《實驗室常用培養(yǎng)基制備方法》課件

實驗室常用培養(yǎng)基制備方法微生物培養(yǎng)基是微生物學實驗室的基礎，為微生物生長提供必要的營養(yǎng)和環(huán)境條件。正確制備培養(yǎng)基是確保實驗成功的關鍵步驟。本課程將詳細介紹各類培養(yǎng)基的組成、分類、制備方法及應用場景。培養(yǎng)基基本概述培養(yǎng)基定義培養(yǎng)基是指能夠滿足微生物生長繁殖所需營養(yǎng)物質的人工配制的混合物。它為微生物提供碳源、氮源、能量來源、無機鹽類、生長因子等必需營養(yǎng)素，并維持適宜的pH值、滲透壓等生理條件。主要作用培養(yǎng)基作為微生物的"食物"和"住所"，不僅提供生長所需的各種營養(yǎng)物質，還創(chuàng)造適宜的生長環(huán)境。它是分離純化微生物、研究微生物形態(tài)結構、生理生化特性、遺傳變異等重要研究工具。微生物培養(yǎng)基礎條件培養(yǎng)基的分類按成分分類合成培養(yǎng)基：完全由化學純品配制，成分明確非合成培養(yǎng)基：含有天然成分，精確組成未知半合成培養(yǎng)基：合成與非合成成分混合配制按物理狀態(tài)分類液體培養(yǎng)基：不含固化劑半固體培養(yǎng)基：含0.2-0.5%瓊脂固體培養(yǎng)基：含1.5-2.0%瓊脂按用途分類普通培養(yǎng)基：適合大多數非苛養(yǎng)微生物選擇性培養(yǎng)基：抑制非目標菌生長鑒別培養(yǎng)基：可區(qū)分不同類型微生物富集培養(yǎng)基：促進特定微生物生長合成培養(yǎng)基簡介成分已知且可控合成培養(yǎng)基由化學純品組成，各組分的種類和含量完全已知且可精確控制。常用化合物包括葡萄糖、氯化鈉、硫酸銨、磷酸鹽等。這種精確控制使研究人員能夠調整特定組分，研究其對微生物生長的影響。適用范圍合成培養(yǎng)基主要用于特定的營養(yǎng)需求研究、酶活性測定、代謝途徑分析等精確實驗。由于成分單一明確，特別適合研究微生物的最小營養(yǎng)需求和代謝特性。典型應用非合成培養(yǎng)基簡介20-30%蛋白胨含量LB培養(yǎng)基中的典型含量范圍，為微生物提供氮源和氨基酸0.5%酵母提取物提供B族維生素和氨基酸等生長因子0.5-1%牛肉膏濃度提供肉類提取物中的氨基酸、脂肪酸和礦物質3-10種未知組分數量非合成培養(yǎng)基中典型的未知化學成分數量非合成培養(yǎng)基由天然成分組成，如牛肉膏、蛋白胨、酵母提取物等，其精確化學組成未完全確定。代表性培養(yǎng)基包括LB培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基等，這些培養(yǎng)基富含氨基酸、維生素、微量元素等營養(yǎng)成分，能滿足大多數微生物的生長需求。非合成培養(yǎng)基的優(yōu)點是配制簡單，營養(yǎng)豐富，適用于常規(guī)細菌培養(yǎng)和分離。然而，由于成分不完全確定，批次間可能存在差異，不適合精確的營養(yǎng)研究。半合成培養(yǎng)基簡介基本概念半合成培養(yǎng)基是合成培養(yǎng)基和非合成培養(yǎng)基的組合，既含有已知的化學成分，也含有天然提取物常見組成通常含有葡萄糖等已知化合物，同時添加酵母提取物、蛋白胨等天然成分適用范圍廣泛用于真菌、放線菌及苛養(yǎng)型細胞培養(yǎng)，平衡了營養(yǎng)需求與組分確定性優(yōu)勢特點兼具合成培養(yǎng)基的可控性和非合成培養(yǎng)基的營養(yǎng)豐富性，滿足特殊培養(yǎng)需求半合成培養(yǎng)基在生物技術、藥物篩選和發(fā)酵工業(yè)中應用廣泛。例如，YPD培養(yǎng)基（酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖）是酵母培養(yǎng)的經典半合成培養(yǎng)基，而改良的Sabouraud葡萄糖瓊脂則廣泛用于真菌培養(yǎng)。這類培養(yǎng)基既能滿足特定微生物的營養(yǎng)需求，又保持了一定的組分可控性。培養(yǎng)基的基本組成水基礎溶劑，通常使用蒸餾水或去離子水碳源葡萄糖、乳糖、麥芽糖、淀粉等3氮源蛋白胨、酵母提取物、硝酸鹽、氨鹽等無機鹽和微量元素磷酸鹽、硫酸鹽、鈣、鎂等生長因子和添加劑維生素、血清、抗生素、pH指示劑等培養(yǎng)基中的碳源主要以糖類形式提供，為微生物提供能量和碳骨架。氮源則用于合成蛋白質和核酸，可以是有機氮（如蛋白胨）或無機氮（如銨鹽）。無機鹽提供細胞代謝所需的各種離子，而微量元素則參與多種酶的活性中心組成。對于苛養(yǎng)型微生物，可能需要額外添加多種生長因子，如維生素、氨基酸、核酸前體等。培養(yǎng)基的pH緩沖系統和滲透壓調節(jié)也是保證微生物正常生長的重要因素?；A培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基介紹蛋白胨酵母提取物氯化鈉瓊脂(固體培養(yǎng)基)水LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)基是最常用的細菌培養(yǎng)基之一，特別適合大腸桿菌等腸桿菌科細菌的培養(yǎng)。LB培養(yǎng)基中的蛋白胨提供氨基酸、短肽和無機鹽，是主要的氮源；酵母提取物提供維生素B族和微量元素；氯化鈉則維持適宜的滲透壓。LB培養(yǎng)基具有營養(yǎng)豐富、配制簡單、價格經濟等優(yōu)點，適用于細菌的常規(guī)培養(yǎng)、基因克隆和蛋白質表達等實驗。標準LB培養(yǎng)基的pH值通常在7.0-7.2之間，可根據實驗需要進行調整。LB培養(yǎng)基制備流程原料稱量精確稱量各組分：10g蛋白胨、5g酵母提取物、5g氯化鈉（1L用量）溶解混合將稱量好的粉末溶于800ml蒸餾水中充分攪拌至完全溶解pH調整用NaOH或HCl調節(jié)pH至7.0-7.2，然后加水至1000ml滅菌處理121℃高壓蒸汽滅菌15-20分鐘，冷卻至約50℃后使用制備LB固體培養(yǎng)基時，在上述步驟2后加入15g瓊脂，混合后再進行pH調整和滅菌。滅菌后的液體培養(yǎng)基應在無菌條件下保存，固體培養(yǎng)基則需倒入培養(yǎng)皿中，待凝固后倒置保存。典型的1LLB培養(yǎng)基可制作約40-50個標準平板。注意事項：瓊脂粉末不易溶解，需要加熱至完全溶解；高壓滅菌時不要超過規(guī)定時間，以免培養(yǎng)基褐變；倒平板時要在超凈工作臺下操作，防止污染。LB固體與液體培養(yǎng)基區(qū)別特性LB液體培養(yǎng)基LB固體培養(yǎng)基瓊脂添加不添加添加1.5-2.0%物理狀態(tài)流動液體凝固半透明固體菌體生長方式懸浮生長，渾濁狀態(tài)表面形成可分離的菌落適用實驗大量培養(yǎng)、搖瓶發(fā)酵、過夜培養(yǎng)菌落分離、克隆篩選、平板計數通氣條件需要充分搖動以提供氧氣表面自然接觸空氣接種方式直接添加菌液涂布、畫線或倒平板法LB液體培養(yǎng)基適合大量繁殖細菌，通常用于制備感受態(tài)細胞、提取質粒和蛋白質表達。實驗室常用錐形瓶盛裝液體培養(yǎng)基，在搖床上培養(yǎng)以增加通氣。而LB固體培養(yǎng)基能夠將不同菌株分離成獨立菌落，便于觀察菌落形態(tài)、進行菌落計數或挑取單克隆。固體培養(yǎng)基制備時需特別注意均勻倒板和無菌操作，以確保平板質量。PDA（馬鈴薯葡萄糖瓊脂）培養(yǎng)基主要成分PDA培養(yǎng)基的主要成分包括馬鈴薯提取物、葡萄糖和瓊脂。馬鈴薯提取物提供豐富的維生素和微量元素，葡萄糖作為碳源，瓊脂作為固化劑。這三者的組合為真菌提供了理想的生長環(huán)境。適用范圍PDA培養(yǎng)基主要用于真菌的分離培養(yǎng)，尤其適合酵母菌和絲狀真菌的生長。其酸性環(huán)境（pH5.6±0.2）有助于抑制大多數細菌生長，使真菌能夠優(yōu)先繁殖。在植物病理學、食品微生物學和環(huán)境微生物學中應用廣泛。配比說明標準配方為每升含200g馬鈴薯提取物（由馬鈴薯煮汁制得）、20g葡萄糖和15-20g瓊脂。商業(yè)化PDA粉末通常以干燥形式提供，使用時按39g/L的比例與水混合即可。pH值一般調整至5.6左右，有利于真菌生長。PDA培養(yǎng)基上的真菌菌落通常表現出豐富的形態(tài)特征和色素產生，這有助于真菌的初步鑒定。許多真菌在PDA上能夠形成典型的孢子結構，這對于真菌分類學研究非常有價值。PDA培養(yǎng)基制備方法土豆處理將200g去皮土豆切塊，煮沸30分鐘后過濾收集煮液添加葡萄糖向煮液中加入20g葡萄糖充分溶解加入瓊脂加入15-20g瓊脂，加熱至完全溶解定容調pH加水至1000ml，調pH至5.6±0.2制備完成的PDA培養(yǎng)基需要在121℃下高壓滅菌15-20分鐘。滅菌后，待培養(yǎng)基冷卻至約50℃時，可根據需要添加抗生素（如氯霉素或鏈霉素）以抑制細菌生長。然后在無菌條件下將培養(yǎng)基倒入無菌培養(yǎng)皿中，待凝固后倒置保存。注意事項：土豆煮液的質量對培養(yǎng)基效果有重要影響，應選用新鮮土豆；避免培養(yǎng)基過度加熱導致糖焦化；制備過程中注意保持器具清潔，防止雜菌污染；商品化PDA粉末可直接按說明書配制，操作更為簡便。NA（營養(yǎng)瓊脂）培養(yǎng)基標準組成配方NA培養(yǎng)基是一種簡單而通用的細菌培養(yǎng)基，其標準配方包括：牛肉提取物3g/L、蛋白胨5g/L、氯化鈉5g/L和瓊脂15g/L。這種配方提供了細菌生長所需的基本營養(yǎng)物質，使其成為微生物學教學和研究中最常用的基礎培養(yǎng)基之一。pH與物理特性標準NA培養(yǎng)基的pH值在7.0-7.4之間，適合大多數非苛養(yǎng)型細菌生長。培養(yǎng)基呈淡黃色透明狀態(tài)，滅菌后倒板凝固形成光滑半透明的表面。其瓊脂含量（1.5%）提供了適當的硬度，便于細菌在表面形成分離的菌落。應用范圍NA培養(yǎng)基廣泛用于非苛養(yǎng)型細菌的常規(guī)培養(yǎng)、分離和保存，特別適用于菌落計數實驗、細菌形態(tài)觀察和初步分離鑒定。由于其成分簡單，不含選擇性或鑒別性成分，適合作為基礎培養(yǎng)基使用，也常作為其他選擇性或鑒別性培養(yǎng)基的基礎組分。雖然NA培養(yǎng)基適用于大多數常見細菌，但對于生長緩慢或有特殊營養(yǎng)需求的細菌（如乳酸菌、支原體等），可能需要添加額外的生長因子或使用更為復雜的培養(yǎng)基。在臨床和環(huán)境微生物學研究中，NA常作為初篩培養(yǎng)基，后續(xù)再轉移到特異性培養(yǎng)基上進行進一步鑒定。NA培養(yǎng)基操作流程稱量原料準確稱取牛肉提取物3g、蛋白胨5g、NaCl5g、瓊脂15g溶解混合將原料溶于800ml蒸餾水中，加熱攪拌至完全溶解調整pH用NaOH或HCl調節(jié)pH至7.2±0.2，加水至1000ml滅菌倒板121℃滅菌15分鐘，冷卻至45-50℃后倒入培養(yǎng)皿NA培養(yǎng)基制備過程相對簡單，但仍需注意幾個關鍵點：溶解時應充分加熱以確保瓊脂完全溶解；pH值調整應在瓊脂溶解后進行；滅菌溫度和時間需嚴格控制，過度滅菌會導致瓊脂降解；倒板時培養(yǎng)基溫度不宜過高，以免損傷培養(yǎng)皿或產生過多冷凝水。實驗室應用中，NA培養(yǎng)基常用于細菌總數計數、環(huán)境微生物監(jiān)測和微生物學教學實驗。其簡單的配方和制備流程使其成為微生物學實驗室的基礎培養(yǎng)基。為延長保存期，制備好的NA平板應倒置保存在4℃環(huán)境中，避免光照和干燥。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基是一種經典的非合成培養(yǎng)基，主要由牛肉膏、蛋白胨和氯化鈉組成。牛肉膏是從新鮮牛肉中提取的水溶性物質，富含氨基酸、肽類、核苷酸、有機酸、維生素和礦物質，為細菌生長提供豐富營養(yǎng)。蛋白胨則是蛋白質經酶解后產生的混合物，含有各種氨基酸和小分子肽，是細菌合成蛋白質的良好底物。標準配方通常為：牛肉膏3g/L、蛋白胨10g/L、氯化鈉5g/L，固體培養(yǎng)基還需添加15-18g/L瓊脂。這種培養(yǎng)基pH中性（7.2-7.4），適合大多數非苛養(yǎng)型細菌生長。由于其成分簡單且營養(yǎng)豐富，被廣泛用于細菌的常規(guī)培養(yǎng)、菌種保存和細菌計數等實驗。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基制作材料準備與溶解在1000ml燒杯中加入約800ml蒸餾水，加熱至微沸。按比例加入牛肉膏（3g）、蛋白胨（10g）和氯化鈉（5g），攪拌至完全溶解。對于固體培養(yǎng)基，同時加入15-18g瓊脂，持續(xù)加熱攪拌直至瓊脂完全溶解，溶液變?yōu)槌吻鍫顟B(tài)。pH調整與定容使用pH計測量溶液的pH值，用1mol/L氫氧化鈉溶液或稀鹽酸調節(jié)pH至7.2-7.4范圍。調整完pH后，將溶液轉移到1000ml容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度線。將培養(yǎng)基分裝到適當容器（如三角瓶或試管）中，用棉塞或鋁箔封口。滅菌與最終處理將分裝好的培養(yǎng)基置于高壓蒸汽滅菌鍋中，121℃滅菌15-20分鐘。對于液體培養(yǎng)基，滅菌后即可冷卻保存；對于固體培養(yǎng)基，待冷卻至約50℃時（避免瓊脂提前凝固），在超凈工作臺中倒入無菌培養(yǎng)皿，待凝固后倒置保存于4℃冰箱。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基制備過程相對簡單，但質量控制非常重要。確保所有原料純度符合微生物學要求，制備過程中保持清潔避免污染，滅菌條件滿足要求。培養(yǎng)基應在制備后2周內使用，以保證最佳效果。MH（Mueller-Hinton）培養(yǎng)基主要組成MH瓊脂培養(yǎng)基主要成分包括牛肉浸液300g/L、酪蛋白水解物17.5g/L、淀粉1.5g/L和瓊脂17g/L。其中酪蛋白水解物提供氨基酸和其他氮源，牛肉浸液提供B族維生素和其他生長因子，淀粉則能吸收細菌產生的毒素，減少對抗生素敏感性試驗的干擾。特殊用途MH培養(yǎng)基是臨床微生物學實驗室中進行抗生素敏感性測試的標準培養(yǎng)基。由于其組成相對簡單且營養(yǎng)均衡，能夠支持大多數非苛養(yǎng)型病原菌的生長，同時不含任何可能干擾抗生素活性的物質，使其成為藥敏試驗的理想選擇。質量要求MH培養(yǎng)基的質量對抗生素敏感性試驗結果有重要影響。標準要求培養(yǎng)基pH為7.2-7.4，厚度為4mm±0.5mm，鈣、鎂等陽離子含量在規(guī)定范圍內。商業(yè)化MH培養(yǎng)基粉末通常經過嚴格質控，以確保實驗結果的準確性和可重復性。在臨床微生物學實驗室中，MH培養(yǎng)基主要用于K-B紙片擴散法和E-test最小抑菌濃度測定法。對于一些苛養(yǎng)菌（如肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌等），需要在標準MH培養(yǎng)基中添加5%羊血或1%異美硫酸鉀（IsoVitaleX）以滿足其生長需求。MH培養(yǎng)基的標準化使全球抗生素敏感性測試結果具有可比性，有助于臨床抗生素治療方案的制定和抗生素耐藥性監(jiān)測。MH培養(yǎng)基制作方法原料稱量準確稱取MH瓊脂粉末38g（或按配方稱取各組分），準備1000ml蒸餾水。使用分析天平確保稱量精確，因為成分比例會直接影響培養(yǎng)基性能和抗生素敏感性測試結果。溶解混合將稱量好的粉末加入到約800ml蒸餾水中，充分攪拌。加熱至沸騰，確保粉末完全溶解。注意溶液應呈淡黃色透明狀，無明顯沉淀物。持續(xù)加熱約1分鐘，確保培養(yǎng)基中的瓊脂完全熔化。pH調整冷卻至約50℃，用pH計測量pH值，必要時用NaOH或HCl調整至7.3±0.1。pH值對抗生素活性有重要影響，必須嚴格控制。調整完pH后加蒸餾水至1000ml。滅菌處理將培養(yǎng)基分裝到適當容器中，121℃高壓蒸汽滅菌15分鐘。避免過度滅菌，以防培養(yǎng)基成分降解。滅菌后冷卻至45-50℃，準備倒板。倒板與質檢在無菌條件下將培養(yǎng)基倒入平底培養(yǎng)皿，每個培養(yǎng)皿約25ml，確保厚度為4mm。待凝固后，將平板倒置于25℃環(huán)境中放置過夜，檢查無菌性。合格平板應在4℃保存，使用前需恢復至室溫。對于藥敏試驗用MH培養(yǎng)基，制備完成后必須進行質量控制測試，包括pH檢測、培養(yǎng)基厚度測量、標準菌株的生長性能測試及抗生素紙片的抑菌圈大小測定，確保符合CLSI或EUCAST等標準。TSA（胰酪大豆瓊脂）培養(yǎng)基TSA（TrypticSoyAgar）培養(yǎng)基是一種營養(yǎng)豐富的通用培養(yǎng)基，適用于廣譜細菌的培養(yǎng)。其中胰蛋白胨由胰蛋白酶消化酪蛋白制得，富含多種氨基酸和小肽；大豆蛋白胨則由木瓜蛋白酶消化大豆蛋白制得，提供更多樣化的氨基酸譜系；氯化鈉維持適宜的滲透壓；瓊脂作為固化劑提供生長表面。TSA培養(yǎng)基的pH通常調整在7.3±0.2，適合大多數細菌生長。它的特點是營養(yǎng)成分均衡且豐富，能夠支持各種非苛養(yǎng)型細菌、酵母和霉菌的生長。在微生物學實驗室中，TSA常用于環(huán)境監(jiān)測、食品微生物檢測、細菌總數計數以及微生物保藏等領域。相比普通營養(yǎng)瓊脂，TSA能支持更多種類微生物的生長，尤其是一些生長較慢或較為挑剔的菌種。TSA培養(yǎng)基具體制備步驟原料稱量準確稱取胰蛋白胨15g、大豆蛋白胨5g、氯化鈉5g和瓊脂15g（或直接稱取40g商品化TSA粉末）。使用潔凈的容器和工具，避免交叉污染。溶解與加熱將稱量好的原料加入到1000ml蒸餾水中，輕輕攪拌混合。加熱至沸騰，確保所有成分完全溶解，特別是瓊脂需要充分熔化。溶解完全的培養(yǎng)基應呈淡黃色透明狀。pH調整與滅菌冷卻至60℃左右，使用pH計測量并調整pH至7.3±0.2。將調整好的培養(yǎng)基分裝到適當容器中，加蓋或塞封口。放入高壓蒸汽滅菌鍋中，121℃滅菌15分鐘。倒板與保存滅菌后將培養(yǎng)基冷卻至45-50℃。在無菌操作臺上，將培養(yǎng)基倒入無菌培養(yǎng)皿中，每皿約15-20ml。待培養(yǎng)基凝固后倒置，避免冷凝水滴落在培養(yǎng)表面上，在4℃條件下保存，有效期通常為2-4周。TSA培養(yǎng)基常見的變種包括添加5%血液的血瓊脂（BloodTSA）、添加抗生素的選擇性TSA以及用于厭氧菌培養(yǎng)的還原型TSA等。在特殊應用中，可根據需要調整培養(yǎng)基組分或添加特定成分，但基本制備流程保持一致。對于質量控制，應從每批TSA培養(yǎng)基中隨機抽取平板進行無菌測試和生長支持測試，確保培養(yǎng)基的質量符合實驗要求。定期使用標準菌株進行培養(yǎng)基性能驗證也是良好實驗室規(guī)范的一部分。麥康凱（MacConkey）瓊脂基本組成麥康凱瓊脂的主要成分包括胰蛋白胨17g/L、蛋白胨3g/L、乳糖10g/L、膽鹽1.5g/L、氯化鈉5g/L、中性紅0.03g/L、結晶紫0.001g/L和瓊脂13.5g/L。這種獨特的配方使其成為分離和初步鑒別腸桿菌科細菌的重要工具。選擇性機制麥康凱瓊脂是一種選擇性和鑒別性培養(yǎng)基，其選擇性來自于膽鹽和結晶紫的存在，這些成分抑制大多數革蘭陽性菌的生長，而允許革蘭陰性菌特別是腸桿菌科細菌生長。這使得該培養(yǎng)基特別適合于從混合樣本中分離糞便指示菌和腸道病原菌。鑒別原理麥康凱瓊脂的鑒別功能基于細菌對乳糖的利用能力。乳糖發(fā)酵菌（如大腸桿菌）能夠分解乳糖產生酸，使中性紅指示劑變紅，形成粉紅色至紅色菌落，并且周圍可能出現膽鹽沉淀；而非乳糖發(fā)酵菌（如沙門氏菌、志賀氏菌）則形成無色透明菌落。在臨床微生物學實驗室中，麥康凱瓊脂廣泛用于尿液、糞便和其他臨床樣本的初篩培養(yǎng)，幫助快速識別可能的病原體。在食品和環(huán)境微生物學中，它也是監(jiān)測大腸桿菌等糞便污染指示菌的重要工具。該培養(yǎng)基的選擇性和鑒別性特點使實驗人員能夠在24小時內獲得初步的菌種鑒別信息，為后續(xù)的生化鑒定提供方向。麥康凱培養(yǎng)基具體配制原料準備準確稱取商品化麥康凱瓊脂粉末51.5g（或按配方分別稱取各組分）。商品化粉末通常已經過質量控制，能確保各組分比例準確，使用更為便捷。溶解處理將稱量好的粉末加入到1000ml蒸餾水中，輕輕攪拌使其均勻分散。加熱至完全沸騰，確保所有成分充分溶解。溶液應呈深紅色透明狀態(tài)，無不溶性顆粒。3滅菌過程不要過濾培養(yǎng)基，將其裝入適當容器，121℃高壓蒸汽滅菌15分鐘，避免過度滅菌。麥康凱培養(yǎng)基中的膽鹽和指示劑對高溫敏感，過長的滅菌時間可能導致成分降解，影響性能。倒板與貯存滅菌后冷卻至45-50℃，在無菌條件下倒入無菌培養(yǎng)皿，每皿約20ml。待凝固后倒置，避免冷凝水滴落在培養(yǎng)表面上。制備好的平板應在4℃條件下避光保存，有效期通常為2-4周。在使用麥康凱瓊脂進行實驗時，應注意以下幾點：接種前應將平板預熱至室溫；接種量不宜過大，以免影響選擇性；標準培養(yǎng)條件為35-37℃，需氧培養(yǎng)18-24小時；觀察菌落顏色和形態(tài)時應結合周圍介質顏色變化一起判斷。應用案例：在水質監(jiān)測中，可用麥康凱瓊脂進行大腸桿菌計數；在臨床樣本分析中，它可以初步區(qū)分腸桿菌科細菌的乳糖發(fā)酵能力，為后續(xù)鑒定提供線索；在食品微生物學中，它可用于檢測食品中的腸道菌群污染情況。EMB（伊紅美藍）瓊脂1885年首次研發(fā)由Holt-Harris和Teague開發(fā)用于腸道病原菌分離10g/L乳糖含量提供鑒別腸桿菌科細菌乳糖發(fā)酵能力的基質0.4g/L指示劑總量伊紅Y和美藍的組合濃度，提供鑒別性著色6.7-7.3最佳pH范圍確保指示劑正常顯色和細菌最佳生長EMB瓊脂是一種重要的選擇性和鑒別性培養(yǎng)基，專門用于分離和鑒別腸道病原菌。其中的伊紅Y和亞甲藍作為pH指示劑，能夠根據細菌發(fā)酵乳糖產生酸的能力顯示不同顏色。當乳糖被強烈發(fā)酵時，pH降低導致金屬光澤的深紫色菌落（如大腸桿菌），而非乳糖發(fā)酵菌則形成無色或淺粉色菌落。EMB培養(yǎng)基的選擇性來源于染料對革蘭陽性菌的抑制作用。這種培養(yǎng)基特別適用于尿道感染和腸道感染樣本的檢測，能夠快速區(qū)分大腸桿菌（金屬光澤菌落）和肺炎克雷伯菌（粘稠深紫色菌落）等常見病原體，為臨床診斷提供重要參考。EMB培養(yǎng)基制備方案材料稱量準確稱取EMB瓊脂粉末36g（或按配方稱取蛋白胨10g、乳糖10g、蔗糖10g、磷酸二氫鉀2g、瓊脂15g、伊紅Y0.4g和亞甲藍0.065g）2溶解混合將粉末加入1000ml蒸餾水中，加熱至沸騰完全溶解，避免過度加熱3滅菌處理121℃高壓蒸汽滅菌15分鐘，不要過濾倒板冷卻冷卻至50℃后倒入無菌平板，每皿約20mlEMB培養(yǎng)基制備過程中需要特別注意幾個關鍵點：染料成分對光和熱敏感，應盡量減少暴露；滅菌時間不宜過長，以防成分降解影響性能；倒板時厚度應均勻，約4mm，以確保一致的選擇性和鑒別性；制備好的平板應避光保存，以延長有效期。EMB培養(yǎng)基常見的應用注意事項包括：接種前應將平板恢復至室溫；樣本接種不宜過多，以免影響選擇性；培養(yǎng)條件通常為35-37℃，需氧培養(yǎng)18-24小時；觀察結果時應注意金屬光澤的存在，這是大腸桿菌的典型特征；應結合其他生化試驗進行最終鑒定，避免僅憑菌落形態(tài)做出結論。EMB培養(yǎng)基對于區(qū)分大腸桿菌和其他腸桿菌科細菌具有很高的價值，但并非所有非發(fā)酵菌都能在此培養(yǎng)基上有效生長。SS（沙門氏菌-志賀氏菌）培養(yǎng)基基本組成SS瓊脂的主要成分包括胰蛋白胨5g/L、牛肉提取物5g/L、乳糖10g/L、膽鹽8.5g/L、檸檬酸鈉8.5g/L、硫代硫酸鈉8.5g/L、枸櫞酸鐵3.5g/L、中性紅0.025g/L、亮綠0.033g/L和瓊脂13.5g/L。這種特殊配方專為分離腸道致病菌設計。選擇性作用SS瓊脂是一種高度選擇性培養(yǎng)基，其中的膽鹽濃度（8.5g/L）遠高于普通選擇性培養(yǎng)基，能有效抑制大多數腸道共生菌和革蘭陽性菌的生長。亮綠進一步增強了對非目標菌的抑制作用，特別是對大腸桿菌等腸道常見菌的抑制。這使得SS瓊脂特別適合從糞便樣本中分離沙門氏菌和志賀氏菌。鑒別機制SS瓊脂的鑒別功能基于多重機制：乳糖發(fā)酵產生的酸使中性紅變紅，顯示紅色菌落；硫化氫產生菌（如大多數沙門氏菌）與枸櫞酸鐵反應生成黑色硫化鐵，形成黑色中心；乳糖非發(fā)酵菌（如大多數沙門氏菌和志賀氏菌）形成無色透明菌落。這種多重指示系統提供了對不同腸道病原菌的初步鑒別能力。SS瓊脂作為臨床診斷和食品安全檢測的重要工具，能夠從復雜樣本中有效分離腸道致病菌。然而，由于其高度選擇性，某些敏感的沙門氏菌和志賀氏菌株可能生長受抑，建議與其他選擇性較低的培養(yǎng)基聯合使用，以提高檢出率。同時，在SS瓊脂上生長的可疑菌落必須進行進一步的生化和血清學鑒定才能確定最終結果。SS培養(yǎng)基實際制作方法材料準備準確稱取63g商品化SS瓊脂粉末（或按配方分別稱取各組分）1溶解加熱將粉末加入1000ml蒸餾水中，充分混合并加熱至完全溶解，但不要煮沸冷卻調整冷卻至約50-55℃，不需調整pH（通常為7.0±0.2）倒板固化立即倒入無菌培養(yǎng)皿中，每皿約20ml，室溫凝固重要細節(jié)提示：SS培養(yǎng)基不應進行高壓蒸汽滅菌，因為高溫會破壞其選擇性成分，降低培養(yǎng)基性能。正確的做法是加熱至完全溶解后，冷卻至適當溫度直接倒板。如需消毒，可使用100℃水浴加熱15分鐘，但不推薦常規(guī)滅菌。制備過程中應避免培養(yǎng)基過度暴露在空氣中，以防止過度氧化。在實際應用中，應注意以下要點：新鮮制備的SS平板效果最佳，建議制備后盡快使用；平板應室溫干燥12-18小時后使用，以去除表面水分；接種時樣本不宜過多，以免影響選擇性；標準培養(yǎng)條件為35-37℃需氧培養(yǎng)18-24小時；觀察結果時應關注菌落顏色、透明度和中心是否有黑色；陰性對照和陽性對照菌株應同時接種，以驗證培養(yǎng)基性能；對于可疑菌落，需進行后續(xù)確認試驗才能做出最終鑒定。XLD（木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽）瓊脂培養(yǎng)基組成XLD瓊脂的主要成分包括酵母提取物3g/L、L-賴氨酸5g/L、木糖3.75g/L、乳糖7.5g/L、蔗糖7.5g/L、氯化鈉5g/L、脫氧膽酸鈉2.5g/L、硫代硫酸鈉6.8g/L、檸檬酸銨1.5g/L、硫酸鐵0.8g/L、酚紅0.08g/L和瓊脂13.5g/L。這種特殊配方使XLD成為檢測腸道病原菌的高效培養(yǎng)基。鑒別原理XLD瓊脂利用多重生化反應進行鑒別：木糖發(fā)酵產生酸使指示劑變黃；賴氨酸脫羧則產生堿性產物中和酸性，使培養(yǎng)基恢復紅色；硫化氫產生菌與鐵鹽反應形成黑色硫化鐵沉淀。這種復雜的反應系統能夠有效區(qū)分沙門氏菌（通常顯示紅色帶黑色中心的菌落）、志賀氏菌（紅色透明菌落）和其他腸桿菌科細菌。應用優(yōu)勢XLD瓊脂的選擇性相對適中，既能抑制非目標菌生長，又不會過度抑制目標菌，特別適合從臨床和食品樣本中分離沙門氏菌和志賀氏菌。與SS瓊脂相比，XLD對目標菌的抑制作用較小，提高了檢出率，尤其對受損的沙門氏菌和志賀氏菌更為友好。其獨特的三重鑒別系統（木糖發(fā)酵、賴氨酸脫羧和硫化氫產生）提供了更準確的初步鑒別能力。在食品微生物檢測和臨床診斷中，XLD瓊脂常常作為沙門氏菌檢測的首選培養(yǎng)基之一。標準檢測方法通常要求與其他選擇性培養(yǎng)基聯合使用，以提高檢出率。XLD上的可疑菌落需要進行后續(xù)生化和血清學測試進行確認，不能僅憑菌落形態(tài)做出最終鑒定。XLD培養(yǎng)基調配要點準確稱量稱取57g商品化XLD瓊脂粉末（或按配方分別稱取各組分）用于配制1L培養(yǎng)基特殊加熱將粉末加入1L蒸餾水中，加熱至剛剛沸騰并完全溶解，但不要過度加熱避免高壓滅菌XLD培養(yǎng)基不能進行高壓蒸汽滅菌，應在溶解后直接冷卻使用迅速倒板冷卻至約50℃后立即倒入無菌培養(yǎng)皿，每皿約20mlXLD培養(yǎng)基制備的關鍵是控制好加熱過程：必須加熱至完全溶解（溶液應呈清亮的紅色），但不能過度加熱或高壓滅菌，因為這會導致成分分解，特別是脫氧膽酸鹽可能發(fā)生降解，影響培養(yǎng)基的選擇性。制備好的培養(yǎng)基顏色應為均勻的紅色，無渾濁或沉淀。操作環(huán)境要求：XLD培養(yǎng)基應在無菌條件下制備，即使不進行高壓滅菌，也需要用無菌容器盛裝，用無菌器具操作，以避免污染。制備好的培養(yǎng)基平板應在室溫下干燥表面（通常12小時左右），然后倒置保存在4℃冰箱中，有效期為1-2周。使用前應檢查平板顏色和質地：正常平板呈紅色均勻透明狀，如出現變黃或混濁可能已經變質不應使用。CHROMagar色譜培養(yǎng)基顯色原理CHROMagar是一類利用發(fā)色底物的現代培養(yǎng)基，其核心原理是在培養(yǎng)基中添加特定的發(fā)色底物，當細菌產生的特定酶作用于這些底物時，會釋放出有色的產物，使菌落呈現特征性顏色。不同的細菌由于產生的酶的種類不同，會形成不同顏色的菌落，從而實現快速直觀的鑒別。多重鑒別組分CHROMagar培養(yǎng)基通常包含多種發(fā)色底物，每種針對特定菌屬或菌種的酶活性。例如，β-半乳糖苷酶底物使大腸桿菌呈現深藍色，β-葡萄糖醛酸苷酶底物使產氣腸桿菌呈現粉紅色，β-葡萄糖苷酶底物使糞腸球菌呈現藍綠色。這種多重鑒別系統使一個培養(yǎng)基能夠同時區(qū)分多種微生物。應用范圍CHROMagar系列培養(yǎng)基廣泛應用于臨床微生物學、食品微生物學和環(huán)境監(jiān)測。常見的類型包括CHROMagarOrientation（用于尿路病原體檢測）、CHROMagarCandida（用于念珠菌種類鑒別）、CHROMagarMRSA（用于耐甲氧西林金黃色葡萄球菌篩查）等。這些培養(yǎng)基大大縮短了病原體初篩時間，提高了實驗室工作效率。與傳統培養(yǎng)基相比，CHROMagar的優(yōu)勢在于能夠在初次培養(yǎng)時就實現多種微生物的同時區(qū)分，減少后續(xù)鑒定步驟，節(jié)約時間和成本。例如，在尿路感染檢測中，傳統方法可能需要2-3天完成鑒定，而使用CHROMagarOrientation可在18-24小時內獲得初步鑒別結果。雖然CHROMagar不能完全替代傳統生化鑒定，但它提供了快速、有效的初篩工具，特別適合大量樣本處理和監(jiān)測篩查工作。CHROMagar實際制備方法基礎配制CHROMagar培養(yǎng)基通常以商品化粉末形式提供，因為其中的發(fā)色底物配方專利保護且制備復雜。以CHROMagarOrientation為例，準確稱取33g/L的培養(yǎng)基粉末，加入適量蒸餾水中（如900ml用于配制1L）。輕輕加熱至沸騰，確保粉末完全溶解，但避免過度加熱，以防破壞熱敏性發(fā)色底物。滅菌與添加劑冷卻至約50℃，此時可以根據需要添加選擇性補充劑（通常隨培養(yǎng)基一起提供）。某些CHROMagar培養(yǎng)基可能需要添加特定抗生素或生長因子，需嚴格按照廠商指南操作。大多數CHROMagar不需要高壓滅菌，因為發(fā)色底物可能在高溫下降解。如果必須滅菌，應按照廠商建議的特殊方式進行。倒板與保存完全混合后，立即在無菌條件下將培養(yǎng)基倒入無菌培養(yǎng)皿中，每皿約20-25ml。待培養(yǎng)基凝固后，應在室溫下干燥表面（通常4-12小時）。CHROMagar培養(yǎng)基對光敏感，應避光保存在4℃冰箱中，有效期通常較短（約1-2周），應注意觀察顏色變化，如出現異常變色則不應使用。使用CHROMagar時的關鍵步驟與判讀：培養(yǎng)條件通常為35-37℃需氧培養(yǎng)18-24小時；菌落顏色判讀應在充足光線下進行，最好參考廠商提供的顏色圖譜；某些菌種隨著培養(yǎng)時間延長可能出現顏色變化，應在推薦時間內進行判讀；盡管CHROMagar提供了高度可靠的初篩結果，但對于臨床重要菌株，仍需進行確認性測試。不同廠商的CHROMagar可能存在顯色差異，應按各自產品說明書操作。質量控制至關重要，每批次制備的培養(yǎng)基應使用標準菌株進行性能驗證，確保顯色反應符合預期。血瓊脂（BA）培養(yǎng)基營養(yǎng)瓊脂或TSA基礎羊血/馬血/兔血血瓊脂培養(yǎng)基是一種添加了動物血液（通常為5%）的富集培養(yǎng)基，常用于培養(yǎng)苛養(yǎng)型細菌和檢測溶血性。其基礎成分通常是營養(yǎng)瓊脂或胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)。添加的血液提供了血紅蛋白（含有X因子，鐵卟啉）和NAD（含有V因子），這些是某些苛養(yǎng)型細菌（如流感嗜血桿菌）生長所必需的。血瓊脂最重要的特性之一是能夠顯示細菌的溶血模式：β溶血（完全溶血）表現為菌落周圍形成完全透明區(qū)域，如溶血性鏈球菌；α溶血（不完全溶血）表現為菌落周圍形成綠色半透明區(qū)域，如肺炎鏈球菌；γ溶血（無溶血）則不引起周圍血液變化，如糞腸球菌。這種溶血特性是細菌初步鑒定的重要依據。在臨床微生物學中，血瓊脂是分離培養(yǎng)上呼吸道、下呼吸道和傷口樣本的首選培養(yǎng)基之一。它既可以支持普通細菌的生長，又能滿足一些苛養(yǎng)型致病菌的特殊需求，同時提供溶血性信息，是基礎培養(yǎng)基中功能最全面的一種。血瓊脂制備流程1基礎培養(yǎng)基制備準備基礎培養(yǎng)基，通常是營養(yǎng)瓊脂或TSA。準確稱取所需粉末（約40g/L），加入蒸餾水中充分溶解，調節(jié)pH至7.3±0.2。這一步的關鍵是確?；A培養(yǎng)基質量良好，因為它將直接影響最終血瓊脂的性能。2基礎培養(yǎng)基滅菌將準備好的基礎培養(yǎng)基進行121℃高壓蒸汽滅菌15分鐘?；A培養(yǎng)基必須完全滅菌，以確保不會污染后續(xù)添加的血液，影響培養(yǎng)基質量和實驗結果。培養(yǎng)基冷卻將滅菌后的基礎培養(yǎng)基冷卻至45-50℃。溫度控制極為關鍵：溫度過高會導致血液中的紅細胞裂解和生長因子失活；溫度過低則可能導致瓊脂過早凝固，無法與血液均勻混合。添加血液在無菌條件下，向冷卻的基礎培養(yǎng)基中加入5%（體積比）的無菌脫纖維動物血液（通常為羊血）。添加血液時應緩慢倒入，同時輕輕旋轉培養(yǎng)基，確?；旌暇鶆蚨划a生氣泡，避免劇烈攪拌導致紅細胞過度裂解。倒板與保存混合均勻后，立即將培養(yǎng)基倒入無菌培養(yǎng)皿中，每皿約20-25ml。待培養(yǎng)基凝固后，應在室溫下干燥表面（約1小時），然后倒置保存在4℃冰箱中，避光密封，有效期通常為2-4周。制備血瓊脂的注意事項：血液應選用無菌脫纖維動物血液，常用的有羊血、馬血、兔血等，不同動物血液可能對特定菌種的生長支持效果有差異；血液添加的時間和溫度控制是成功制備的關鍵；避免培養(yǎng)基中出現氣泡和不均勻混合；長期保存的血瓊脂可能出現褐變，這可能影響培養(yǎng)基性能，應定期檢查質量。巧克力瓊脂培養(yǎng)基適用菌種巧克力瓊脂特別適合培養(yǎng)高營養(yǎng)需求的苛養(yǎng)型細菌，如流感嗜血桿菌、腦膜炎奈瑟菌、百日咳博德特菌等。這些病原體在常規(guī)培養(yǎng)基上難以生長，需要特殊的生長因子支持。巧克力瓊脂通過熱血處理釋放出這些必需因子，成為這類病原體的首選培養(yǎng)基。熱血處理原理巧克力瓊脂的制備關鍵在于對添加的血液進行熱處理（加熱至80-90℃），這一過程使紅細胞裂解，釋放出細胞內的NAD（V因子）和鐵卟啉（X因子）等生長因子。這種熱處理也破壞了血液中的某些抑制因子，同時保留了關鍵的營養(yǎng)成分，為苛養(yǎng)菌提供了理想的生長環(huán)境。優(yōu)勢特點與普通血瓊脂相比，巧克力瓊脂對苛養(yǎng)菌的生長支持能力更強，因為生長因子更容易被細菌利用。雖然熱處理過程使培養(yǎng)基失去了顯示溶血反應的能力，但對于主要用于分離培養(yǎng)難養(yǎng)菌的目的來說，這種權衡是值得的。巧克力瓊脂通常呈棕褐色（像巧克力色），透明度低于血瓊脂。在臨床微生物學中，巧克力瓊脂主要用于上呼吸道和生殖道樣本的培養(yǎng)，特別是在懷疑有流感嗜血桿菌或腦膜炎奈瑟菌感染時。它也是咽拭子、鼻拭子和眼分泌物等樣本常規(guī)使用的培養(yǎng)基之一。為進一步提高某些特定菌種的分離效果，有時會在巧克力瓊脂中添加針對性的抗生素或生長促進劑。巧克力瓊脂制備方法配方組成基礎培養(yǎng)基（TSA或GC瓊脂）：40g/L脫纖維羊血或馬血：7-10%可選添加1%IsoVitaleX或Vitox補充劑巧克力瓊脂的基礎通常選用較為豐富的培養(yǎng)基，如GC瓊脂基礎（專為難養(yǎng)菌設計）或TSA（通用性好）。血液比例通常高于普通血瓊脂，以提供更多營養(yǎng)。補充劑含有維生素、氨基酸、輔酶等，能進一步促進苛養(yǎng)菌生長。制備流程制備基礎培養(yǎng)基并進行高壓滅菌冷卻至80-85℃（溫度控制關鍵）添加預熱至37℃的脫纖維血液保持在80℃水浴中10-15分鐘冷卻至50℃后添加補充劑（如需）倒入無菌培養(yǎng)皿中整個制備過程中，溫度控制是最關鍵的因素。80-85℃的熱處理溫度必須準確控制：溫度過低無法充分裂解紅細胞釋放生長因子；溫度過高則可能破壞熱敏性營養(yǎng)成分。水浴加熱時間也需精確控制，以達到最佳效果。制備巧克力瓊脂的專業(yè)細節(jié)：在添加補充劑時，應確保培養(yǎng)基溫度已降至50℃以下，因為許多生長促進劑含有熱敏組分；如需制備選擇性巧克力瓊脂，可在冷卻后添加適當抗生素，如萬古霉素（抑制革蘭陽性菌）或厄他培南（優(yōu)選分離腦膜炎奈瑟菌）；培養(yǎng)基倒板厚度應保持在4mm左右，以提供足夠營養(yǎng)；成品培養(yǎng)基應呈均勻的巧克力棕色，無分層或沉淀現象。厭氧培養(yǎng)基介紹<0.5%氧含量要求厭氧菌生長環(huán)境中的最大氧氣含量-200mV氧化還原電位適合嚴格厭氧菌生長的典型環(huán)境條件3-5種還原劑數量典型厭氧培養(yǎng)基中添加的不同還原劑7-10天培養(yǎng)時間某些厭氧菌所需的典型培養(yǎng)周期厭氧培養(yǎng)基是專門為需要無氧或低氧環(huán)境生長的微生物設計的特殊培養(yǎng)基。嚴格厭氧菌在氧氣存在下無法生長，甚至會因氧毒性而死亡。因此，厭氧培養(yǎng)基不僅需要提供適當的營養(yǎng)物質，還必須創(chuàng)造和維持低氧化還原電位的環(huán)境。常見的厭氧培養(yǎng)基包括硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆肉湯、Schaedler瓊脂、CDC厭氧血瓊脂等。這類培養(yǎng)基中通常添加多種還原劑，如硫乙醇酸鹽、半胱氨酸、抗壞血酸等，用于清除培養(yǎng)基中的溶解氧并維持低氧化還原電位。此外，還會添加氧化還原電位指示劑如甲烯藍或松石綠，用于監(jiān)測培養(yǎng)基的厭氧狀態(tài)。在臨床微生物學中，厭氧培養(yǎng)在診斷厭氧感染（如腹腔感染、厭氧性膿腫等）方面發(fā)揮重要作用，需要特殊的培養(yǎng)技術和培養(yǎng)基。厭氧瓊脂制備與保存以CDC厭氧血瓊脂為例，其典型配比包括胰蛋白胨15g/L、酵母提取物5g/L、葡萄糖6g/L、氯化鈉5g/L、L-半胱氨酸0.5g/L、瓊脂15g/L，滅菌后添加5%無菌脫纖維羊血和維生素K1(10mg/L)。制備流程與普通血瓊脂類似，但在基礎培養(yǎng)基中添加還原劑，并在無氧條件下操作?；A培養(yǎng)基需在121℃下高壓滅菌15分鐘，冷卻至45-50℃后，在厭氧工作站內添加血液和其他熱敏組分。厭氧培養(yǎng)基的滅菌方式與一般培養(yǎng)基相同，但更注重滅菌后的充分排氣。滅菌完成后應立即將培養(yǎng)基放入厭氧罐或厭氧工作站中冷卻，避免長時間暴露在空氣中吸收氧氣。對于液體厭氧培養(yǎng)基（如硫乙醇酸鹽肉湯），通常需要在滅菌前進行沸騰處理以驅除溶解氧，滅菌后立即密封避免復氧。制備好的厭氧培養(yǎng)基應盡快使用，保存時間不宜過長，以免失去厭氧性能。缺氧條件下的培養(yǎng)基保護厭氧指示劑監(jiān)測培養(yǎng)環(huán)境是否維持厭氧狀態(tài)2生物學還原系統酶或微生物介導的氧氣消耗機制化學還原劑硫乙醇酸鹽、半胱氨酸、抗壞血酸等厭氧氣體環(huán)境氮氣、二氧化碳和氫氣的混合氣體代替空氣物理密封隔離密封容器或厭氧罐阻止空氣進入厭氧培養(yǎng)的關鍵是創(chuàng)建和維持無氧環(huán)境。實驗室通常采用厭氧罐、厭氧袋或厭氧工作站三種主要方式。厭氧罐是最傳統的方法，在密封的容器中放置催化劑和氣體發(fā)生劑包，產生氫氣與殘留氧氣在鈀催化劑作用下形成水，從而消耗氧氣。厭氧袋是一種一次性使用的密封塑料袋，內含氣體發(fā)生劑，使用方便但成本較高。厭氧工作站是最先進的設備，提供完全隔離的操作環(huán)境，內部充滿特定氣體混合物（通常為5-10%H2、5-10%CO2和80-90%N2），并配有氣閘和手套操作口。此外，培養(yǎng)基本身的保護措施也很重要，包括添加還原劑、加深培養(yǎng)基厚度減少氧氣擴散、使用密封良好的容器等。在厭氧培養(yǎng)過程中，應盡量減少開啟厭氧系統的次數，避免環(huán)境氧氣進入。選擇性培養(yǎng)基的機理抑菌劑作用選擇性培養(yǎng)基中的抑菌劑能特異性抑制非目標微生物的生長，同時對目標微生物影響較小。例如，膽鹽可抑制革蘭陽性菌而對腸桿菌科細菌影響較小；結晶紫主要抑制革蘭陽性菌；大環(huán)內酯類抗生素抑制大多數革蘭陽性菌和一些革蘭陰性菌。選擇劑類型常用的選擇性成分包括抗生素（如萬古霉素、多粘菌素）、染料（如結晶紫、亮綠）、膽鹽、無機鹽（如硒酸鹽、亞碲酸鹽）和特殊代謝底物等。這些成分的選擇基于目標菌種和干擾菌種之間的生理生化差異，如細胞壁結構、代謝途徑和耐受性等方面的不同。篩選原理選擇性培養(yǎng)基的核心原理是利用不同微生物對特定化學物質的敏感性差異，在培養(yǎng)基中添加能夠抑制非目標菌而對目標菌影響小的物質。例如，麥康凱瓊脂中的膽鹽和結晶紫抑制革蘭陽性菌，使腸桿菌科細菌能夠優(yōu)先生長；SS瓊脂中高濃度膽鹽抑制大多數腸道正常菌群，便于沙門氏菌和志賀氏菌的分離。應用舉例選擇性培養(yǎng)基的典型應用包括：MRSA篩查用的苯唑西林(甲氧西林)瓊脂，通過添加高濃度β-內酰胺類抗生素選擇耐藥菌株；沙博霉素瓊脂用于鐮刀菌屬的分離，利用這些真菌對沙博霉素的抗性；Campylobacter選擇性瓊脂添加多種抗生素抑制其他菌群，便于彎曲菌的分離。選擇性培養(yǎng)基雖然有利于目標菌種的分離，但也存在一些局限性：過強的選擇壓力可能抑制某些敏感的目標菌株；受損或應激狀態(tài)的目標菌可能對選擇劑更敏感；一些非目標菌可能產生耐藥性。因此，臨床和科研中通常結合使用不同選擇性的培養(yǎng)基，以提高病原體的檢出率。鑒別性培養(yǎng)基簡介鑒別機制代表培養(yǎng)基目標微生物鑒別原理碳水化合物發(fā)酵EMB瓊脂，麥康凱瓊脂腸桿菌科細菌乳糖發(fā)酵產酸引起pH指示劑變色特殊酶活性CHROMagar，尿素瓊脂特定菌屬或菌種特異性酶作用于底物產生有色產物硫化氫產生TSI瓊脂，XLD瓊脂產H?S細菌如沙門氏菌H?S與鐵鹽反應形成黑色硫化鐵蛋白質分解牛奶瓊脂，明膠培養(yǎng)基產蛋白酶細菌蛋白質分解形成透明區(qū)溶血反應血瓊脂產溶血素的細菌紅細胞被溶解形成透明或綠色區(qū)域鑒別性培養(yǎng)基是通過在培養(yǎng)基中添加特定指示物或底物，利用微生物的代謝活動或生化反應產生可檢測的變化，從而區(qū)分不同類型微生物的專用培養(yǎng)基。與選擇性培養(yǎng)基著重于抑制非目標菌不同，鑒別性培養(yǎng)基主要提供能夠顯示微生物生化特性的視覺信號。以乳糖發(fā)酵能力檢測為例，麥康凱瓊脂和EMB瓊脂中添加乳糖作為碳源，同時含有pH指示劑。當細菌能夠發(fā)酵乳糖產生酸時，周圍pH降低使指示劑變色，形成特征性菌落。這使得實驗人員能夠直觀區(qū)分乳糖發(fā)酵菌（如大腸桿菌）和非乳糖發(fā)酵菌（如沙門氏菌）。許多現代培養(yǎng)基同時具備選擇性和鑒別性，在抑制非目標菌的同時提供目標菌的初步鑒定信息。PH指示劑的選擇與應用常用pH指示劑中性紅：pH6.8-8.0，酸性紅色，堿性黃色甲基紅：pH4.4-6.2，酸性紅色，堿性黃色溴麝香草酚藍：pH6.0-7.6，酸性黃色，堿性藍色酚紅：pH6.8-8.4，酸性黃色，堿性紅色溴甲酚紫：pH5.2-6.8，酸性黃色，堿性紫色作用機制pH指示劑是一類在不同pH環(huán)境下呈現不同顏色的有機分子。在微生物培養(yǎng)基中，它們能夠顯示微生物代謝活動引起的pH變化。例如，當微生物發(fā)酵碳水化合物產生有機酸時，培養(yǎng)基pH下降，指示劑顏色改變；而當微生物分解蛋白質產生氨等堿性物質時，pH上升，指示劑又呈現另一種顏色。選擇合適的pH指示劑需要考慮幾個關鍵因素：變色pH范圍應與微生物代謝引起的pH變化范圍匹配；顏色對比度應明顯，便于觀察判讀；指示劑本身不應對微生物生長產生顯著抑制作用；指示劑應在培養(yǎng)條件下保持穩(wěn)定。在實際應用中，不同類型的培養(yǎng)基選用不同的指示劑。例如，麥康凱瓊脂使用中性紅作為指示劑，當腸桿菌科細菌發(fā)酵乳糖產酸時，菌落呈現粉紅色至紅色；TSI（三糖鐵）瓊脂則同時含有酚紅和溴麝香草酚藍，能夠顯示碳水化合物發(fā)酵和堿性產物的多重反應。有些現代培養(yǎng)基可能使用多種指示劑的組合，以提供更多的代謝信息。pH指示劑的濃度也需謹慎控制：過高的濃度可能對微生物生長產生抑制作用；過低的濃度則可能導致顏色變化不明顯，難以判讀。高質量的pH指示劑應無菌、純度高、對微生物無毒，并在規(guī)定保存條件下色彩穩(wěn)定。培養(yǎng)基制備的通用流程稱量準確稱取所需培養(yǎng)基粉末或各組分混合溶解加入適量蒸餾水充分攪拌直至完全溶解pH調整使用pH計測量并調整至規(guī)定值滅菌按要求進行高壓蒸汽滅菌或過濾滅菌無論制備何種培養(yǎng)基，基本流程通常遵循上述步驟，但在實際操作中需要注意每種培養(yǎng)基的特殊要求。稱量階段應使用分析天平和干凈器具，確保計量準確。對于瓊脂培養(yǎng)基，瓊脂粉末在常溫下難以溶解，需要加熱至沸騰才能完全溶解；對于熱敏性成分，需與其他成分分開處理，在主體培養(yǎng)基滅菌冷卻后再添加。pH調整是培養(yǎng)基制備的關鍵步驟，因為微生物的生長對pH變化非常敏感。通常使用氫氧化鈉溶液（1mol/L）或鹽酸溶液調整pH值，調整時應使用校準的pH計，緩慢添加調節(jié)劑并充分攪拌。滅菌方式也需根據培養(yǎng)基特性選擇：大多數常規(guī)培養(yǎng)基采用121℃高壓蒸汽滅菌15-20分鐘；含有熱敏成分的培養(yǎng)基可能需要過濾滅菌或低溫長時間滅菌；某些選擇性培養(yǎng)基（如SS瓊脂）則不需要高壓滅菌，防止成分降解。高壓蒸汽滅菌操作滅菌標準條件培養(yǎng)基滅菌的標準條件通常是121℃（15psi或1.05kg/cm2壓力）維持15-20分鐘。這一條件能夠殺滅所有細菌包括芽孢、真菌和大多數病毒。滅菌時間從達到指定溫度和壓力開始計算，不包括升溫和冷卻階段。容器體積越大，所需滅菌時間越長，因為熱量需要更長時間滲透到培養(yǎng)基內部。容器與裝載要求滅菌容器應選用耐高溫材質，如硼硅酸鹽玻璃或特定的耐熱塑料。容器裝載量不應超過容積的三分之二，以留出空間供內容物膨脹和蒸汽循環(huán)。盛裝培養(yǎng)基的瓶口應松塞或微松螺蓋，允許蒸汽進入和空氣排出，避免容器破裂。在高壓滅菌鍋中，容器之間應留有足夠空間，確保蒸汽能夠均勻接觸每個容器的表面。監(jiān)測與驗證高壓滅菌過程應該通過溫度計、壓力表和時間記錄進行監(jiān)測。許多現代高壓滅菌鍋配備數字控制系統和打印記錄功能。此外，可以使用化學指示條或生物指示劑（如嗜熱脂肪芽孢桿菌孢子）驗證滅菌效果。每次滅菌后，應檢查培養(yǎng)基外觀（如顏色和透明度）和物理狀態(tài)（如是否有未溶解顆粒）。幾乎所有含瓊脂的固體培養(yǎng)基和大多數液體培養(yǎng)基都需要高壓蒸汽滅菌。例外情況主要包括含有熱敏成分的培養(yǎng)基（如CHROMagar中的發(fā)色底物）、特殊選擇性培養(yǎng)基（如SS瓊脂、XLD瓊脂）以及某些已經滅菌的即用型商業(yè)培養(yǎng)基。高壓滅菌后的培養(yǎng)基應在適當溫度下冷卻，避免過度冷凝導致培養(yǎng)基表面積水，這可能影響后續(xù)實驗結果。常見培養(yǎng)基制備誤區(qū)組分配比誤差常見問題：未使用分析天平精確稱量，導致成分比例不準確；僅憑經驗添加，未遵循標準配方；未考慮不同品牌粉末產品的差異。影響：培養(yǎng)基pH異常、營養(yǎng)不平衡、選擇性或鑒別性能下降。建議：使用校準的分析天平，嚴格按照配方進行稱量；熟悉不同品牌粉末的特性和用量差異。pH調整失誤常見問題：未使用校準的pH計；在培養(yǎng)基仍然過熱時測量pH值；調整pH時加入過量調節(jié)劑導致pH值劇烈波動。影響：最終pH超出微生物生長適宜范圍，抑制目標菌生長或影響指示劑顯色。建議：確保pH計定期校準；在適當溫度（25-30℃）下測量pH值；緩慢添加稀釋的調節(jié)劑，每次添加后充分混合測量。加熱過度常見問題：培養(yǎng)基溶解后繼續(xù)加熱過長時間；高壓滅菌時間超過規(guī)定時間。影響：培養(yǎng)基褐變、營養(yǎng)成分降解、瓊脂強度下降。建議：瓊脂溶解后立即停止加熱；嚴格控制滅菌時間；對于復雜培養(yǎng)基，考慮分步滅菌和添加熱敏成分。容器選擇不當常見問題：使用不耐熱容器；容器體積太小導致培養(yǎng)基溢出；容器塞子過緊，滅菌過程中無法排氣。影響：容器破裂造成污染和損失；培養(yǎng)基成分流失影響性能。建議：選擇合適材質和尺寸的容器；控制容器裝載量不超過2/3；確保塞子松動，允許氣體交換。其他常見誤區(qū)還包括：未考慮瓊脂濃度和培養(yǎng)基厚度對微生物生長的影響；忽視不同批次原料間的差異；在不潔凈環(huán)境中操作導致污染；儲存方法不當導致培養(yǎng)基性能下降等。建立標準操作規(guī)程(SOP)并定期培訓操作人員，是避免這些問題的有效方法。培養(yǎng)基失效的鑒別方法外觀檢查觀察培養(yǎng)基的顏色、透明度和物理狀態(tài)是判斷其是否失效的第一步。正常的培養(yǎng)基應具有特定的顏色和透明度，如營養(yǎng)瓊脂呈淡黃色透明，血瓊脂呈均勻紅色。失效培養(yǎng)基可能出現以下變化：顏色異常（如褐變、褪色）、混濁或沉淀物增加、瓊脂過度收縮或液化、表面干燥開裂、異常氣泡或分層。這些變化通常暗示培養(yǎng)基成分已發(fā)生降解或被微生物污染。氣味評估氣味變化是培養(yǎng)基變質的重要指標。新鮮培養(yǎng)基通常有輕微肉湯或蛋白胨氣味，無異味。當培養(yǎng)基被微生物污染或成分分解時，可能產生明顯的酸敗味、發(fā)酵味或腐臭味。含有血液的培養(yǎng)基如血瓊脂，失效時可能產生溶血氣味。進行氣味評估時應在開蓋后立即聞，避免直接接觸培養(yǎng)基，并注意個人防護。性能驗證使用標準參考菌株進行培養(yǎng)是評估培養(yǎng)基性能最可靠的方法。選擇適合該培養(yǎng)基的標準菌株進行接種培養(yǎng)，觀察生長情況、菌落形態(tài)和特征性反應。例如，對于麥康凱瓊脂，可使用大腸桿菌(應形成粉紅色菌落)和產氏變形桿菌(應形成無色透明菌落)進行測試；對于血瓊脂，可使用金黃色葡萄球菌和溶血性鏈球菌檢查溶血反應。培養(yǎng)基失效時，菌株可能無法生長，或者生長緩慢、特征性反應減弱或消失。培養(yǎng)基的pH值也是重要的質量指標，應使用校準的pH計在25℃條件下測量。pH值偏離規(guī)定范圍超過0.2-0.3個單位可能影響培養(yǎng)基性能。此外，如發(fā)現培養(yǎng)基中出現污染菌生長，如霉菌菌絲、細菌菌落或培養(yǎng)基混濁，則培養(yǎng)基已明顯失效，應立即丟棄。建立培養(yǎng)基質量控制體系，包括記錄批號、制備日期、失效日期和性能驗證結果，可以系統性地監(jiān)控培養(yǎng)基質量。培養(yǎng)基保存與保質期溫度管理大多數制備好的培養(yǎng)基應在2-8℃的冰箱中保存，避免凍結和反復凍融循環(huán)，這會導致培養(yǎng)基成分分離和瓊脂結構破壞。室溫下保存會縮短培養(yǎng)基的保質期，加速水分蒸發(fā)和成分降解。特殊培養(yǎng)基如選擇性培養(yǎng)基可能有更嚴格的溫度要求，應查閱具體說明。使用前應將培養(yǎng)基恢復至室溫，避免冷培養(yǎng)基導致溫度休克影響微生物生長。光照控制許多培養(yǎng)基成分如指示劑、抗生素和某些選擇性試劑對光敏感。長時間光照會導致這些成分降解，影響培養(yǎng)基的選擇性和鑒別性能。含有光敏成分的培養(yǎng)基（如麥康凱瓊脂、EMB瓊脂、CHROMagar）應避光保存，培養(yǎng)基容器可包裹鋁箔或使用不透明容器。儲存區(qū)域應避免陽光直射和強烈熒光燈照射。保質期管理不同類型培養(yǎng)基的保質期差異較大。一般而言：基礎培養(yǎng)基（如營養(yǎng)瓊脂、TSA）保質期較長，2-8℃條件下可保存4-6周；含血培養(yǎng)基（血瓊脂、巧克力瓊脂）保質期較短，通常為2-3周；選擇性和鑒別性培養(yǎng)基保質期更短，通常為1-2周。每批培養(yǎng)基應明確標記制備日期和有效期，并保持容器密封以防止污染和水分蒸發(fā)。固體培養(yǎng)基與液體培養(yǎng)基在保存要求上存在一些區(qū)別：固體培養(yǎng)基需防止表面干燥，可用塑料袋密封包裝，倒置保存避免冷凝水滴落；液體培養(yǎng)基應確保容器密封良好，防止蒸發(fā)和污染，長期保存的液體培養(yǎng)基可能需要重新檢查pH和溶解氧狀態(tài)。對于特殊目的的培養(yǎng)基，如用于臨床診斷的關鍵培養(yǎng)基，建議建立更嚴格的質量控制程序，包括定期的性能驗證和微生物污染檢查。良好的庫存管理也很重要，采用"先進先出"原則，避免長期儲存導致培養(yǎng)基失效。使用即用型培養(yǎng)基產品自制培養(yǎng)基商業(yè)即用型市售即用型培養(yǎng)基產品主要包括預制平板、即用型瓶裝培養(yǎng)基、干燥粉末培養(yǎng)基和方便型培養(yǎng)試劑盒等。預制平板是最常見的即用型產品，由廠商完成培養(yǎng)基制備和滅菌、倒板等全過程，用戶可直接使用。即用型瓶裝培養(yǎng)基是滅菌后的液體培養(yǎng)基，使用時需加熱熔化并倒板。干燥粉末培養(yǎng)基含有所有必要成分，使用時只需按比例添加水，加熱溶解后滅菌。方便型培養(yǎng)試劑盒通常包含基礎培養(yǎng)基和添加劑，用戶按照說明混合使用。即用型培養(yǎng)基的主要優(yōu)點包括：節(jié)省實驗室人力和設備資源；具有經過驗證的批間一致性和質量保證；便于標準化操作；減少污染風險；特殊培養(yǎng)基更容易獲取。然而，其局限性也很明顯：成本較高，尤其是預制平板；運輸和儲存條件要求嚴格；可定制性有限；臨時需求不易滿足；依賴供應商供貨周期。在選擇是自制培養(yǎng)基還是使用商業(yè)即用型產品時，應綜合考慮實驗目的、技術要求、實驗室設施條件、成本預算和樣本量等因素。常用培養(yǎng)基配置表培養(yǎng)基名稱主要成分(g/L)pH值滅菌條件主要用途LB培養(yǎng)基蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl5，瓊脂15(固體)7.0-7.2121℃，15分鐘大腸桿菌等常規(guī)細菌培養(yǎng)PDA培養(yǎng)基馬鈴薯提取物200，葡萄糖20，瓊脂155.6±0.2121℃，15分鐘真菌培養(yǎng)麥康凱瓊脂蛋白胨20，乳糖10，膽鹽1.5，NaCl5，中性紅0.037.1±0.2121℃，15分鐘腸桿菌科細菌分離血