1.2核算當次實驗所需要的反應數(shù)n，按照試劑盒說明裝量將每種反應液分別分裝到n個反應管內(nèi)。8.4.2.1.3PCR反應管轉(zhuǎn)移至樣本準備區(qū)。8.4.2.2.1將待測樣本的基因組DNA、弱陽性對照、空白對照、質(zhì)控品分別加入已裝有PCR反應液的反應管中，即每個待測樣本分別用此PCR反應液進行檢測。8.4.2.2.3將PCR反應管瞬時離心，轉(zhuǎn)移到核酸擴增區(qū)進行上機檢測。若PCR反應管內(nèi)加入模板后遇臨時情況不能立即上機，建議將加好模板的PCR反應管放于2℃～8℃條件暫時保存，并在24小時內(nèi)盡快上機檢測。8.4.2.3.2取樣本準備區(qū)準備好的PCR反應管，放置在儀器樣品槽相應位置。并記錄放置順序。設置儀器擴增相關(guān)參數(shù)，并開始進行PCR擴增，參數(shù)見表1。4DB22/T3375—2022表1儀器擴增相關(guān)參數(shù)AGTR11166A-通道采集熒光信號AGTR1(1166A>C)反應液ACE（I/D）反應液AGTR11166C-通道采集熒光信號ACEI-通道采集熒光信號ACED-通道采集熒光信號ADRB11165G-通道采集熒光信號ADRB1（1165G>C）反應液CYP2D6*10反應液CYP2C9*3反應液ADRB11165C-通道采集熒光信號CYP2D6*1-通道采集熒光信號CYP2D6*10-通道采集熒光信號CYP2C9*1-通道采集熒光信號CYP2C9*3-通道采集熒光信號CYP3A5*1-通道采集熒光信號CYP3A5*3-通道采集熒光信號NPPA2338T通道采集熒光信號NPPA2338C通道采集熒光信號信號采集CYP3A5*3NPPA2338T>C反應液內(nèi)標相應通道按照說明書Ct值判斷，有明顯擴增曲線，說明血液DNA提取完整，PCR擴增過程良好。5DB22/T3375—202211.1質(zhì)控品對照、弱陽性對照、空白對照、內(nèi)標基因滿足10質(zhì)量控制11.2樣本：檢測樣本的反應管中，若通道有信號，內(nèi)標通道信號較低或無信號，此為樣本基因組DNA加入過量，建議將樣本稀釋至合適濃度后進行檢測。結(jié)果判讀見表2。表2結(jié)果判定反應液基因多態(tài)性A/A說明書相應通道參照說明書Ct值參照說明書Ct值參照說明書Ct值參照說明書Ct值參照說明書Ct值參照說明書Ct值參照說明書Ct值參照說明書Ct值參照說明書Ct值參照說明書Ct值參照說明書Ct值參照說明書Ct值參照說明書Ct值參照說明書Ct值參照說明書Ct值參照說明書Ct值參照說明書Ct值參照說明書Ct值參照說明書Ct值參照說明書Ct值參照說明書Ct值AGTR1(1166A>C)A/CC/CI/IACE(I/D)ADRB1(1165G>C)CYP2D6*10I/DD/DG/GG/CC/CCYP2C9*3CYP3A5*36DB22/T3375—202212檢測報告檢測報告包括以下信息：患者信息、送檢樣本信息、接收時間、檢測項目、檢測結(jié)果等應由具備臨床醫(yī)學檢驗技術(shù)資質(zhì)的醫(yī)務人員審核并簽發(fā)，報告模板參見附錄C。13廢棄物處理和防止污染的措施13.1廢棄物的處理應按醫(yī)療廢物管理條例執(zhí)行。13.2污染的預防和控制措施應按WS/T230中執(zhí)行。7DB22/T3375—2022AA附錄A（資料性）高血壓用藥相關(guān)基因A.1CYP2D6基因CYP2D6基因是編碼酶的細胞色素P450家族重要基因之一，CYP2D6是CYP酶家族重要基因，在人22號染色體上，參與了20%～30%藥物的代謝。該基因在人群中具有高度多態(tài)性；不同的CYP2D6等位基因位點導致代謝表型不同，導致代謝酶底物的能力不同。A.2ACYP2C9基因CYP2C9基因是編碼細胞色素P450家族重要基因之一，占肝微粒體P450蛋白總量的20%。目前約有16%的的臨床藥物由CYP2C9負責代謝。這種酶可以代謝許多外源性物質(zhì)，包括苯妥英、甲苯磺丁脲、布洛芬和S-華法林，氯沙坦等藥物。A.3AGTR1基因AGTR1基因位于人染色體3q21～25，該基因編碼1型受體，該受體被認為介導血管緊張素II的主要心血管作用。該基因可能在恢復缺血或梗塞心肌的血流后產(chǎn)生再灌注心律失常中起作用。ACE基因編碼血管緊張素轉(zhuǎn)化酶，位于人染色體17q23.3，并在血管張力的調(diào)節(jié)和血管平滑肌細胞的增生中起重要作用。該基因編碼一種參與血壓調(diào)節(jié)和電解質(zhì)平衡的酶，催化血管緊張素I轉(zhuǎn)化為生理活性肽血管緊張素II。血管緊張素II是一種有效的血管加壓劑和醛固酮刺激肽，可控制血壓和液體電解質(zhì)平衡。因此，編碼的酶會增加血壓，并且是ACE抑制劑的藥物靶點，ACE抑制劑通常用于降低血壓。A.5NPPA基因NPPA基因主要位于人1號染色體上，可編碼心房利鈉肽前體。該基因編碼的蛋白質(zhì)屬于利鈉肽家族。利鈉肽與細胞外液體積和電解質(zhì)穩(wěn)態(tài)的控制有關(guān),該基因的突變與家族性6型心房顫動有關(guān)。CYP3A5基因是編碼細胞色素P450家族重要基因之一。CYP3A5基因位于人體第7號常染色體上，是CYP3A亞家族中的一種。CYP3A5*3位點對硝苯地平有顯著影響。A.7ADRB1基因8DB22/T3375—2022ADRB1基因位于人染色體10q24-q26，編碼β1腎上腺素能受體。腎上腺素能受體是一個典型的鳥嘌呤核苷酸結(jié)合調(diào)節(jié)蛋白偶聯(lián)受體家族，介導了激素腎上腺素和神經(jīng)遞質(zhì)去甲腎上腺素的生理效應。β-1腎上腺