實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 呼腸孤病毒Ⅲ型檢驗(yàn)方法 編制說(shuō)明

《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物呼腸孤病毒Ⅲ型檢測(cè)方法》GB14926.25修訂編制說(shuō)明根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)2023年國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)復(fù)審修訂計(jì)劃（國(guó)標(biāo)委發(fā)[2023]642025年2月，標(biāo)準(zhǔn)編制組在北京召開(kāi)線下會(huì)議，就標(biāo)準(zhǔn)的編制格式做了統(tǒng)一部依據(jù)工作分工，廣東省生物技術(shù)研究院（廣小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠必須排除的病原項(xiàng)目。1994年，國(guó)家質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布實(shí)施實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)GB14922，第一次以技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)的形式提出實(shí)驗(yàn)動(dòng)的提高起到了非常重要的作用。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)呼腸孤病毒Ⅲ型檢測(cè)方法做確認(rèn)試驗(yàn)。ELISA抗體檢測(cè)因方法穩(wěn)定、高通量、高敏感性而且商品化試劑較成熟，易于操作，仍然是我國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物呼腸歐盟許多實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室都推薦采用抗體檢測(cè)結(jié)合核酸檢測(cè)作為設(shè)施質(zhì)量控制的完整技術(shù)體系。國(guó)內(nèi)一些實(shí)驗(yàn)動(dòng)物檢測(cè)機(jī)構(gòu)也開(kāi)展了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病原量檢測(cè)之外，還可以應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物產(chǎn)品、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物接種物和污染環(huán)境評(píng)價(jià)等，孤病毒Ⅲ型核酸檢測(cè)方法研究。所建立的Reo3核酸檢測(cè)方法與小鼠肝炎病毒1.科學(xué)性原則。在尊重科學(xué)、親身實(shí)踐、調(diào)查研究的基礎(chǔ)上2.可操作性原則。本標(biāo)準(zhǔn)無(wú)論是從樣品采集，處理，RNA抽提，PCR反應(yīng)，均c.新增核酸檢測(cè)方法，包括核酸檢測(cè)原理（見(jiàn)第3六、主要試驗(yàn)或驗(yàn)證的分析、綜述報(bào)告，技度（0.05~0.5μM）進(jìn)行優(yōu)化，以反應(yīng)的前3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)為熒光本底信來(lái)判斷優(yōu)化結(jié)果；采用二溫循環(huán)法對(duì)反應(yīng)的退火溫度表2Reo3實(shí)時(shí)熒光RT-PCR特異性試驗(yàn)編號(hào)樣本平均Ct特異性樣本N-1陰性樣本NotN-2陰性樣本NotN-3陰性樣本NotN-4BHK細(xì)胞對(duì)照NotN-5仙臺(tái)病毒NotN-6小鼠肝炎（MHV）NotN-7小鼠腦脊髓炎病毒（TMEV）NotN-8小鼠肺炎病毒（PVM）NotN-9小鼠諾如病毒（MNV）NotN-10小鼠出血熱病毒（HV）NotN-11淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒（LCMV）NotP1呼腸孤病毒（Reo3）24圖1Reo3實(shí)時(shí)熒光RT-PCR特異性試驗(yàn)6.4敏感性試驗(yàn)將Reo3RNA標(biāo)準(zhǔn)品Easydilution（Takara公司）做10倍系列稀釋，得到結(jié)果可見(jiàn)各梯度之間間隔的Ct值基本相等，無(wú)模板對(duì)照（Notemplatecontrol，2標(biāo)準(zhǔn)品在1×109copies/μL~1×102copies/圖2Reo3實(shí)時(shí)熒光RT-PCR敏感性檢測(cè)結(jié)果1-8依次為1×109copies/μL至1×102copies/μL標(biāo)準(zhǔn)品，9、10為NTC和無(wú)模板對(duì)照。表3標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)應(yīng)Ct值樣品名稱拷貝數(shù)標(biāo)準(zhǔn)品19標(biāo)準(zhǔn)品28標(biāo)準(zhǔn)品37標(biāo)準(zhǔn)品46標(biāo)準(zhǔn)品55標(biāo)準(zhǔn)品64標(biāo)準(zhǔn)品7標(biāo)準(zhǔn)品800只進(jìn)行人工感染小鼠Reo3試驗(yàn)，感染后（0-129d）不同時(shí)間段采集樣本進(jìn)行抗接種后18d抗體陽(yáng)性，之后抗體效價(jià)逐漸升高，在25d抗體稀釋度達(dá)到128表4染小鼠抗Reo-3血清抗體的測(cè)定047 ±±±±±±±±±±±抗體滴度為能檢出陽(yáng)性結(jié)果的最大稀釋倍數(shù)log2數(shù)值。、感染靶器官病毒含量的測(cè)定（圖3）感染早期小鼠以肝(Liver)病毒載量最高,其次是心(Heart)、脾(Spleen)、圖3感染小鼠各內(nèi)臟組織核酸測(cè)定（n=1~3）表5抗體檢測(cè)與核酸檢測(cè)規(guī)律圖樣本采集時(shí)間00/160/1640/38/168/163/3256/6355/56/163/16729/90/243/33/24應(yīng)同時(shí)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。對(duì)2012-2015年送檢的96份SPF級(jí)小鼠盲腸內(nèi)容物進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果檢出0份陽(yáng)性，陽(yáng)性率為0。6.6第三方實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證依據(jù)廣東省生物技術(shù)研究院（原廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所，簡(jiǎn)稱廣東生研6.5.2驗(yàn)證單位：中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所、蘇州西山生物技術(shù)有限6.5.3驗(yàn)證方法：由廣東生研院負(fù)責(zé)樣品的制備、驗(yàn)證及發(fā)樣，驗(yàn)證單位采用各廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所采用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)所述Reo-3PCR檢測(cè)方法與3測(cè)，檢測(cè)結(jié)果均與被檢項(xiàng)目結(jié)果一致。說(shuō)明所建立的ReoReo3核酸檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)結(jié)果序號(hào)比對(duì)樣本編號(hào)驗(yàn)證單位檢測(cè)方法結(jié)果符合性1T20170703-F1中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所RT-PCR一致2T201