動(dòng)物疫病鑒別檢測(cè)技術(shù) 兔出血癥病毒經(jīng)典型與兔出血癥病毒2型

動(dòng)物疫病鑒別檢測(cè)技術(shù)兔出血癥病毒經(jīng)典型與兔出血癥病毒2型范圍本文件描述了兔出血癥病毒（Rabbithaemorrhagicdiseasevirus，RHDV）經(jīng)典型與兔出血癥病毒2型（Rabbithaemorrhagicdiseasevirus2，RHDV2）實(shí)時(shí)熒光反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（Real-timeRT-PCR）鑒別檢測(cè)方法。本文件適用于兔及其產(chǎn)品中RHDV經(jīng)典型與RHDV2型的鑒別檢測(cè)。規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682?分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法NY/T541?獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范DB63/T1652病害動(dòng)物及病害動(dòng)物產(chǎn)品無(wú)害化處理技術(shù)規(guī)程術(shù)語(yǔ)和定義本文件沒有需要界定的術(shù)語(yǔ)和定義。試驗(yàn)原理在游離狀態(tài)下，SYBRGreenI染料只發(fā)出微弱的熒光，與雙鏈DNA結(jié)合后熒光信號(hào)大幅度增強(qiáng)。在PCR反應(yīng)過程中，SYBRGreenI染料與擴(kuò)增的雙鏈DNA產(chǎn)物結(jié)合后發(fā)出熒光，且伴隨擴(kuò)增產(chǎn)物的指數(shù)型上升，熒光強(qiáng)度也隨之上升并被熒光PCR儀檢測(cè)從而獲得熒光擴(kuò)增曲線，之后進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物熔解溫度（Tm）曲線分析，由于擴(kuò)增產(chǎn)物GC含量差異導(dǎo)致Tm值不同。本文件引物可通用檢測(cè)RHDV經(jīng)典型與RHDV2型靶基因，但由于RHDV擴(kuò)增產(chǎn)物GC含量高于RHDV2擴(kuò)增產(chǎn)物，導(dǎo)致Tm值明顯高于后者，并依此適用于RHDV經(jīng)典型與RHDV2型的鑒別檢測(cè)。試劑或材料除非另有說(shuō)明，所用試劑均為分析純。水：GB/T6682，一級(jí)。TRIzol試劑。氯仿。異丙醇。反轉(zhuǎn)錄酶M-MuLV及5×反轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)緩沖液：反轉(zhuǎn)錄酶濃度200?U/μL，均-20?℃保存。RNA酶抑制劑：50?U/μL，-20?℃保存。脫氧核糖核苷三磷酸（dNTP）：為dATP、dGTP、dCTP、dTTP混合物，均為10?mmol/L。2X?SYBR?Green?PCR?Mix：-20?℃保存。75?%乙醇：取無(wú)水乙醇75?mL，加滅菌水至100?mL，混勻，室溫保存。焦碳酸二乙酯（DEPC）水：取1?mL?DEPC加入水中至1?000?mL，充分震蕩混勻，靜置24?h后，121?℃高壓滅菌15?min，4?℃保存?zhèn)溆谩Ａ姿猁}緩沖溶液（PBS）：取NaCl?8?g，KCl?0.2?g，KH2PO4?0.2?g，Na2HPO4?12H2O?2.9?g，依次溶于800?mL水中，用鹽酸調(diào)pH值至7.4，定容至1?000?mL，置于高壓滅菌鍋121?℃滅菌20?min，4?℃保存。乙二胺四乙酸二鉀（EDTA-K2）抗凝劑：取EDTA-K2·2H2O?1.5?g，溶于80?mL水中，充分溶解后定容至100?mL，置于高壓滅菌鍋121?℃滅菌20?min，室溫保存。一次性無(wú)菌注射器（2.5?mL）。無(wú)核酸酶離心管（1.5?mL）。商品化病毒核酸提取試劑盒。陽(yáng)性對(duì)照樣品和陰性對(duì)照樣品：RHDV陽(yáng)性對(duì)照樣品為RHDVAV34株（購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所）肝組織毒，-20?℃保存，RHDV2陽(yáng)性樣品為VP60基因體外轉(zhuǎn)錄的無(wú)感染性RNA，-80?℃保存；陰性對(duì)照樣品為RHDV、RHDV2陰性的兔肝組織懸液，-20?℃保存。檢測(cè)RHDV與RHDV2的通用引物：Primer-F5’-CAACCGGACTGTTTGTGATGGC-3’；Primer-R5’-ACGCGAACATGATGGGTGTGTT-3’。儀器設(shè)備Ⅱ級(jí)生物安全柜A型。電子天平：精度0.01?g。高速冷凍離心機(jī)：轉(zhuǎn)速≥12?000?r/min。微型低速離心機(jī)：轉(zhuǎn)速6?000?r/min。冰箱：-20?℃。超低溫冰箱：-80?℃。高壓滅菌鍋。熒光PCR檢測(cè)儀。樣品肝組織樣品病死兔的病變肝組織樣品采集、保存和運(yùn)輸按照NY/T541執(zhí)行。血液樣品活兔血液樣品采集：將活兔固定，選擇耳緣靜脈清晰的一側(cè)耳朵，剃毛并消毒，壓迫耳根使靜脈充盈，用一次性無(wú)菌注射器（2.5?mL）針頭穿刺靜脈采血1.8?mL，并將新鮮血液與乙二胺四乙酸二鉀抗凝劑混合，體積比為9:1（V:V）。血液樣品保存和運(yùn)輸按照NY/T541執(zhí)行。試驗(yàn)步驟樣品處理肝臟樣品在Ⅱ級(jí)生物安全柜A型處理。電子天平稱取1.00?g?±?0.05?g樣品，剪碎后加入10倍體積PBS，充分研磨成組織勻漿，裝入1.5?mL無(wú)核酸酶離心管中，置高速冷凍離心機(jī)4?℃、12?000?r/min離心5?min，取上清液提取核酸。血液樣品將血液樣品裝入1.5?mL無(wú)核酸酶離心管中，-20?℃冷凍30?min后置室溫融化5?min，反復(fù)3次，4?℃、12?000?r/min離心5?min，取上清液提取核酸。檢畢樣品按照DB63/T1652處理。核酸提取核酸提取方法說(shuō)明待檢樣品、陰性對(duì)照及陽(yáng)性對(duì)照樣品的RNA可使用TRIzol試劑提取，也可使用商品化病毒核酸提取試劑盒并按照說(shuō)明書提取。TRIzol試劑提取樣品RNA根據(jù)待檢樣品、陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照的份數(shù)總和取1.5?mL無(wú)核酸酶離心管，編號(hào)后每管加入600?μL的TRIzol試劑。將待檢樣品、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照樣品上清液各200?μL加到相應(yīng)離心管中，顛倒充分混勻。每管加入氯仿200?μL，顛倒充分混勻，4?℃、12?000?r/min離心15?min。吸取8.2.3各管中的上清液（避免吸出中間層）400?μL，轉(zhuǎn)移至新的編號(hào)離心管中，每管加入等體積-20?℃預(yù)冷30?min的異丙醇，顛倒充分混勻。4?℃、12?000?r/min離心15?min，棄去上清液，倒置于吸水紙上瀝干，不同樣品離心管應(yīng)在吸水紙的不同位置瀝干。逐管加入?-20?℃預(yù)冷30?min的75%乙醇1?mL，顛倒洗滌。4?℃、12?000?r/min離心10?min，棄去上清液，倒置于吸水紙上瀝干，不同樣品離心管應(yīng)在吸水紙的不同位置瀝干。微型低速離心機(jī)4?000?r/min離心10?s，將管壁上的殘余液體甩至管底部，用微量移液器吸棄。室溫干燥3?min，每管加入焦碳酸二乙酯（DEPC）水25?μL溶解RNA，冰浴備用。提取的RNA應(yīng)盡快進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，長(zhǎng)時(shí)間保存放置-80?℃超低溫冰箱。熒光RT-PCR檢測(cè)反轉(zhuǎn)錄（RT）反應(yīng)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為20?μL。a）第一階段：在無(wú)核酸酶PCR管中加入提取的RNA溶液?10?μL，脫氧核糖核苷三磷酸（dNTP）?1.0?μL，引物Primer-R（10?μmol/L）1.0?μL，無(wú)核酸酶水2.5?μL，65?℃作用5?min，然后冰浴2?min。b）第二階段：依次加入5×反轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)緩沖液?4?μL、RNA酶抑制劑（40?U/μL）0.5?μL、反轉(zhuǎn)錄酶M-MuLV（200?U/μL）?1.0?μL，混勻后低速離心10?s，50?℃反應(yīng)30?min，然后85?℃作用5?min終止反應(yīng)。c）反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物應(yīng)在20?min內(nèi)進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增，剩余產(chǎn)物應(yīng)放置-80?℃冰箱保存，以便復(fù)核（如有必要）。熒光PCR檢測(cè)反應(yīng)體系的配制樣品檢測(cè)反應(yīng)體系為20.0?μL，配制見表1。表1?熒光PCR檢測(cè)反應(yīng)液體系熒光PCR反應(yīng)液組分1個(gè)檢測(cè)反應(yīng)體系的使用量μL2X?SYBR?Green?PCR?Mix10.0Primer-F（10?μmol/L）0.4Primer-R（10?μmol/L）0.4RT產(chǎn)物（待檢樣品、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照）2.0水7.2總體積20.0加樣將制備的陰性對(duì)照、待檢樣品、陽(yáng)性對(duì)照RT產(chǎn)物各2?μL依次分別加入對(duì)應(yīng)熒光PCR檢測(cè)反應(yīng)管中，扣緊管蓋，混勻后低速離心10?s。測(cè)定選擇熒光PCR檢測(cè)儀SYBR?Green?I檢測(cè)通道，將配制好的熒光PCR管按順序放入熒光PCR檢測(cè)儀。反應(yīng)程序如下：——第一階段：95?℃?2?min；——第二階段：95?℃?20?s，55?℃?10?s，72?℃?20?s，40個(gè)循環(huán)，每次循環(huán)72?℃延伸時(shí)收集熒光信號(hào)；——第三階段：熔解曲線分析，按照各品牌儀器設(shè)備推薦程序進(jìn)行。結(jié)果判定結(jié)果分析條件設(shè)定根據(jù)儀器噪聲情況對(duì)閾值設(shè)定進(jìn)行調(diào)整，以閾值線剛好過陰性對(duì)照樣品的擴(kuò)增曲線最高點(diǎn)為準(zhǔn)。質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)同時(shí)滿足以下條件，試驗(yàn)有效，否則無(wú)效。a）陰性對(duì)照應(yīng)無(wú)Ct（或Cp）值或Ct（或Cp）>35，且無(wú)特異性熔解曲線。b）RHDV陽(yáng)性對(duì)照的Ct（或Cp）值應(yīng)≤30，并出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線及熔解曲線，且Tm=84.90?℃（RHDV擴(kuò)增曲線與熔解曲線見附錄A的A.1）。c）RHDV2陽(yáng)性對(duì)照的Ct（或Cp）值應(yīng)≤30，并出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線及熔解曲線，且Tm=82.60?℃（RHDV2擴(kuò)增曲線與熔解曲線見附錄A的A.2）。結(jié)果描述及判定被檢樣品是否感染RHDV描述及判定檢測(cè)結(jié)果符合以下描述時(shí)，分別判定RHDV陰性或RHDV陽(yáng)性。a）無(wú)Ct（或Cp）值或Ct（或Cp）>35，判為陰性；若Ct（或Cp）值≤35，且無(wú)特異性熔解曲線，判為陰性。b）Ct（或Cp）值≤30，出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，且熔解曲線Tm值為85.0?℃±0.5?℃，表示樣品中存在RHDV核酸，判為陽(yáng)性（RHDV樣品擴(kuò)增曲線與熔解曲線見附錄A的A.3）。c）30<Ct（或Cp）值≤35，且熔解曲線與陽(yáng)性對(duì)照相符，判定為疑似，再次檢測(cè)仍介于此區(qū)間，判定為陽(yáng)性。被檢樣品是否感染RHDV2描述及判定檢測(cè)結(jié)果符合以下描述時(shí)，分別判定RHDV2陰性或RHDV2陽(yáng)性。a）無(wú)Ct（或Cp）值或Ct（或Cp）>35，判為陰性；若Ct（或Cp）值≤35，且無(wú)特異性熔解曲線，判為陰性。b）Ct（或Cp）值≤30，且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，熔解曲線Tm值為83.0?℃±0.4?℃，表示樣品中存在RHDV2核酸，判為陽(yáng)性（RHDV2樣品擴(kuò)增曲線與熔解曲線見附錄A的A.3）。c）30<Ct（或Cp）值≤35，且熔解曲線與陽(yáng)性對(duì)照相符，判定為疑似，再次檢測(cè)仍介于此區(qū)間，判定為陽(yáng)性。RHDV與RHDV2鑒別檢測(cè)描述及判定被檢樣品同時(shí)符合9.3.1與9.3.2陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照、陽(yáng)性樣品檢測(cè)結(jié)果的描述時(shí)，且Tm相差約1.1?℃～2.8?℃，Tm值高者判為RHDV陽(yáng)性，Tm值低者判為RHDV2陽(yáng)性。

（資料性）典型擴(kuò)增曲線與熔解曲線RHDV陰性、陽(yáng)性樣品Real-timePCR擴(kuò)增曲線及熔解曲線見圖A.1。標(biāo)引序號(hào)說(shuō)明：1——陽(yáng)性對(duì)照（Tm值84.90?℃）；2——陰性對(duì)照。圖A.1?RHDV陰性、陽(yáng)性樣品Real-timePCR擴(kuò)增曲線及熔解曲線RHDV2陰性、陽(yáng)性樣品Real-timePCR擴(kuò)增曲線及熔解曲線見圖A.2。標(biāo)引序號(hào)說(shuō)明：1——陽(yáng)性對(duì)照（Tm值82.60?℃）；2——陰性對(duì)照。圖A.2?RHDV2陰性、陽(yáng)性樣品Real-timePCR擴(kuò)增曲線及熔解曲線RH