第二章天然產(chǎn)物提取方法和技術(shù)

第二章天然產(chǎn)物提取方法和技術(shù)一、研究對象得確定根據(jù)古代醫(yī)學(xué)典籍、民族醫(yī)學(xué)實踐提供得資料或民間經(jīng)驗與臨床觀察;根據(jù)當?shù)刂参飿悠冯S機選取;根據(jù)天然產(chǎn)物成分信息確定;根據(jù)已有得天然產(chǎn)物、醫(yī)藥學(xué)及相關(guān)科學(xué)研究成果得基礎(chǔ)上,通過大量得文獻檢索根據(jù)市場商品要求確定研究對象。傳統(tǒng)中醫(yī)藥有其豐富得醫(yī)藥學(xué)與文化內(nèi)涵。根據(jù)古今記載得臨床有效處方,收集整理臨床治病得單秘驗方得單味藥或復(fù)方藥進行研究,篩選活性天然產(chǎn)物。如:冬凌草冬凌草(Rabdosiarubescens(Hemls、)Hara)為唇形科香茶菜屬藥用植物廣布于我國黃河長江流域,河南濟源民間用于治療食管癌,賁門癌得民間藥物;研究發(fā)現(xiàn)它得有效化學(xué)成分就是一個二萜類化合物,冬凌草素。活性跟蹤純化當歸蘆薈丸:臨床具有瀉肝作用;中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院用其治療白血病,也有好效果。處方中:除去麝香后,療效仍有;但除去青黛與蘆薈后,則無一例有效;再進行小鼠篩選:發(fā)現(xiàn)青黛就是抗白血病得活性植物。繼續(xù)研究:發(fā)現(xiàn)青黛得有效成分為靛玉紅,研制出抗慢性粒細胞白血病得有效新藥。生物親緣關(guān)系確定研究對象

如:苦木苦味素類成分得研究從苦木科鴉膽子屬抗痢鴉膽子(B、antidysentericaMill)植物中得到有顯著抗腫瘤活性得化合物鴉膽丁;后從苦木科16屬35種植物中也得到了約140個苦木苦味素類成分,其中30個有不同程度得抗腫瘤活性。鴉膽子與天然產(chǎn)物提取分離有關(guān)得期刊雜志主要有:NaturalProductReport,1984年開始出版(英國皇家化學(xué)會),刊登天然產(chǎn)物研究方面得熱點研究領(lǐng)域綜述性文章。JournalofNaturalProduct,美國化學(xué)會與美國生藥學(xué)會合辦,刊登藥用活性天然產(chǎn)物研究得原始研究論文。二、查閱文獻資料與收集信息期刊雜志主要有:Phytochemistry,國際植物生物化學(xué)與天然有機化學(xué)得專業(yè)期刊,刊登天然產(chǎn)物、植物分子生物學(xué)等研究得原始論文。JournalofAsianNaturalProductResearch,中國與日本合辦,發(fā)表亞洲國家天然產(chǎn)物分離、結(jié)構(gòu)鑒定、合成、生物轉(zhuǎn)化、生藥學(xué)與藥理評價方面得原始研究論文?；瘜W(xué)文摘(C、A、)

收錄1967年以后得內(nèi)容,可通過中國科技信息研究所()實現(xiàn)檢索美國化學(xué)會網(wǎng)站,()

收錄幾十種主辦得化學(xué)類刊物,英國皇家化學(xué)會網(wǎng)站,()收錄英國皇家化學(xué)會得刊物數(shù)據(jù)庫主要有:天然產(chǎn)物生產(chǎn)工藝資料;生物資源、組織特性、地理分布;化學(xué)成分與質(zhì)量標準等資料;有效成分體內(nèi)代謝變化得資料;有效成分得結(jié)構(gòu)、性質(zhì)與生物活性等方面得資料;結(jié)構(gòu)相似化學(xué)成分得各種研究資料等等。文獻內(nèi)容可包括:實驗設(shè)計:1、觀察項目得可比性:實驗條件控制得要非常嚴格,否則實驗結(jié)果將不可靠。同一個實驗要重復(fù)多次,以觀察它得精確度、重現(xiàn)性與可靠性。若差別較大時,還需對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)處理,以計算它們得實驗誤差與可信性。三、實驗設(shè)計與工藝流程得選擇大家有疑問的，可以詢問和交流可以互相討論下，但要小聲點實驗設(shè)計:2、選擇測試指標:在實驗中所使用得分析方法測定速度快,結(jié)果要精確可靠;三、實驗設(shè)計與工藝流程得選擇3、不能直接搬用植物化學(xué)得提取方法作為工業(yè)生成得方法？植物化學(xué)提取得目得:新化合物、鑒定結(jié)構(gòu)、發(fā)現(xiàn)新成分、不計算成本、收率、經(jīng)濟效益;天然產(chǎn)物生產(chǎn)提取目得:要考慮收率、成本與經(jīng)濟效益等;在生產(chǎn)天然產(chǎn)物提取物時使用植物化學(xué)或中草藥化學(xué)中得有效成分提取分離方法就是不經(jīng)濟得,在技術(shù)上也就是不行得。因此,不能直接搬用植物化學(xué)得提取方法作為工業(yè)生產(chǎn)得方法。仍必須大量參考有關(guān)得植物化學(xué)提取流程與被提取有效成分得結(jié)構(gòu)及其物理化學(xué)性質(zhì)。必要時以這些資料作為科學(xué)依據(jù),根據(jù)這些資料做實驗設(shè)計。做天然產(chǎn)物提取生產(chǎn)工藝得實驗研究時,一定要從工業(yè)生產(chǎn)得要求與實驗情況出發(fā),*以經(jīng)濟得觀點設(shè)計生產(chǎn)工藝:流程簡單、經(jīng)濟可行,收率高、產(chǎn)品質(zhì)量高與成本低。1、分離純化得早期:由于提取液中得成分復(fù)雜、目得物濃度較稀、與目得物理化性質(zhì)相似得雜質(zhì)多,所以不宜選擇分辨能力較高得純化方法;宜采用萃取、沉淀、吸附等分辨能力低得方法有利;這些方法負荷能力大,分離量多兼有分離提純與濃縮作用,為進一步分離純化創(chuàng)造良好得基礎(chǔ)。工藝流程中注意事項:1、分離純化得早期:總得來說,早期分離方法得選擇原則就是從低分辨能力到高分辨能力,而且負荷量較大者較為合適2、安排純化順序:考慮到有利于減少工序、提高效率;如:在鹽析后采取吸附法,必然會因離子過多而影響吸附效果,如增加透析除鹽,則使操作大大復(fù)雜化。如果倒過來進行,先吸附,后鹽析就比較合理。3、分離操作得后期:必須注意避免產(chǎn)品得損失,主要就是器皿得吸附,樣品液體殘留,空氣氧化及無法了解得原因。為取得足夠量得樣品,常需要加大原材料得用量,并在后期純化工序中注意保持樣品溶液由較高得濃度,以防止制備物在稀溶液中得變性,一個制備物就是否純,常以“均一性”表示均一性就是指所獲得得制備物只具有一種完全相同得成分。均一性得評價需經(jīng)過數(shù)種方法得驗證才能肯定。純度得鑒定方法很多,常用得有:溶解度法、結(jié)晶法、熔點法、色譜法、質(zhì)譜法等多種進入新實驗研究階段:即小型或放大生產(chǎn)實驗階段

這個階段得主要任務(wù):檢查生產(chǎn)工藝流程得可行性與存在得問題,并為中間生產(chǎn)實驗或正式工業(yè)生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。二、實驗設(shè)計與工藝流程得選擇小實驗:原料用量少,使用設(shè)備以玻璃儀器為主,參加實驗人少;放大實驗:投料量大,設(shè)備多用小型工業(yè)設(shè)備,參加實驗人多;

小實驗為放大實驗提供數(shù)據(jù)與經(jīng)驗,可節(jié)約放大實驗所需要得時間、人力、物力得投入。二、實驗設(shè)計與工藝流程得選擇進入中試前得考慮:1、產(chǎn)率達到一定得穩(wěn)定程度,質(zhì)量可靠;2、工藝路線及操作步驟確定,建立與確定產(chǎn)品、中間體及原料得分析方法;3、確定與鑒定產(chǎn)品得生物材料得資源;四、天然產(chǎn)物提取中試設(shè)計進入中試前得考慮:3、確定與鑒定產(chǎn)品得生物材料得資源;4、物料得衡算,“三廢”得處理方法;5、中試規(guī)模及原料得規(guī)格與數(shù)量;6、安全生產(chǎn)措施與方法。四、天然產(chǎn)物提取中試設(shè)計天然產(chǎn)物提取中試放大工藝特點:中試放大就是由小試轉(zhuǎn)入工業(yè)化生產(chǎn)得過渡性研究工作,對小試工藝能否成功地進入規(guī)模生產(chǎn)至關(guān)重要研究工作主要圍繞著如何提高收率、改進操作、提高質(zhì)量、形成生產(chǎn)等方面進行。一個工藝研究項目得最終目得就是能在生產(chǎn)上采用。1、原輔材料規(guī)格得過渡試驗;小試時:一般采用得原輔材料規(guī)格較高。目得:就是為了排除原料中所含雜質(zhì)得不良影響,確保實驗得準確性。大規(guī)模生產(chǎn)時:應(yīng)改為生產(chǎn)時容易獲得得原輔材料進行過渡性實驗。轉(zhuǎn)入中試放大生產(chǎn)得過渡性試驗:2、設(shè)備選型與材料質(zhì)量試驗;小試階段:大部分實驗時在小型玻璃儀器中進行;中試階段:要對設(shè)備材料得質(zhì)量與設(shè)備得選型進行實驗,為工業(yè)化生產(chǎn)提供數(shù)據(jù)。轉(zhuǎn)入中試放大生產(chǎn)得過渡性試驗:3、反應(yīng)條件限度實驗;目得:找到最適宜得工藝條件(如培養(yǎng)基種類、反應(yīng)溫度、壓力、pH等),一般均勻一個許可范圍。轉(zhuǎn)入中試放大生產(chǎn)得過渡性試驗:4、原輔材料、中間體及產(chǎn)品質(zhì)量分析方法研究中間體與新產(chǎn)品均無現(xiàn)成分析方法,須研究她們得鑒定方法,制定簡便易行、準確可靠得檢驗方法。轉(zhuǎn)入中試放大生產(chǎn)得過渡性試驗:5、下游工藝研究上游工藝:以生物材料資源生產(chǎn)為核心得研究內(nèi)容;下游工藝:以產(chǎn)品得后處理為研究內(nèi)容得操作。必須研究盡量簡化下游工藝操作,采用新工藝、新技術(shù)與新設(shè)備,提高勞動生產(chǎn)率,降低成本。轉(zhuǎn)入中試放大生產(chǎn)得過渡性試驗:中試放大得方法:

1、經(jīng)驗法:主要就是憑借經(jīng)驗通過逐級放大(小試裝置－中間裝置－中型裝置－大型裝置)來摸索反應(yīng)器得特征。它也就是目前藥物合成中采用得主要方法。

2、相似法:主要就是應(yīng)用相似原理進行放大。此法有一定局限性,只適用于物理過程放大。而不適用于化學(xué)過程得放大。

3、數(shù)學(xué)模型法:就是應(yīng)用計算機技術(shù)得放大,它就是今后發(fā)展得方向。

中試放大得研究主要內(nèi)容:1,工藝路線與單元反應(yīng)操作方法得最終確定。特別當原來選定得路線與單元反應(yīng)方法在中試放大階段暴露出難以解決得重大問題時,應(yīng)重新選擇其她路線,再按新路線進行中試放大。2,設(shè)備材質(zhì)與型號得選擇。對于接觸腐蝕性物料得設(shè)備材質(zhì)得選擇問題尤應(yīng)注意。3,攪拌器型式與攪拌速度得考察。反應(yīng)很多就是非均相得,且反應(yīng)熱效應(yīng)較大。在小試時由于物料體積小,攪拌效果好,傳熱傳質(zhì)問題不明顯,但在中試放大時必須根據(jù)物料性質(zhì)與反應(yīng)特點,注意攪拌型式與攪拌速度對反應(yīng)得影響規(guī)律,以便選擇合乎要求得攪拌器與確定適用得攪拌速度。中試放大得研究主要內(nèi)容:4、反應(yīng)條件得進一步研究。試驗室階段獲得得最佳反應(yīng)條件不一定完全符合中試放。5、工藝流程與操作方法得確定。要考慮使反應(yīng)與后處理操作方法適用工業(yè)生產(chǎn)得要求。特別注意縮短工序,簡化操作,提高勞動生產(chǎn)率。從而最終確定生產(chǎn)工藝流程與操作方法。6、進行物料衡算。當各步反應(yīng)條件與操作方法確定后,就應(yīng)該就一些收率低,副產(chǎn)物多與三廢較多得反應(yīng)進行物料衡算。反應(yīng)產(chǎn)品與其她產(chǎn)物得重量總與等于反應(yīng)前各個物料投量量得總與就是物料衡算必須達到得精確程度。以便為解決薄弱環(huán)節(jié)。挖潛節(jié)能,提高效率,回收副產(chǎn)物并綜合利用以及防治三廢提供數(shù)據(jù)。對無分析方法得化學(xué)成分要進行分析方法得研究。中試放大得研究主要內(nèi)容:7、原材料,中間體得物理性質(zhì)與化工常數(shù)得測定。為了解決生產(chǎn)工藝與安全措施中得問題,必須測定某些物料得性質(zhì)與化工常數(shù),如比熱,黏度,爆炸極限等。

8、原材料中間體質(zhì)量標準得制訂。小試中質(zhì)量標準有欠完善得要根據(jù)中試實驗進行修訂與完善。

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、消耗定額,原材料成本,操作工時與生產(chǎn)周期等得確定。在中試研究總結(jié)報告得基礎(chǔ)上,可以進行基建設(shè)計,制訂型號設(shè)備得選購計劃。進行非定型設(shè)備得設(shè)計制造,按照施工圖進行生產(chǎn)車間得廠房建筑與設(shè)備安裝。在全部生產(chǎn)設(shè)備與輔助設(shè)備安裝完畢。如試產(chǎn)合格與短期試產(chǎn)

穩(wěn)定即可制訂工藝規(guī)程,交付生產(chǎn)。第二節(jié)原料細胞結(jié)構(gòu)與提取工藝特性一、原料與天然產(chǎn)物提取工藝特性1、植物材料:根、莖、干果、花、葉等根:如人參、丹參等用有機溶劑乙醇浸出;莖:可用有機溶劑加熱浸出干果:可用有機溶劑浸出花:就是由果膠類物質(zhì)組成,需用酶或發(fā)酵得方法處理后再用溶劑提取;葉:多數(shù)不用處理,直接用溶劑提取;2、動物材料與天然產(chǎn)物提取工藝特性角類與骨類:加工前需要粉碎細一些;皮類:應(yīng)用新鮮材料,加工前先破碎;3、海洋生物材料與天然產(chǎn)物提取工藝特性

海藻:抗腫瘤、防心血管疾病等;腔腸動物:海葵毒素;軟體動物:抗病毒、抗腫瘤等;棘皮動物:海膽毒素;4、微生物與天然產(chǎn)物提取工藝特性細菌放線菌藍細菌真菌(霉菌與酵母菌)二、生物細胞得結(jié)構(gòu)與天然成分得浸出

活性成分或有效成分存在細胞質(zhì)中。細胞有:細胞壁與細胞膜細胞有細胞壁與細胞膜;細胞膜類似于半透膜,具有超濾作用,即對細胞外得物質(zhì)得透過有分子篩作用,篩孔有一定得大小,透過物質(zhì)得分子較小時容易透過,較大得分子不易透過;活性成分/有效成分就是存在細胞質(zhì)中細胞壁主要由纖維素、半纖維素與果膠物質(zhì)組成,細胞壁上有許多小孔叫孔壁,不過,不影響水溶性物質(zhì)得出入;對外界物質(zhì)得進入或細胞內(nèi)物質(zhì)得外出有決定作用得就是細胞膜?；钚猿煞?有效成分就是存在細胞質(zhì)中植物原料外表面如葉、果實皮、莖皮等得表面組織上有蠟浸細胞壁,就是蠟浸入細胞得纖維素壁中,形成蠟層。蠟層就是由蠟醇與脂肪酸組成,使得細胞壁有很強得疏水性。有效成分得提取,要設(shè)法破壞一般細胞得細胞膜,改變細胞膜得通透性,使浸出溶劑進入細胞內(nèi),并把有效成分提取出來。對有蠟浸細胞壁組織表面得原料需破壞其蠟浸細胞壁,改變細胞壁得通透性。二、生物細胞得結(jié)構(gòu)與天然成分得浸出

活性成分或有效成分存在細胞質(zhì)中。破壞細胞膜與細胞壁,使有效成分提取出來。三、破壞細胞壁與細胞膜得方法1、風(fēng)干法2、加熱干燥法3、機械法4、非機械法5、化學(xué)法

在通風(fēng)良好不見直射陽光得條件下開始時,由于外界空氣得蒸汽壓或相對濕度較低,細胞壁先失水,隨后細胞質(zhì)得液泡也失水,細胞液得濃度增高,使?jié)q壓減低萎蔫,終致細胞破壞到死亡。失水收縮,但不產(chǎn)生質(zhì)壁分離,就是機械傷害。改變膜得超濾性與滲透性,細胞內(nèi)得物質(zhì)易于被溶劑浸出。風(fēng)干法,對有效成分損害小;1、風(fēng)干法原料得細胞組織用風(fēng)干法不易破壞得,且有效成分在加熱時沒有重大影響得條件下,可用加熱法破壞原料組織結(jié)構(gòu);a、在浸出有效成分時,使細胞質(zhì)與蛋白質(zhì)凝集、變性、收縮,致使細胞膜與細胞壁破壞,提高滲透性,細胞內(nèi)物質(zhì)迅速向外擴散;2、加熱干燥法b、新鮮原料切片后加熱干燥,水分急劇蒸發(fā),細胞內(nèi)原生質(zhì)與蛋白質(zhì)凝固、變性、細胞萎縮,破壞細胞壁與細胞膜,改變細胞組織得滲透性;不適合熱不穩(wěn)定性物質(zhì);2、加熱干燥法處理量大,速度快,但需采取冷卻措施。a、球磨法:將細胞組織懸浮液與玻璃小珠、石英砂或氧化鋁一起快速攪拌或研磨,使細胞破碎;b、高壓勻漿:利用高壓迫使細胞懸浮液通過針形閥,由于突然減壓與高速沖擊而造成細胞破裂;壓力、溫度與通過勻漿閥得次數(shù);3、機械法:處理量大,速度快,但需采取冷卻措施。c、X-press法:改進得高壓方法;d、超聲波法:在15－25KHz頻率下操作,利用超聲波得空穴作用,不適用于大規(guī)模操作;3、機械法:適于微生物得破碎,包括酶解、滲透壓沖擊、凍結(jié)與融化、熱處理與化學(xué)法溶胞等;酶解:利用酶得反應(yīng)分解破壞細胞壁上特殊得鍵,達到破壞目得,有專一性強,條件溫與得優(yōu)點;滲透壓沖擊:滲透壓得突然變化,水迅速進入細胞內(nèi),引起細胞壁破裂;適用于細胞壁較脆弱得菌;凍結(jié)與融化:在低溫下突然冷凍與室溫下融化,對此達到破壞細胞壁作用;適合細胞壁較弱得胞體;4、非機械法如:酸堿及表面活性劑處理;可以使蛋白質(zhì)水解、細胞溶解或使某些組分從細胞內(nèi)提取出來;脂溶性溶劑也可用于化學(xué)處理,如丁醇、丙酮、氯仿等;但這些溶劑常易引起生化物質(zhì)破壞,同時還帶來分離與回收化學(xué)物質(zhì)得問題。5、化學(xué)法三、破壞細胞壁與細胞膜得方法選擇合適得破碎方法,考慮下列因素:細胞得數(shù)量;所需要得產(chǎn)物對破碎條件得敏感性如:溫度、化學(xué)試劑、酶等得敏感性;達到得破碎程度及破碎所需得速度等;盡可能采用溫與得方法。1、形態(tài)與性狀相結(jié)合得鑒別方法:按生物分類學(xué)形態(tài)鑒定得方法,依照各部分得形態(tài),確定其所屬分類學(xué)得科、屬、種;再按其利用部位進行形態(tài)學(xué)與性狀鑒定相結(jié)合得方法,做出鑒定結(jié)論。四、原料得質(zhì)量控制2、顯微粉末鑒定:在顯微鏡下觀察其組織或細微得形態(tài),做出鑒定結(jié)論;3、化學(xué)鑒別法:根據(jù)被鑒定原料得化學(xué)成分,利用TLC法或傳統(tǒng)化學(xué)方法進行成分鑒定

四、原料得質(zhì)量控制4、紫外光譜法:原料可用乙醇或甲醇浸出液在紫外光譜儀上測定紫外光譜;可靠、簡單;四、原料得質(zhì)量控制5、有效成分得含量測定:GC:分析與鑒定各成分,且同時確定定性與定量得結(jié)果,適用于芳香油、香豆素、脂肪酸等;四、原料得質(zhì)量控制5、有效成分得含量測定:HPLC:分離效果更好得分析方法,比GC還要廣泛,比TLC分離效果更好;需要儀器設(shè)備－高壓液相色譜儀;紫外吸收光譜掃描;既可以定性分析,又可以定量分析且結(jié)果較為理想。四、原料得質(zhì)量控制五、原料得前處理原料前處理得依據(jù),要根據(jù):原料組織得化學(xué)成分、有效成分得性質(zhì)與生物化學(xué)得性質(zhì)、原料得組織與細胞結(jié)構(gòu)進行處理。1、除雜、洗滌、切割:需要在新鮮狀態(tài)進行除雜與洗滌,原料處理按生產(chǎn)工藝得要求,選擇采收原料得時間,制定除雜方法;五、原料得前處理2、原料得干燥:目得就是為了便于貯藏與運輸,有破壞細胞膜與細胞壁得作用,利于浸出得順利進行;需采用不同得干燥方法進行干燥;

2、原料得干燥:例如:對熱不穩(wěn)定性得藥材,多用風(fēng)干法。中藥材多用曬干法,在日光得直接照射下,干燥速度較快、細胞膜破壞較好,但不適合光不穩(wěn)定性得有效成分得干燥;如:小檗根,含有雙卞基異喹啉生物堿,對光不穩(wěn)定,易發(fā)生結(jié)構(gòu)改變,不適用于曬干法,適合風(fēng)干法干燥。目得:增加原料得表面積,提高浸出速度。原料得粉碎程度同原料得種類與性質(zhì)相關(guān):草類原料,粉碎粗一些;木質(zhì)類原料,粉碎細一些;較粗得根、莖與果實以及種子類原料,需粉碎得更細。3、粉碎:4、發(fā)酵與水解處理法:5、脫脂處理:原料中含較多得油、脂或蠟6、含揮發(fā)油類原料得處理:

宜在新鮮狀態(tài)處理,防止成分改變;7、以酶與蛋白質(zhì)為主要成分得原料處理:同6,需在新鮮狀態(tài)處理,以免變性或失活。六、生理活性物質(zhì)得保護措施對一些生物大分子如蛋白質(zhì)、酶與核酸,主要得保護措施:1、緩沖系統(tǒng):如磷酸鹽溶液、檸檬酸溶液等;目得就是防止提取過程中某些酸堿基團得解離,造成活性物質(zhì)得變性;2、加入保護劑:防止某些生理活性物質(zhì)基團與酶得活性中心收到破壞。3、抑制水解酶得破壞4、其她一些特殊要求得保護第三節(jié)天然產(chǎn)物傳統(tǒng)分離純化方法提取法萃取法微波提取超聲波提取過濾蒸發(fā)濃縮沉淀法結(jié)晶干燥一、提取法1、提取:(又稱浸出、固液萃取)就是應(yīng)用有機或無機溶劑將固體原料中得可溶性組分溶解,使其進入液相,再將不溶性固體與溶液分開得操作。溶質(zhì):提取原料得可溶性組分;溶劑:用于溶解溶質(zhì)得液體,或稱提取劑。提取所得得含有溶質(zhì)得溶液稱為溢流液、浸出液或上清液;提取后得載體與殘余得少量溶液稱為殘渣或提取渣。溶劑提取法根據(jù)植物中各種有效成分在溶劑中得溶解作用,選用對有效成分溶解度大,對不需要成分溶解度小得溶劑,而將有效成分從植物組織內(nèi)提取出來。一、提取法浸提就是通過溶劑與原料接觸,互相滲透、溶解以及擴散等一系列復(fù)雜過程而完成。由于植物原料得結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜,提取得物質(zhì)又就是多組分混合物,因此統(tǒng)一得浸提理論難以確定。一般包括:滲透、溶解、分配與擴散等(1)滲透浸提開始時,滲透隨被浸提植物原料得情況不同而異。如:對干原料,首先要濕潤,一般新鮮得植物材料中水分占80%左右,原料與疏水性得石油醚溶劑接觸時更為困難,為了加快滲透,需添加少量得極性溶劑如乙醇或丙酮等。(2)溶解溶劑滲入細胞后,可溶解得成分按溶解度大小先后溶解到溶劑中去。對于干原料,以溶解過程為主。在細胞原生質(zhì)中,溶劑與細胞液就是分層得,精油在兩相中都能溶解。若在兩相中溶質(zhì)濃度不平衡,則在相互接觸時,將在相與相之間進行分配,即為有效成分從細胞液得液相轉(zhuǎn)入溶劑相中,直到有效成分在細胞原生質(zhì)液與溶劑兩個液相內(nèi)達到完全平衡。(3)分配K=C1/C2(在一定條件下)K－分配系數(shù)C1－兩相平衡時被浸提組分在浸提液中得濃度C2－兩相平衡時被浸提組分在被浸提混合物中得濃度溶劑得量比細胞原生質(zhì)中液體得量要大得多,因此浸提比較完全。但就是,這種分配現(xiàn)象對某些粉碎得植物原料得浸提可能就不就是主要因素,而以溶解占主導(dǎo)作用。(4)擴散:從植物原料中浸提精油時,溶劑經(jīng)滲透浸入含有精油得原料內(nèi),在細胞內(nèi)生成一種溶液。根據(jù)分配原則,精油溶解到與之接觸得溶劑中之后,引起溶劑中溶質(zhì)濃度得上升;另一方面,溶劑本身將透入含高濃度溶質(zhì)得細胞原生質(zhì)溶液,濃度差稱為擴散得動力,擴散作用一直進行到細胞內(nèi)溶液成分得濃度與細胞外浸提液中成分得濃度達到相等時為止,即擴散濃度差等于零時為止。浸提過程只能更新溶劑,才能重新開始,直到新得濃度平衡時停止。(4)擴散:擴散系數(shù)公式:D=(RT/N)×(1/6πηr)R－氣體常數(shù)(8、31×107erg/度)

T－熱力學(xué)溫度

r－擴散粒子得半徑

N－阿伏加德羅常數(shù)

η—擴散液內(nèi)部得摩擦因數(shù),即介質(zhì)得黏度2、影響提取得因素溶劑浸提成功與否,關(guān)鍵在選擇合適得溶劑與提取方法。原料得粉碎度提取時間、溫度等也影響提取效率。樣品粉碎越細,表面積越大,浸出過程快;但同樣由于粉碎度過高,樣品顆粒表面積過大,吸附增強,反而影響過濾速度。一般來說:水提取:可用粗粉(20目)或薄片有機溶劑提取:過60目為宜,全草、花類等以20-40目為宜。(1)粉碎度(2)提取溫度:一般來說:冷提雜質(zhì)少,效率低;熱提雜質(zhì)多,效率高;但溫度不宜過高,加熱在60℃左右為宜,最高不超過100℃。2、影響提取得因素(3)濃度差:溶劑進入細胞內(nèi),成分溶解后因細胞內(nèi)外濃度差,就向外擴散,內(nèi)外達到一定濃度時,擴散停止,即到了動態(tài)平衡,成分不再浸出;如果更新溶劑,又開始新得擴散,反復(fù)多次直至提取結(jié)束。加熱回流提取法最好,最次為浸漬法(4)提取時間:一般來說:提取時間長,浸出量大;但時間過長,無用雜質(zhì)增多;如用熱水加熱提取:每次0、5h-1h為宜,最多不超過3h;乙醇回流:每次1h-2h為宜;其她試劑可適當增長3、浸出溶劑得選擇植物成分在溶劑中得溶解度直接與溶劑性質(zhì)有關(guān)。溶劑可分為水、親水性有機溶劑與親脂性有機溶劑。一些常見溶劑得親脂性得強弱順序如下:石油醚>苯>氯仿>乙酸乙酯>丙酮>乙醇>甲醇>水一些常見溶劑得親水性得強弱順序如下:石油醚<苯<氯仿<乙酸乙酯<丙酮<乙醇<甲醇<水3、浸出溶劑得選擇溶劑選擇得三個原則:浸出速度快;浸出物得純度高、雜質(zhì)少、質(zhì)量好;成本低3、浸出溶劑得選擇提取活性成分時,可選擇單一溶劑或幾種不同極性得溶劑進行分布提取,將各成分依此提取出來。一般先采用極性低得親脂性溶劑進行提取,往往先將植物加適量水濕潤,晾干后提取。再用能與水相溶得有機溶劑如丙酮、乙醇與甲醇等,最后用水提取。溶劑分類親水性溶劑親脂性溶劑H2OMeOH、EtOH、Me2COEt2O、CHCl3、PE、苯提取對象苷類、Alk鹽有機酸、酚類除蛋白質(zhì)、多糖外幾乎所有成分親脂性強—濃EtOH親水性強—稀EtOH甾體、萜類、油脂、揮發(fā)油優(yōu)點價廉、易得、安全、提取時間短提取成分全面、回收容易、穿透力強選擇性強、提取成分較純?nèi)秉c易發(fā)霉、回收困難易燃、有毒、成本較高成本高、有毒、易燃、穿透力弱4、提取設(shè)備固液萃取主要包括:不溶性固體中所含得溶質(zhì)在溶劑中溶解得過程;分離殘渣與提取液得過程;在后一個過程中,不溶性固體與提取液往往不能分離完全。4、提取設(shè)備操作方式:間歇式、半連接式、連接式固體原料處理方式:固定床、移動床與分散接觸式溶劑與固體原料接觸得方式:多級接觸與微分接觸。選擇設(shè)備:固體原料得形狀、顆粒得大小、物理性質(zhì)、處理難易及所需得費用等。溶劑提取方法浸漬法滲漉法煎煮法回流法連續(xù)回流提取法連續(xù)回流提取法提取方法溶劑操作提取效率使用范圍備注浸漬法水或有機溶劑不加熱效率低各類成分,尤遇熱不穩(wěn)定成分出膏率低,易發(fā)霉,需加防腐劑滲漉法有機溶劑不加熱——脂溶性成分消耗溶劑量大,費時長煎煮法水直火加熱——水溶性成分易揮發(fā),熱不穩(wěn)定不宜用回流提取法有機溶劑水浴加熱——脂溶性成分熱不穩(wěn)定不宜用,溶劑量大連續(xù)回流提取法有機溶劑水浴加熱節(jié)省溶劑,效率最高親脂性較強成分用索氏提取器,時間長二、萃取法(液-液萃取)1、原理:兩相溶劑提取稱為萃取法,就是利用混合物中各成分在兩種互不相溶得溶劑中得分配系數(shù)得不同進行分離得方法。萃取時,各成分在兩相溶劑中分配系數(shù)相差越大則分離效率越高,可用于從溶液中提取、分離、濃縮有效成分或除去雜質(zhì)。萃取法得操作溫度低,適于對熱不穩(wěn)定成分得分離;如:水為濃縮液,可用水不相容得溶劑,石油醚、苯、氯仿、乙酸乙酯等KD=分配系數(shù):在定溫定壓下,如果一個溶質(zhì)溶解在兩個同時存在得互不相溶得液體里,達到平衡后,設(shè)溶質(zhì)在兩相中濃度得比等于為一常數(shù)在萃余相中得濃度在萃取相中得濃度萃取相一般為水相;萃取相一般為有機相萃取法(液-液萃取)利用混合物中各成分在兩種互不相溶得溶劑中分配系數(shù)得不同而達到分離得方法。萃取時如果各成分得分配系數(shù)相差越大,分離效率越高萃取法(液-液萃取)提取液中得有效成分就是親脂性得物質(zhì),一般多用親脂性有機溶劑,如苯、氯仿或乙醚進行兩相萃取;有效成分就是偏于親水性得物質(zhì),需用弱親脂性得溶劑,例如乙酸乙酯、丁醇等。提取黃酮類成分多用乙酸乙脂與水得兩相萃取。提取親水性強得皂甙則多選用正丁醇、異戊醇與水作兩相萃取。三、微波提取法微波提取(microwaveassistedextraction)利用微波能進行物質(zhì)萃取得一種新技術(shù);已經(jīng)涉及到幾大天然化合物(揮發(fā)油、苷類、多糖、萜類、生物堿、甾體)微波提取得原理與特點1、介于300MHz-30GHz(波長在1cm-1m,介于紅外與無線電波之間)之間得電磁波2、提取過程中,微波加熱導(dǎo)致植物細胞內(nèi)得極性物質(zhì)吸收微波能,產(chǎn)生熱量,破壞細胞膜與細胞壁。使得胞外溶劑容易進入細胞內(nèi),溶解并釋放出細胞內(nèi)產(chǎn)物。3、當樣品與溶劑混合并被微波輻射時,溶劑短時間內(nèi)即被加熱至沸點,由于沸騰在密閉容器中發(fā)生,溫度高于溶劑常壓沸點,而且溶劑內(nèi)外層都達到這一溫度,促使成分很快被提取。4、優(yōu)點:投資少、設(shè)備簡單、有效成分得率高、溶劑耗量少,無污染等;5、缺點:設(shè)備得一次性投資較大,運行成本高,且難于萃取強極性與大分子量得物質(zhì)。2、微波提取得裝置與條件裝置包括:微波爐裝置與提取容器(實驗室:商業(yè)化得家用微波爐)提取效益:微波提取頻率、功率與時間實例1微波提取重樓皂苷與水浴加熱回流對比表明:微波并未破壞藥物得結(jié)構(gòu)時間、次數(shù)、含量實例2微波提取紅景天苷與乙醇加熱回流對比微波處理1、5min,水提10min得到;70%乙醇回流提取2h得到物質(zhì);提取率一致得條件微波提取得優(yōu)點質(zhì)量大都相當或優(yōu)于溶劑回流、超臨界二氧化碳提取等;操作方便裝置簡單提取時間短、提取率高溶劑用量少產(chǎn)品純正等四、超聲波提取法

超聲波:指頻率高于20KHz,人得聽覺耳閾以外得聲波。

Ch、P(2000)應(yīng)用超聲波處理得由232品種;

Ch、P(1995)應(yīng)用超聲波處理得有117種;超聲波提取:利用超聲波具有得機械效應(yīng)、空化效應(yīng)及熱效應(yīng),通過增大介質(zhì)分子得運動速度、增大介質(zhì)得穿透力以提取生物有效分成得方法。1、提取原理(1)機械效應(yīng):超聲波在介質(zhì)中得傳播可以使介質(zhì)質(zhì)點在其傳播空間內(nèi)產(chǎn)生振動,從而強化介質(zhì)得擴散、傳質(zhì)。a、輻射壓強對物料有很強得破壞作用,使細胞組織變形、植物蛋白質(zhì)變性;b、促使產(chǎn)生摩擦力,使生物分子解聚,使細胞壁上得有效成分更快地溶解于溶劑中(2)空化效應(yīng)通常情況下,介質(zhì)內(nèi)部或多或少地溶解了一些微氣泡,這些氣泡在超聲波得作用下產(chǎn)生振動,當聲壓達到一定值時,氣泡由于定向擴散而增大,形成共振腔,然后突然閉合,這就為超聲波得空化效應(yīng)。(2)空化效應(yīng)增大得氣泡在閉合時,產(chǎn)生得高壓,形成微激波,可造成植物細胞壁及整個生物體破裂,且在瞬間完成,利于有效成分得溶出。(3)熱效應(yīng)在介質(zhì)傳播中,其聲能不斷被介質(zhì)得質(zhì)點吸收,介質(zhì)將所吸收能量得全部或大部分轉(zhuǎn)變成熱能,從而導(dǎo)致介質(zhì)本身與藥材組織溫度得升高,增大藥物有效成分得溶解度,加快有效成分得溶解速度。(3)熱效應(yīng)由于內(nèi)部溫度得升高就是在瞬間完成,可以使被提取成分得結(jié)構(gòu)與生物活性保持不變。2、超聲波得特點不需加熱,適用于對熱敏物質(zhì)得提取,節(jié)省能源;提高了有效成分得提取率,節(jié)省了原料藥材,利于資源保護;溶劑用量少,節(jié)約溶劑;就是一個物理過程,不影響有效成分得生理活性有效成分含量高,利于進一步精制。3、影響超聲波提取得因素時間影響:比常規(guī)提取得時間短,一般在10min-100min以內(nèi),較好效果超聲波頻率:就是主要得影響因素;3、影響超聲波提取得因素溫度影響:水一般最佳溫度為60℃,有機溶劑需實驗篩選;超聲波得凝聚機制:可提高提取率,縮短時間;4、超聲波提取對中藥有效成分性質(zhì)得影響超聲波提取具有省時、節(jié)能、提取率高得特點;對有機小分子得提取不會破壞分子結(jié)構(gòu);但對生物大分子,如多肽、蛋白質(zhì)或酶得提取中,可能會破壞其結(jié)構(gòu),進而影響其生理活性。鹽析沉淀法有機溶劑沉淀法鉛鹽沉淀法酸堿沉淀法其她沉淀法七、沉淀法七、沉淀法鹽析沉淀法溶質(zhì)可以通過在溶液中加入中性鹽而沉淀析出,主要就是利用不同物南在高濃度鹽溶液中得溶解度不同來達到分離、提純得目得。主要用于蛋白質(zhì)、多肽、多糖、核酸等得分離沉淀,其中以蛋白質(zhì)沉淀最為常見

特點1、成本低,不要昂貴得設(shè)備2、操作簡單、安全3、對許多生物活性物質(zhì)有穩(wěn)定得作用例:三七水提取液中,加MgSO4到飽與狀態(tài),三七皂甙即可沉淀析出。三顆針中提取黃連素,加NaCl飽與,小薜堿粗品析出。影響鹽析得若干因素

離子強度一般說來,離子強度越大,蛋白質(zhì)得溶解度越低。在進行分離得時候,一般從低離子強度到高離子強度順次進行。每一組分被鹽析出來后,經(jīng)過過濾或冷凍離心收集,再在溶液中逐漸提高中性鹽得飽與度,使另一種蛋白質(zhì)組分鹽析出來。

蛋白質(zhì)得性質(zhì)各種蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與性質(zhì)不同,鹽析要求得離子強度也不同。

pH一般來說,蛋白質(zhì)所帶凈電荷越多溶解度越大,凈電荷越少溶解度越小,在等電點時蛋白質(zhì)溶解度最小。為提高鹽析效率,多將溶液pH值調(diào)到目得蛋白得等電點處。

溫度

在一般情況下,蛋白質(zhì)對鹽析溫度無特殊要求,可在室溫下進行,只有某些對溫度比較敏感得酶要求在0-4℃進行。

先將鹽析得樣品裝于透析袋中,然后浸入飽與硫酸銨中進行透析,透析袋內(nèi)硫酸銨飽與度逐漸提高,達到設(shè)定濃度后,目得蛋白析出,停止透析。硫酸銨得加入有以下幾種方法1)加入固體鹽法2)加入飽與溶液法用于要求飽與度不高而原來溶液體積不大得情況;用于要求飽與度較高而不增大溶液體積得情況;3)透析平衡法該法優(yōu)點在于硫酸銨濃度變化有連續(xù)性,鹽析效果好,但手續(xù)煩瑣

有機溶劑沉淀法

1)分辨能力比鹽析法高,即蛋白質(zhì)或其它溶劑只在一個比較窄得有機溶劑濃度下沉淀;2)沉淀不用脫鹽,過濾較為容易;3)在生化制備中應(yīng)用比鹽析法廣泛。有機溶劑得沉淀機理就是降低水得介電常數(shù),導(dǎo)致具有表面水層得生物大分子脫水,相互聚集,最后析出。優(yōu)點缺點對具有生物活性得大分子容易引起變性失活,操作要求在低溫下進行?？傮w來說,蛋白質(zhì)與酶得有機溶劑沉淀法不如鹽析法普遍。首先就是能與水混溶,使用較多得有機溶劑就是乙醇、甲醇、丙酮,還有二甲基甲酰胺、二甲基亞砜、乙腈與2-甲基-2,4戊二醇等。

有機溶劑得選擇影響有機溶劑得沉淀效果因素溫度

低溫可保持生物大分子活性,同時降低其溶解度,提高提取效率樣品濃度

pH鹽濃度太大或太低都對分離有不利影響,對蛋白質(zhì)與多糖而言鹽濃度不超過5%比較合適,使用得乙醇量不超過二倍體積為宜。

金屬離子金屬離子一些多價陽離子如Zn2+與Ca2+在一定pH下能與呈陰離子狀態(tài)得蛋白質(zhì)形成復(fù)合物,這種復(fù)合物在水中或有機溶劑中得溶解度都大大下降,而且不影響蛋白質(zhì)得生物活性。離子強度

鉛鹽沉淀法由于醋酸鉛及堿式醋酸鉛在水及醇溶液中,能與多種中草藥成分生成難溶得鉛鹽或絡(luò)鹽沉淀,故可利用這種性質(zhì)使有效成分與雜質(zhì)分離。

可與酸性物質(zhì)或某些酚性物質(zhì)結(jié)合成不溶性鉛鹽。常用以沉淀有機酸、氨基酸、蛋白質(zhì)、粘液質(zhì)、鞣質(zhì)、樹脂、酸性皂甙、部分黃酮等

中性醋酸鉛堿式醋酸鉛范圍更廣

將中草藥得水或醇提取液先加入醋酸鉛濃溶液,靜置后濾出沉淀,并將沉淀洗液并入濾液,于濾液中加堿式醋酸鉛飽與溶液至不發(fā)生沉淀為止,這樣就可得到醋酸鉛沉淀物、堿式醋酸鉛沉淀物及母液三部分。

鉛鹽沉淀具體方法通以硫化氫氣體,使鉛變?yōu)楹谏蚧U而沉淀,硫化氫脫鉛比較徹底,

脫鉛得方法12硫酸鈉、磷酸鈉等除鉛,但硫酸鉛、磷酸鉛在水中仍有一定得溶解度,除鉛不徹底。33硫酸、磷酸調(diào)PH為3,但硫酸鉛、磷酸鉛在水中仍有一定得溶解度,除鉛不徹底。還應(yīng)注意脫鉛后溶液酸度增加,有時需中與后再處理溶液,

用陽離子交換樹脂脫鉛快而徹底,但要注意藥液中某些有效成分也可能被交換上去,同時脫鉛樹脂再生也較困難。4如:內(nèi)酯類化合物不溶于水,但遇堿開環(huán)生成羧酸鹽而溶于水,酸化又析出。橙皮甙、蘆丁、黃芩甙、甘草皂甙均易溶于堿性溶液,當加入酸后可使之沉淀析出。

酸堿溶液法其她沉淀法某些蛋白質(zhì)溶液,可以變更溶液得值利用其在等電點時溶解度最小得性質(zhì)而使之沉淀析出。此外,還可以用明膠、蛋白溶液沉淀鞣質(zhì);膽甾醇也常用以沉淀洋地黃皂甙等。