《植物組織培養(yǎng)》課件 模塊三-2 無(wú)菌操作技術(shù)

項(xiàng)目三

無(wú)菌操作技術(shù)任務(wù)三外植體的選擇與處理任務(wù)二無(wú)菌操作技術(shù)任務(wù)一虛擬無(wú)菌操作任務(wù)二無(wú)菌操作技術(shù)知識(shí)目標(biāo)理解有菌和無(wú)菌的范疇；掌握常用的滅菌方法；掌握無(wú)菌操作過(guò)程。

123掌握組織培養(yǎng)相關(guān)的滅菌方法；熟練掌握無(wú)菌操作技術(shù)；12

滅菌和接種

任務(wù)講解滅菌和接種一、滅菌二、無(wú)菌操作三、接種第一節(jié)滅菌和接種

滅菌是組織培養(yǎng)重要的工作之一。初學(xué)者首先要清楚有菌和無(wú)菌的范疇。有菌的范疇是：凡是暴露在空氣中的物體，接觸自然水源的物體，至少它的表面都是有菌的。無(wú)菌室等未經(jīng)處理的地方、超凈臺(tái)表面、簡(jiǎn)單煮沸的培養(yǎng)基、我們使用的刀、剪在未處理之前、我們身體的整個(gè)外表及與外界相連的內(nèi)表，如整個(gè)消化道、呼吸道，即我們呼出的氣體、培養(yǎng)容器無(wú)論洗得多干凈等等都是有菌的。滅菌和接種第一節(jié)滅菌和接種

這里所指的菌，包括細(xì)菌、真菌、放線菌、藻類(lèi)及其他微生物。茵的特點(diǎn)是：極小，肉眼看不見(jiàn)。無(wú)處不在，無(wú)時(shí)不有，無(wú)孔不人。在自然條件下忍耐力強(qiáng)，生活條件要求簡(jiǎn)單，繁殖力極強(qiáng)，條件適宜時(shí)便可大量滋生。滅菌和接種第一節(jié)滅菌和接種

無(wú)菌的范疇是：經(jīng)高溫灼燒或一定時(shí)間蒸煮過(guò)后的物體，經(jīng)其他物理的或化學(xué)的滅菌方法處理后的物體(當(dāng)然這些方法必須已經(jīng)證明是有效的)，高層大氣、巖石內(nèi)部、健康的動(dòng)、植物的不與外部接觸的組織內(nèi)部，強(qiáng)酸強(qiáng)堿，化學(xué)元素滅菌劑等表面和內(nèi)部等等都是無(wú)菌的。滅菌和接種第一節(jié)滅菌和接種消毒：殺死、消除或抑制部分微生物，使之不發(fā)生作用。滅菌：用物理或化學(xué)方法，殺死物體表面和孔隙內(nèi)一切微生物或生物體，即所有生命的物質(zhì)全部殺死。滅菌和消毒的區(qū)別是什么？一、滅菌滅菌和接種滅菌概念1.培養(yǎng)基滅菌◆高壓濕熱滅菌◆某些激素、維生素采用過(guò)濾滅菌視頻3-1培養(yǎng)基滅菌自動(dòng)高壓濕熱滅菌鍋1電源水位指示燈溫度、壓力顯示窗溫度壓力設(shè)置鈕壓力表放汽閥滅菌鍋1臥式滅菌鍋2臥式滅菌鍋2臥式滅菌鍋結(jié)構(gòu)

過(guò)濾滅菌濾膜?0.45um以下1.過(guò)濾器先滅菌，滅菌溫度不超過(guò)121℃。2.溶液先進(jìn)行初濾(濾膜?0.65um)過(guò)濾滅菌

培養(yǎng)基高壓蒸汽滅菌所必需的最少時(shí)間容器體積(mL)121℃滅菌所需最少時(shí)間(min)20-501575-15020250-50025100030高壓蒸汽滅菌2.玻璃器皿滅菌◆干熱滅菌：160-180℃,1.5-2.0h◆濕熱滅菌：121℃,20-40min◆接種前用酒精棉球擦試，并在酒精燈火焰上灼燒滅菌。3.接種工具滅菌◆用前干熱滅菌：160～180℃,1.5～2.0h◆用前濕熱滅菌：121℃,20～30min◆接種前用酒精棉球擦試，浸入95%酒精液中，并在酒精燈火焰上灼燒滅菌?！魸駸釡缇?21℃，20～30min◆實(shí)驗(yàn)服滅菌后置于緩沖間或密封好。4.實(shí)驗(yàn)服、口罩、濾紙滅菌4.實(shí)驗(yàn)服、口罩、濾紙滅菌5.接種室滅菌紫外燈照射(接種室、超凈臺(tái)、接種箱)：波長(zhǎng)260nm，距離小于1.2m，15～20min。臭氧滅菌機(jī)：1～2h熏蒸滅菌：2ml/m3甲醛+0.2g/m3

高錳酸鉀；冰醋酸；1～3%高錳酸鉀或3%來(lái)蘇兒。

接種臺(tái)噴霧消毒：75%酒精。

◆用化學(xué)滅菌劑消毒◆常用化學(xué)滅菌劑6.接種材料滅菌視頻3-2

接種材料滅菌水洗莖尖選取酒精滅菌氯化汞滅菌無(wú)菌水沖洗接種滅菌圖示常用滅菌劑的使用濃度與效果比較滅菌劑使用濃度持續(xù)時(shí)間去除難易效果次氯酸鈣9-10%5-30min易很好次氯酸鈉2%5-30min易很好氯化汞0.1-1%5-8min較難最好抗菌素4-50mg/L30-60min中較好滅菌劑的使用濃度與效果8.培養(yǎng)室滅菌新建培養(yǎng)室用前一定要徹底熏蒸1次；隔2-5天用洗衣粉水或來(lái)蘇水拖地1次，用高錳酸鉀擦架1次。

熏蒸滅菌：

2ml/m3甲醛+0.2g/m3

高錳酸鉀二、無(wú)菌操作

接種時(shí)由于有一個(gè)敞口的過(guò)程，所以是極易引起污染的時(shí)期，這一時(shí)期主要由空氣中的細(xì)菌和工作人員本身引起，接種室要嚴(yán)格進(jìn)行空間消毒。接種室內(nèi)保持定期用1%～3%的高錳酸鉀溶液對(duì)設(shè)備、墻壁、地板等進(jìn)行擦洗。視頻3-3無(wú)菌操作

除了使用前用紫外線和甲醛滅菌外，還可在使用期間用70%的酒精或3%的來(lái)蘇兒噴霧，使空氣中灰塵顆粒沉降下來(lái)。無(wú)菌操作可按以下步驟進(jìn)行：(1)在接種4h前用甲醛熏蒸接種室，并打開(kāi)其內(nèi)紫外燈進(jìn)行滅菌；(2)在接種前20min，打開(kāi)超凈工作臺(tái)的風(fēng)機(jī)以及臺(tái)上的紫外燈；(3)接種員先洗凈雙手，在緩沖間換好專(zhuān)用實(shí)驗(yàn)服，并換穿拖鞋等；(4)上工作臺(tái)后，用酒精棉球擦拭雙手，特別是指甲處。然后擦拭工作臺(tái)面；(5)先用酒精棉球擦拭接種工具，再將鑷子和剪子從頭至尾過(guò)火一遍，然后反復(fù)過(guò)火尖端處，對(duì)培養(yǎng)皿要過(guò)火烤干；(6)接種時(shí)，接種員雙手不能離開(kāi)工作臺(tái)，不能說(shuō)話、走動(dòng)和咳嗽等；(7)接種完畢后要清理干凈工作臺(tái)，可用紫外燈滅菌30min。注：若連續(xù)接種，每5天要大強(qiáng)度滅菌一次。三、接種三、接種三、接種滅菌和無(wú)菌操作是組織培養(yǎng)的關(guān)鍵，在各環(huán)節(jié)中都要保持無(wú)菌的環(huán)境；滅菌的方法很多，要根據(jù)材料和目的來(lái)選擇