DB22-T2050-2014-動(dòng)物源性飼料中豬源性成分測(cè)定實(shí)時(shí)熒光PCR方法-吉林省

ICS65.120B46DB22吉林省地方標(biāo)準(zhǔn)DB22/T2050—2014動(dòng)物源性飼料中豬源性成分測(cè)定實(shí)時(shí)熒光PCR方法Determinationofporcinederivedmaterialsinanimal-originatedfeedstuffsReal-timePCRmethod吉林省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布DB22/T2050—2014前言本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2001給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由吉林省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草單位：吉林省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院、國(guó)家農(nóng)業(yè)深加工產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心、中華人民共和國(guó)吉林出入境檢驗(yàn)檢疫局。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：史艷宇、劉金華、華蕾、王瀟、亓?xí)云G、王穎、冷喜芳、吳桐、陳穎。IDB22/T2050—2014動(dòng)物源性飼料中豬源性成分測(cè)定實(shí)時(shí)熒光PCR方法1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了動(dòng)物源性飼料中豬源性成分的實(shí)時(shí)熒光PCR檢驗(yàn)方法，該方法的檢出限為0.1%。本標(biāo)準(zhǔn)適用于動(dòng)物源性飼料中豬源性成分的定性檢測(cè)。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T27403實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品分子生物學(xué)檢測(cè)3術(shù)語和定義豬源性成分porcine-derivedmaterials豬種屬特異性DNA片段。實(shí)時(shí)熒光PCRrealtimePCR實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。Ct值cyclethresholdvalue每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。對(duì)樣品進(jìn)行DNA提取，通過實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，觀察實(shí)時(shí)熒光PCR的增幅曲線，檢測(cè)飼料中豬源性除特別說明以外，所有試劑均為分析純，水為按照GB/T6682規(guī)定的一級(jí)水。所有試劑均用無DNA酶污染的容器分裝。1DB22/T2050—20145.1引物和探針a)b)c)上游引物：5’-CATGCGTATCACCACCATTATATC-3’下游引物：5’-TGCCAAGCGGGTTGCT-3’探針：FAM-CGAGCTTAACTACCATGCCGCGTGA–TAMRA5.2TaqDNA聚合酶。5.3dNTP：dATP（deoxyadenosinetriphosphate，脫氧腺苷三磷酸）、dGTP（deoxycytidinetriphosphate，脫氧鳥苷三磷酸）、dCTP（deoxycytidinetriphosphate，脫氧胞苷三磷酸）、dTTP（deoxythymidinetriphosphate，脫氧胸苷三磷酸）。5.4動(dòng)物基因組DNA提取純化試劑盒。5.5RNaseA酶：凍干品，不含DNase。5.6蛋白酶K：凍干品。5.775%乙醇、異丙醇、三氯甲烷、異戊醇、正己烷等有機(jī)試劑。5.8Tris飽和苯酚。5.9三羥甲基氨基甲烷（Tris）。5.10三水合乙酸鈉、氯化鈉。5.11十六烷基三甲基溴化銨（cetyltrithylammoniumbromide，CTAB）。5.12乙二胺四乙酸二鈉鹽（EDTA-Na2·2H2O）。5.14RNaseA酶溶液：用高壓滅菌的去離子水溶解RNaseA酶為10g/L的溶液，分裝后于-20℃保存，避免反復(fù)凍融。5.15蛋白酶K溶液：用高壓滅菌的去離子水溶解蛋白酶K為20mg/mL的溶液，分裝后于-20℃保存，避免反復(fù)凍融。5.16乙酸鈉溶液，3mol/L：在80mL水中，加入40.81g三水合乙酸鈉，溶解后用冰乙酸調(diào)節(jié)pH值到5.2，用水定容到100mL，分裝后高壓滅菌。5.17Tris-HCl，1mol/L，pH8.0：在800mL去離子水中溶解121.1gTris，冷卻至室溫后用濃鹽酸調(diào)節(jié)溶液的pH值至8.0，加水定容至1L，分裝后高壓滅菌。5.20CTAB提取緩沖液II：在800mL去離子水中加入46.75g氯化鈉，20gCTAB，完全溶解后加入1mol/LTris-HCl（pH8.0）50mL，0.5mol/LEDTA（pH8.0）20mL，用水定容至1L，分裝后高壓滅菌。5.21Tris飽和苯酚和三氯甲烷混合液，V(Tris飽和苯酚)+V(三氯甲烷)=1+1。5.22三氯甲烷和異戊醇混合液，V(三氯甲烷)+V(異戊醇)=24+1。2DB22/T2050—20146.1實(shí)時(shí)熒光PCR儀。6.2生物安全柜。6.3離心機(jī)：轉(zhuǎn)速≥12000r/min。6.4核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計(jì)。6.5高壓滅菌器。6.6恒溫水浴鍋。6.7移液器：0.5μL～10μL、10μL～100μL、20μL～200μL、200μL～1000μL。6.8pH計(jì)。6.9振蕩器。7檢測(cè)步驟7.1試樣的預(yù)處理50g固體樣品粉碎，顆粒大小在0.125mm以下。7.2DNA提取和純化7.2.1CTAB法制備非油脂類飼料模板DNA稱取100mg粉碎后的樣品于1.5mL離心管中，加入300μL冰上預(yù)冷的CTAB提取緩沖液I，加入500μL于65℃預(yù)熱的CTAB提取緩沖液II，混勻，65℃保溫30min～90min，期間不時(shí)輕緩顛倒混勻；加入5μL～25μL蛋白酶K溶液，上下倒轉(zhuǎn)混勻，37℃水浴中保溫1h，中途每隔10min左右倒轉(zhuǎn)混合數(shù)次；待冷卻至室溫后加入5μLRNaseA溶液（10mg/mL)，室溫下放置30min；室溫12000r/min離心10min，取上清液，于另一干凈的2mL離心管中，分別用等體積Tris飽和苯酚、Tris飽和苯酚+三氯甲烷（1+1）和三氯甲烷+異戊醇（24+1）抽提三次，12000r/min離心10min；將上清液轉(zhuǎn)移至干凈的2mL離心管中，加入等體積異丙醇及1/10體積的3mol/L乙酸鈉溶液，輕緩顛倒混勻；12000r/min離心10min，棄上清液，用500μL75%乙醇洗滌沉淀兩次；除去殘留的乙醇，干燥后，DNA沉淀溶解于100μLTE緩沖液（預(yù)先加熱至65℃有利于溶解DNA）中，-20℃保存?zhèn)溆谩?.2.2CTAB法制備油脂類飼料模板DNA取油脂飼料適量（液態(tài)油取30mL、磷脂類和固態(tài)油脂取5g）放入250mL三角瓶中，加入25mL正己烷，于磁力攪拌器上不斷振蕩混合2h后，加入25mLCTAB提取緩沖液II，繼續(xù)于磁力攪拌器上振蕩混合2h；將溶液轉(zhuǎn)入100mL離心管中，于8000r/min離心10min，使有機(jī)相和水相分離，取下層水相，加入與下層水相溶液等體積的異丙醇及水相溶液1/10體積的3mol/L乙酸鈉溶液，輕緩顛倒混勻，室溫放置10min；12000r/min離心10min，棄上清液，待沉淀干燥后用200μLTE緩沖液溶解沉淀，加入200μLTris飽和苯酚+三氯甲烷（1+1），輕緩顛倒混勻溶液；12000r/min離心10min，取上清液，加入與上清液等體積三氯甲烷+異戊醇（24+1），輕緩顛倒混勻，12000r/min離心2min至分層；將上清液轉(zhuǎn)移至干凈的離心管中，加入與溶液等體積的異丙醇及溶液1/10體積的3mol/L乙酸鈉溶液，輕緩顛倒混勻；室溫放置10min后，12000r/min離心10min，棄上清液后，依次加入800μL體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇和100μL體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇洗滌沉淀；12000r/min離心5min，除乙醇溶液；待沉淀干燥后，DNA沉淀溶解于100μLTE緩沖液（預(yù)先加熱至65℃有利于溶解DNA）中，-20℃保存?zhèn)溆谩?DB22/T2050—2014注：DNA提取和純化過程應(yīng)用水作為核酸提取空白對(duì)照。7.3DNA濃度和純度的測(cè)定取10μLDNA溶液加蒸餾水稀釋至1mL，使用核酸蛋白儀或紫外分光光度計(jì)分別檢測(cè)260nm和280nm處的吸光值。DNA的濃度按照式（1）計(jì)算，當(dāng)A260/A280比值在1.5～2.1之間時(shí)，適宜于PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增前將所有樣品DNA調(diào)至10ng/μL～50ng/μL。c=A′N′501000.............................................................................................(1)式中：c——DNA濃度，單位為納克每微升（ng/μL）；A——260nm處的吸光值；N——核酸稀釋倍數(shù)。7.4實(shí)時(shí)熒光PCR檢驗(yàn)7.4.1實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系見表1。每個(gè)樣品設(shè)置2個(gè)平行。表1實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系試劑加入量（μL）95℃預(yù)變性2min，95℃變性10s，60℃退火延伸1min，同時(shí)收集FAM熒光，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，反應(yīng)產(chǎn)物可在4℃保存。不同儀器、不同TaqDNA聚合酶可根據(jù)要求將反應(yīng)條件做適當(dāng)調(diào)整。檢測(cè)過程中設(shè)置PCR擴(kuò)增空白對(duì)照、陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照。用已知含有豬源性成分的樣品DNA作陽(yáng)性對(duì)照，用已知不含有豬源性成分的樣品DNA作陰性對(duì)照，用等體積的滅菌去離子水代替模板DNA作空白對(duì)照。4DB22/T2050—2014——陰性對(duì)照：無擴(kuò)增曲線，Ct值≥40.0；——陽(yáng)性對(duì)照：出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，Ct值應(yīng)≤35.0；否則，視為無效。8.2結(jié)果判定和報(bào)告：——Ct值≥40.0，可判定樣品不含有豬源性