DB22-T3473-2023-牛呼吸道合胞體病病原學(xué)診斷技術(shù)-吉林省

ICS65.020.30DB22CCSB41吉林省地方標(biāo)準(zhǔn)DB22/T3473—2023牛呼吸道合胞體病病原學(xué)診斷技術(shù)Pathogenicdiagnostictechniquesofbovinerespiratorysyncytialdisease吉林省市場(chǎng)監(jiān)督管理廳發(fā)布DB22/T3473—2023前言本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別這些專利的責(zé)任。本文件由吉林省畜牧業(yè)管理局提出并歸口。本文件起草單位：吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院、吉林省畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究院、吉林省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心。本文件主要起草人：肖丹、邵洪澤、曲磊、王楠、任銳、馬曉媛、胡澤宇、曹東陽。IDB22/T3473—2023牛呼吸道合胞體病病原學(xué)診斷技術(shù)1范圍本文件規(guī)定了牛呼吸道合胞體病的臨床診斷、實(shí)驗(yàn)室診斷和綜合判定。本文件適用于牛呼吸道合胞體病的病原學(xué)診斷。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法NY/T541-2016獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范3術(shù)語和定義本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。4縮略語一年四季均可發(fā)生，秋、冬季節(jié)多發(fā)，在惡劣養(yǎng)殖環(huán)境、長(zhǎng)途運(yùn)輸或過早斷奶等應(yīng)激情況下，促進(jìn)該病發(fā)生。牛、羊易感，犢牛最易感。主要傳染源是病畜和帶毒畜。直接接觸和飛沫經(jīng)呼吸道傳播是主要感染途徑。6月齡內(nèi)犢牛常表現(xiàn)急性呼吸道癥狀，體溫升高，呼吸困難或干咳、結(jié)膜炎、眼鼻分泌物增多。青年牛和成年牛多呈隱性感染，無明顯臨床癥狀，部分病牛表現(xiàn)流淚、流涎，流少量漿液性鼻液，輕微咳嗽，偶有發(fā)熱，產(chǎn)奶量下降等癥狀。1DB22/T3473—2023本病呈間質(zhì)性肺水腫，氣管和支氣管炎，表現(xiàn)為粘膜充血，氣管內(nèi)充滿粘稠的粘液，氣管淋巴結(jié)、支氣管淋巴結(jié)、腔淋巴結(jié)的腫大、水腫，病程嚴(yán)重時(shí)出現(xiàn)肺氣腫、胸膜肺炎和皮下積液。5.4結(jié)果判定牛出現(xiàn)上述臨床癥狀和剖檢變化，結(jié)合流行病學(xué)特點(diǎn)，可判定為疑似牛呼吸道合胞體病。6實(shí)驗(yàn)室診斷6.1儀器與設(shè)備6.1.1組織勻漿機(jī)或研磨皿。6.1.2低溫冰箱，-20℃。6.1.36.1.46.1.56.1.66.1.7旋渦振蕩器。高速冷凍離心機(jī)。電子天平。II級(jí)生物安全柜。PCR擴(kuò)增儀。6.1.8水平電泳槽。6.1.9凝膠成像儀。6.1.10實(shí)時(shí)熒光PCR儀。6.1.11微量移液器，0.5μL～10μL，2μL～20μL，20μL～100μL，200μL～1000μL。2DB22/T3473—2023將滅菌的棉拭子蘸取牛鼻腔分泌物放入含青、鏈霉素PBS溶液2mL的采樣管中，加蓋密封保存。肺部組織按照NY/T541-2016中的6.2.2規(guī)定執(zhí)行。6.4樣品處理6.4.1鼻腔分泌物將樣品置于旋渦振蕩器上振蕩混勻，5000r/min、4℃離心15min，取上清液待檢。6.4.2組織樣品取組織樣品約2g，加入4mL含青、鏈霉素PBS溶液，在組織勻漿機(jī)或研磨皿中充分研磨，混勻，3000r/min、4℃離心15min，取上清液待檢。6.5RT-PCR方法6.5.1引物RT-PCR引物序列見表1。表1RT-PCR檢測(cè)用引物引物名稱引物序列產(chǎn)物大小上游引物（F）5'-TGCTATGTGTTGCTGCTTTGGTTA-3'5'–TCTTGATTGCCTCTAATTCCTCTGTAGT-3'660bp下游引物（R）在樣品制備區(qū)將經(jīng)6.4.1或6.4.2處理過的待檢樣品、陽性對(duì)照、陰性對(duì)照按所選取的病毒RNA提取試劑盒說明書進(jìn)行提取。提取的RNA應(yīng)迅速進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，或置于-20℃冰箱備用。在試劑準(zhǔn)備區(qū)，冰浴條件下按照表2分別將除模版RNA以外的各組分加入至0.2mLPCR管，配制反應(yīng)體系。在樣品制備區(qū)，依次將待檢樣品的模板RNA、BRSV陽性對(duì)照和陰性對(duì)照加入配置好的反應(yīng)體系，加完后蓋緊蓋子并做好標(biāo)記。組分一步法RT-PCR反應(yīng)預(yù)混液上游引物（10μmol/L）下游引物（10μmol/L）模板RNA3DB22/T3473—2023在核酸擴(kuò)增區(qū)將PCR管置PCR擴(kuò)增儀上按如下條件擴(kuò)增：a)45℃反轉(zhuǎn)錄10min；b)98℃預(yù)變性2min；c)98℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。6.5.5電泳在產(chǎn)物分析區(qū)將5μL的6×上樣緩沖液加入到RT-PCR產(chǎn)物中，混勻后取8μL加入到使用1×TAE電泳緩沖液配制的1%瓊脂糖凝膠中（含1%溴化乙錠溶液1μL或無毒核酸染料溶液），加DL2000marker作為電泳參照物。調(diào)節(jié)電壓5V/cm，電泳時(shí)間約25min。電泳結(jié)束后，用凝膠成像儀觀察結(jié)果并記錄。6.5.6結(jié)果判定6.5.6.1實(shí)驗(yàn)成立條件：BRSV陽性對(duì)照出現(xiàn)660bp目的條帶，且BRSV陰性對(duì)照無相應(yīng)條帶，實(shí)驗(yàn)成立參見圖B.1。6.5.6.2被檢樣品出現(xiàn)660bp目的條帶，判定為BRSV核酸陽性。6.5.6.3被檢樣品無660bp目的條帶，判定為BRSV核酸陰性。6.6Real-timeRT-PCR方法6.6.1引物與探針引物序列5’-ATTAGCAGCAGGTGATAGATC-3’5’-CCTACTACCTCCTCTAGTTGA-3’5’-FAM-GCCTCACTGCAGTCATTAGGAGAGCCA-BHQ1-3’6.6.3Real-timeRT-PCR反應(yīng)體系配置在試劑準(zhǔn)備區(qū)，冰浴條件下按照表4將除模版RNA以外的各組分加入至0.2mLPCR管，配制Real-timeRT-PCR反應(yīng)體系。在樣品制備區(qū)，依次將待檢樣品的模板RNA、BRSV陽性對(duì)照和陰性對(duì)照加入配置好的反應(yīng)體系，加完后蓋緊蓋子并做好標(biāo)記。4DB22/T3473—2023表4（續(xù)）序號(hào)組分用量(μL)4567探針P（1μmol/L）0.55DEPC水模板RNA總體積5256.6.4Real-timeRT-PCR擴(kuò)增程序在核酸擴(kuò)增曲將PCR管置于熒光定量PCR儀上進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)椋篴)50℃反轉(zhuǎn)錄10min；b)95℃預(yù)變性10min；c)95℃變性15s，60℃退火40s，共40個(gè)循環(huán)。在每一個(gè)循環(huán)的60℃時(shí)收集熒光信號(hào)。6.6.5結(jié)果判定6.6.5.1實(shí)驗(yàn)成立條件：BRSV陽性對(duì)照Ct值≤30，且出現(xiàn)特征性擴(kuò)增曲線，參見圖B.2，BRSV陰性對(duì)照無Ct值，且無特征性擴(kuò)增曲線。6.6.5.2被檢樣品Ct值≤35，且出現(xiàn)特征性擴(kuò)增曲線，判定為BRSV核酸陽性。6.6.5.3被檢樣品無Ct值或Ct值＞40，且無特征性擴(kuò)增曲線，判定為BRSV核酸陰性。6.6.5.4被檢樣品35＜Ct值≤40且出現(xiàn)特征性擴(kuò)增曲線，樣品檢測(cè)結(jié)果判為疑似。應(yīng)重新采樣檢測(cè)，仍為疑似，判定為BRSV核酸陽性。符合5.4且符合6.5或6.6判為牛呼吸道合胞體??；未出現(xiàn)5.4結(jié)果，但符合6.5或6.6結(jié)果判定為牛呼吸道合胞體病毒感染。5DB22/T3473—2023AA附錄A（規(guī)范性）常用試劑的配制A.1pH7.4磷酸鹽緩沖液（PBS）氯化鈉（NaCl）氯化鉀（KCl）磷酸氫二鈉（Na2HPO4）磷酸二氫鉀(KH2PO4)蒸餾水8.00g0.20g1.44g0.24g加至1000mL將上述成分依次溶解，用HCl調(diào)pH至7.4，分裝，121℃、15min高壓滅菌。室溫或4℃冰箱保存。A.2青、鏈霉素貯存溶液取青霉素1000000IU、鏈霉素1000000μg，用滅菌去離子水配成10mL的上述兩種抗生素的貯存液（濃度分別為：青霉素100000IU/mL、鏈霉素100000μg/mL）。分裝小瓶，-20℃保存。取pH7.4磷酸