DB21-T3257-2020-豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法-遼寧省

ICS11.220DB21B41遼寧省地方標(biāo)準(zhǔn)DB21/T3257—2020豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法MethodofELISAforPRRSVantibodyNEQ遼寧省市場監(jiān)督管理局發(fā)布DB21/T3257—2020目次前1言............................................................................II范圍..............................................................................1規(guī)范性引用文件....................................................................1縮略語............................................................................1原理..............................................................................1儀器和器材........................................................................1試劑..............................................................................2操作步驟..........................................................................2試驗(yàn)成立條件與結(jié)果判定............................................................3檢測(cè)過程中防止交叉污染的措施......................................................3廢棄物處理.......................................................................32345678910附錄A（資料性附錄）試劑配制........................................................4IDB21/T3257—2020前言本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由動(dòng)物衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)（遼寧）提出，遼寧省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳歸口管理。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：遼寧省農(nóng)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心。本標(biāo)準(zhǔn)協(xié)助單位：洛陽現(xiàn)代生物技術(shù)研究院有限公司、遼寧佰瑞生物科技有限公司。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：周晨陽、魏澍、高志峰、魏園園、王冰、董娜、劉金玲、劉耀川、楊作豐、高原、王連山、馬亮亮、潘婷婷、楊嶸長、姜斌、楊太東、于春玲。本標(biāo)準(zhǔn)發(fā)布實(shí)施后，任何單位和個(gè)人如有問題和意見建議，均可以通過來電和來函等方式進(jìn)行反饋，我們將及時(shí)答復(fù)并認(rèn)真處理，根據(jù)實(shí)際情況依法進(jìn)行評(píng)估及復(fù)審。歸口管理部門通訊地址：遼寧省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳（沈陽市和平區(qū)太原北街2號(hào)），聯(lián)系電話標(biāo)準(zhǔn)起草單位通訊地址：遼寧省動(dòng)物及產(chǎn)品檢疫中心（沈陽市沈河區(qū)萬柳塘路105號(hào)甲），聯(lián)系電話IIDB21/T3257—2020豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法的技術(shù)要求。本標(biāo)準(zhǔn)適用于在生物安全Ⅱ級(jí)（BSL-2）以上的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行豬繁殖與呼吸綜合征病毒病的診斷、監(jiān)測(cè)及流行病學(xué)調(diào)查，適用于豬血清或血漿樣品中的豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體檢測(cè)。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求GB/T19495.2-2004轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)要求3縮略語ELISA：酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzymelinkedimmunosorbentassay）PRRSV：豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PorcineReproductiveandRespiratorySyndromeVirus）PBS：磷酸鹽緩沖液（phosphatebuffersolution）4本方法原理是包被板上包被的豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）抗原，可與待測(cè)樣品中的特異性抗體反應(yīng)，形成抗原-抗體復(fù)合物，再加入酶標(biāo)記的二抗，則形成免疫復(fù)合物，洗滌后，如待測(cè)樣品中含有PRRSV抗體，顯色深，為陽性，反之為陰性。51DB21/T3257—20206試劑注：本技術(shù)規(guī)范中使用的試劑，除另有說明外，所有實(shí)驗(yàn)使用的試劑等級(jí)均為分析純或生化試劑；所有試劑均用無菌的容器分裝。6.1豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗原包被板。6.2陽性對(duì)照：豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體陽性豬血清。6.3陰性對(duì)照：無豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體豬血清。6.4酶標(biāo)復(fù)合物：過氧化物酶標(biāo)記的抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒單克隆抗體。6.5PBS：磷酸鹽緩沖液（0.01mol/LpH7.4）配制見第A.1章。6.6洗滌液：配制見第A.2章。6.7樣品稀釋液：配制見第A.3章。6.8底物溶液：配制見第A.5章。6.9終止液：配制見第A.6章。7操作步驟注：試驗(yàn)操作過程中涉及生物安全的注意事項(xiàng)依據(jù)GB19489《實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求》的規(guī)定執(zhí)行。7.1樣品的采集、前處理與存放7.1.1采樣注意事項(xiàng)采集血液，用離心機(jī)分離上清血清，血清應(yīng)新鮮、透明、不溶血、無污染。試驗(yàn)前將被檢血清統(tǒng)一編號(hào)，并用樣品稀釋液作40倍稀釋。7.2.2取出包被板，加入100μL沒有稀釋的陰性對(duì)照和陽性對(duì)照，每次檢測(cè)各加兩孔；在相應(yīng)的孔中加入100μL已經(jīng)稀釋好的樣品。7.2.3在37℃條件下溫育30min（±1min）。7.2.4將各孔的液體棄入廢液桶，用300μL洗滌液洗滌板孔，共洗滌5次。每次洗滌后應(yīng)棄去孔內(nèi)的液體。在最后一次洗滌液棄去后，將孔中殘留的洗滌液在吸水紙上拍干。7.2.5每孔加入100μL酶結(jié)合物。7.2.6在37℃條件下溫育20min（±1min）。7.2.7重復(fù)步驟7.2.4。7.2.8每孔加入50μL顯色液A和50μL顯色液B（也可顯色液A、B等比例混勻后加100μL）。2DB21/T3257—20207.2.9在37℃條件下溫育10min（±1min）。7.2.10每孔加入50μL終止液，終止反應(yīng)。測(cè)量并且記錄樣品和對(duì)照的OD值（450nm），15min內(nèi)讀值有效。8試驗(yàn)成立條件與結(jié)果判定試驗(yàn)成立條件8.1陰性對(duì)照平均值（NCX）陽性對(duì)照平均值（PCX）NCX=(NC1+NC2)/2PCX=(PC1+PC2)/2X試驗(yàn)成立判斷標(biāo)準(zhǔn)：PCX-NC≥0.5；NCX≤0.3。如果試驗(yàn)無效，試驗(yàn)中的操作值得懷疑，應(yīng)按照操作說明書重做一次試驗(yàn)。8.2結(jié)果判定樣品的計(jì)算S/P=(樣品－NCX)/(PCX－NCX)如果樣品S/P值＜0.2，樣品應(yīng)判定為抗體陰性。如果樣品S/P值≥0.2，樣品應(yīng)判定為抗體陽性。9檢測(cè)過程中防止交叉污染的措施按照GB/T19495.2-2004的規(guī)定執(zhí)行。廢棄物處理10按照《農(nóng)業(yè)部關(guān)于印發(fā)〈病死及病害動(dòng)物無害化處理技術(shù)規(guī)范〉的通知》（農(nóng)醫(yī)發(fā)〔2017〕25號(hào))3DB21/T3257—2020附錄A（資料性附錄）試劑配制A.1磷酸鹽緩沖液（PBS，0.01mol/LpH7.4）氯化鈉8g氯化鉀0.2g磷酸二氫鉀十二水磷酸氫二鈉蒸餾水0.2g2.83g加至