利用同源重組構(gòu)建基因表達(dá)載體與融合基因、融合蛋白及蛋白質(zhì)相互作用酵母雙雜交系統(tǒng)與免疫共沉淀課件

利用同源重組構(gòu)建基因表達(dá)載體與融合基因、融合蛋白及蛋白質(zhì)相互作用酵母雙雜交系統(tǒng)與免疫共沉淀突破1

利用同源重組構(gòu)建基因表達(dá)載體(2023·江蘇卷，22)為了將某納米抗體和綠色熒光蛋白基因融合表達(dá)，運(yùn)用重組酶技術(shù)構(gòu)建質(zhì)粒，如圖1所示。請(qǐng)回答下列問題：(1)分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增片段F1與片段F2時(shí)，配制的兩個(gè)反應(yīng)體系中不同的有__________，擴(kuò)增程序中最主要的不同是________。模板、引物退火溫度(2)有關(guān)基因序列如圖2。引物F2－F、F1－R應(yīng)在下列選項(xiàng)中選用________。A.ATGGTG——CAACCAB.TGGTTG——CACCATC.GACGAG——CTGCAGD.CTGCAG——CTCGTCCD(3)將PCR產(chǎn)物片段與線性質(zhì)粒載體混合后，在重組酶作用下可形成環(huán)化質(zhì)粒，直接用于轉(zhuǎn)化細(xì)菌。這一過程與傳統(tǒng)重組質(zhì)粒構(gòu)建過程相比，無需使用的酶主要有___________________________________。(4)轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌需采用含有抗生素的培養(yǎng)基篩選，下列敘述錯(cuò)誤的有________。A.稀釋涂布平板需控制每個(gè)平板30～300個(gè)菌落B.抗性平板上未長(zhǎng)出菌落的原因一般是培養(yǎng)基溫度太高C.抗性平板上常常會(huì)出現(xiàn)大量雜菌形成的菌落D.抗性平板上長(zhǎng)出的單菌落無需進(jìn)一步劃線純化限制性內(nèi)切核酸酶、DNA連接酶ABC(5)為了驗(yàn)證平板上菌落中的質(zhì)粒是否符合設(shè)計(jì)，用不同菌落的質(zhì)粒為模板，用引物F1－F和F2－R進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，質(zhì)粒P1～P4的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖3。根據(jù)圖中結(jié)果判斷，可以舍棄的質(zhì)粒有________。(6)對(duì)于PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果符合預(yù)期的質(zhì)粒，通常需進(jìn)一步通過基因測(cè)序確認(rèn)，原因是_________________________________________________________________________________________________。P3、P4電泳只能顯示擴(kuò)增片段的大致長(zhǎng)度，不能顯示精準(zhǔn)的DNA堿基數(shù)量。也不能呈現(xiàn)DNA堿基序列角度1無縫克隆技術(shù)In－Fusion技術(shù)，即無縫克隆和組裝技術(shù)，是一種新型的、快速、簡(jiǎn)潔的克隆方法，可以在質(zhì)粒的任何位點(diǎn)進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)目標(biāo)DNA片段的插入。具體原理是：在載體末端和目的基因兩端應(yīng)具有15～25個(gè)同源堿基，而目的基因兩端的同源序列往往是通過引物設(shè)計(jì)實(shí)現(xiàn)的，In－Fusion酶能夠識(shí)別具有相同末端序列的線性DNA分子并使其形成黏性末端，DNA連接酶再將兩條DNA單鏈黏合起來。命題要點(diǎn)：(1)質(zhì)粒構(gòu)建過程：①采用酶切或者PCR擴(kuò)增方法將載體線性化；②使用設(shè)計(jì)好的引物進(jìn)行目的DNA片段的PCR擴(kuò)增；③反應(yīng)體系內(nèi)形成重組質(zhì)粒。(2)與傳統(tǒng)酶切、酶連相比的優(yōu)勢(shì)：①位點(diǎn)選擇靈活，在載體任意位置進(jìn)行基因克??；②快速簡(jiǎn)便；③克隆效率高，陽性克隆高達(dá)90%以上；④可同時(shí)克隆兩個(gè)或多個(gè)DNA片段。[例1]

(2024·廣東佛山調(diào)研)纖維素是自然界中分布最廣、含量最豐富的一種多糖，水解纖維素的酶系包括內(nèi)切酶(EG)、外切酶(CBH)和B－葡萄糖苷酶(BGL)。已知釀酒酵母菌不能吸收纖維素，科研人員利用基因工程技術(shù)依次將EG基因、CBH基因和BGL基因分多步導(dǎo)入釀酒酵母菌，獲取可以直接利用纖維素發(fā)酵的釀酒酵母工程菌。(1)科研人員常用PCR技術(shù)獲取和擴(kuò)增EG基因、CBH基因和BGL基因，該過程不需要添加解旋酶，但DNA也能解旋的原因是_____________________________。若PCR產(chǎn)物中出現(xiàn)了部分非目標(biāo)序列，可能的原因有_________________________________________________________________________________(答出兩點(diǎn)即可)。高溫也可使氫鍵斷裂，雙鏈打開

引物設(shè)計(jì)不合理，它們與非目的序列有同源性；復(fù)性溫度過低，DNA聚合酶的質(zhì)量不好等(2)構(gòu)建基因表達(dá)載體是基因工程的核心步驟，科研人員采用以下兩種方法構(gòu)建含有EG基因的表達(dá)載體。①雙酶切法：如圖甲標(biāo)注了載體、EG基因的限制酶切點(diǎn)、EG基因插入部位及兩端的部分序列，已知釀酒酵母菌不能合成尿嘧啶，圖中的標(biāo)記基因?yàn)槟蜞奏ず铣苫?。結(jié)合圖中信息分析，在擴(kuò)增EG基因時(shí)應(yīng)在引物的________(填“5′”或“3′”)端添加__________________限制酶的識(shí)別序列，設(shè)計(jì)的引物序列為_________________________________________。(從5′端書寫，寫出前12個(gè)堿基序列即可)5′BamHⅠ、SacⅠGGATCCGAATCG、GAGCTCAGCCTA②同源重組法：該操作可通過PCR技術(shù)在任一位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)質(zhì)粒的線性化，只要將目的基因兩端帶有與線性化質(zhì)粒兩端同源的DNA序列，在相關(guān)酶的作用下即可實(shí)現(xiàn)質(zhì)粒上的同源重組(如圖乙所示)。與雙酶切法相比，同源重組法構(gòu)建基因表達(dá)載體的突出優(yōu)點(diǎn)是___________________________________________________________。在相關(guān)酶的作用下可以實(shí)現(xiàn)載體上任一點(diǎn)與目的基因的重組(3)導(dǎo)入上述重組質(zhì)粒的釀酒酵母菌應(yīng)在___________的培養(yǎng)基上篩選培養(yǎng)。將篩選得到的菌株接種到液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時(shí)間，通過檢測(cè)__________，以確定其發(fā)酵效果。不含尿嘧啶酒精的含量角度2

Cre/LoxP重組酶系統(tǒng)Cre/LoxP重組酶系統(tǒng)的核心元件：(1)Cre重組酶：由大腸桿菌噬菌體P1的Cre基因編碼，具有限制酶特性，能夠特異性識(shí)別LoxP位點(diǎn)。能介導(dǎo)兩個(gè)LoxP位點(diǎn)之間的特異性重組，使LoxP位點(diǎn)間的基因序列被刪除或重組。(2)LoxP序列：來源于P1噬菌體，包括兩個(gè)13bp的反向重復(fù)序列和一個(gè)8bp的間隔區(qū)域，反向重復(fù)序列是Cre重組酶的特異識(shí)別位點(diǎn)，而間隔區(qū)域決定了LoxP位點(diǎn)的方向，LoxP有不同“亞型”，可以嵌套使用。命題要點(diǎn)：(1)同向LoxP：如果兩個(gè)LoxP位點(diǎn)位于一條DNA鏈上，且方向相同，Cre重組酶能有效切除兩個(gè)LoxP位點(diǎn)間的序列，僅保留一個(gè)LoxP。(2)反向LoxP：如果兩個(gè)LoxP位點(diǎn)位于一條DNA鏈上，但方向相反，Cre重組酶能導(dǎo)致兩個(gè)LoxP位點(diǎn)間的序列倒位。(3)依賴于Cre基因的表達(dá)：在目的基因上游，放置一個(gè)帶有LoxP位點(diǎn)的終止密碼子，可以防止Cre基因缺失時(shí)的表達(dá)。在Cre基因存在的情況下，終止密碼子被切除，基因表達(dá)繼續(xù)進(jìn)行。[例2]Cre/LoxP重組酶系統(tǒng)是對(duì)轉(zhuǎn)基因受體細(xì)胞DNA上的特定序列進(jìn)行定點(diǎn)切割和重新連接，從而在基因或染色體水平上對(duì)生物基因進(jìn)行遺傳改造的一種技術(shù)。請(qǐng)回答下列問題：(1)LoxP具有方向性，結(jié)構(gòu)如圖一所示，其中決定方向的序列是________(填序號(hào))。Cre酶能隨機(jī)識(shí)別DNA分子上的兩個(gè)相同的LoxP序列，并在其中的特定位點(diǎn)切斷DNA雙鏈，重新連接切口后，連接時(shí)形成的化學(xué)鍵是____________，兩個(gè)同向LoxP在發(fā)揮作用時(shí)，機(jī)制如圖二，則保留圖二中片段________(填序號(hào))，就能實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因的敲除。②磷酸二酯鍵2(2)Cre/LoxP重組酶系統(tǒng)可以調(diào)控基因的表達(dá)，在目的基因________(填“上游”或“下游”)插入一個(gè)帶有LoxP位點(diǎn)的編碼終止密碼子的序列，在Cre酶存在的情況下，目的基因________(填“表達(dá)”或“不表達(dá)”)。若經(jīng)Cre酶作用使得2個(gè)LoxP位點(diǎn)間的序列發(fā)生反轉(zhuǎn)，其原因可能是______________________________。上游表達(dá)兩個(gè)LoxP序列相反(3)“腦彩虹”是一項(xiàng)最新的大腦成像技術(shù)，通過熒光蛋白“點(diǎn)亮”大腦內(nèi)的神經(jīng)元，幫助科學(xué)家了解大腦。①研究者設(shè)計(jì)如圖所示的DNA片段。已知三種熒光蛋白的氨基酸序列，則可通過________________法獲得相關(guān)基因，再利用限制酶和____________酶將三種熒光蛋白基因和兩種LoxP序列、啟動(dòng)子M與載體連接，形成重組質(zhì)粒，采用____________法將其導(dǎo)入小鼠的受精卵細(xì)胞中，經(jīng)過篩選、培育，獲得轉(zhuǎn)基因小鼠。人工化學(xué)合成DNA連接顯微注射②在Cre酶的幫助下，一些熒光蛋白基因可能會(huì)被隨機(jī)“剪掉”，但兩個(gè)LoxP1或兩個(gè)LoxP2之間的基因，最多會(huì)被Cre酶敲除一次，Cre酶基因在環(huán)境中存在化學(xué)物質(zhì)Tam時(shí)才能激活表達(dá)，因此該小鼠“腦彩虹”的出現(xiàn)可受Tam的調(diào)控：a.若無Tam作用時(shí)，該小鼠腦組織的色彩為________色，其他組織細(xì)胞顏色為________色。b.若有Tam作用時(shí)，該小鼠腦組織會(huì)出現(xiàn)“腦彩虹”，請(qǐng)闡述機(jī)理：______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。紅無若有Tam作用時(shí)，則啟動(dòng)Cre酶基因的表達(dá)，在該酶的作用下，一些熒光蛋白基因可能會(huì)被隨機(jī)“剪掉”，若隨機(jī)敲除兩個(gè)LoxP1之間的紅色熒光蛋白基因，此時(shí)細(xì)胞為黃色，敲除兩個(gè)LoxP2之間的紅色和黃色熒光蛋白基因，此時(shí)細(xì)胞為藍(lán)色，也有可能未成功敲除熒光蛋白基因，此時(shí)細(xì)胞為紅色，這樣就會(huì)出現(xiàn)不同腦細(xì)胞差異表達(dá)紅色、黃色或藍(lán)色熒光蛋白基因，進(jìn)而出現(xiàn)“腦彩虹”突破2

融合基因、融合蛋白及蛋白質(zhì)相互作用1.(2023·遼寧卷，8)CD163蛋白是PRRSV病毒感染家畜的受體。為實(shí)時(shí)監(jiān)控CD163蛋白的表達(dá)和轉(zhuǎn)運(yùn)過程，將紅色熒光蛋白R(shí)FP基因與CD163基因拼接在一起(如圖)，使其表達(dá)成一條多肽。該拼接過程的關(guān)鍵步驟是除去(

)A.CD163基因中編碼起始密碼子的序列B.CD163基因中編碼終止密碼子的序列C.RFP基因中編碼起始密碼子的序列D.RFP基因中編碼終止密碼子的序列B2.(2023·浙江6月選考，19)某研究小組利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將綠色熒光蛋白基因(GFP)整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如圖甲所示。實(shí)驗(yàn)得到能正常表達(dá)兩種蛋白質(zhì)的雜合子雌雄小鼠各1只，交配以期獲得Gata3－GFP基因純合子小鼠。為了鑒定交配獲得的4只新生小鼠的基因型，設(shè)計(jì)了引物1和引物2用于PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖乙所示。B下列敘述正確的是(

)A.Gata3基因的啟動(dòng)子無法控制GFP基因的表達(dá)B.翻譯時(shí)先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白C.2號(hào)條帶的小鼠是野生型，4號(hào)條帶的小鼠是Gata3－GFP基因純合子D.若用引物1和引物3進(jìn)行PCR，能更好地區(qū)分雜合子和純合子1.融合基因與融合蛋白 (1)融合基因：是指將兩個(gè)或多個(gè)基因的編碼區(qū)首尾相連，置于同一套啟動(dòng)子和終止子內(nèi)部構(gòu)成的嵌合基因。啟動(dòng)子基因1基因2基因3終止子(2)融合蛋白：是指融合基因的表達(dá)產(chǎn)物。(3)啟動(dòng)子及其類型啟動(dòng)子是一段具有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段，是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA。主要包括以下三種類型：①組成型啟動(dòng)子：能夠調(diào)控基因表達(dá)，使其基本恒定在一定程度上，從而使基因在不同部位或組織中的表達(dá)水平不存在明顯差異。這類啟動(dòng)子一般來自管家基因，可連續(xù)不斷地啟動(dòng)基因的表達(dá)。②組織特異性啟動(dòng)子：其調(diào)控作用使得基因往往只在某些特定器官或組織中表達(dá)，且表現(xiàn)出發(fā)育調(diào)節(jié)的特性。如構(gòu)建乳腺生物反應(yīng)器時(shí)所用的在乳腺中特異表達(dá)的基因的啟動(dòng)子。③誘導(dǎo)型啟動(dòng)子：即在某些特定的物理或化學(xué)信號(hào)刺激后，使目的基因的轉(zhuǎn)錄水平有所提高。2.融合基因的種類(1)目的基因＋報(bào)告/標(biāo)記基因其主要目的是對(duì)目的基因進(jìn)行示蹤，研究其功能及特性。標(biāo)記基因有綠色熒光蛋白基因(GFP基因)、β－半乳糖苷酶基因(LacZ基因)、β－葡萄糖苷酸酶基因(GUS基因)、蟲熒光素酶基因(Luciferasese基因)等。啟動(dòng)子目的基因綠色熒光蛋白基因終止子(1)報(bào)告/標(biāo)記基因一般連在目的基因的下游，這樣才能確信表達(dá)了標(biāo)記基因的受體細(xì)胞也表達(dá)了目的基因，即受體細(xì)胞出現(xiàn)綠色熒光，說明目的基因已經(jīng)表達(dá)。如果報(bào)告/標(biāo)記基因在前，目的基因在后，有可能受體細(xì)胞只成功表達(dá)報(bào)告/標(biāo)記基因，而未成功表達(dá)目的基因。(2)編碼信號(hào)肽或單體蛋白序列的基因＋目的基因其主要目的是利用信號(hào)肽或單體序列攜帶目的基因高效表達(dá)，從而提取純化目的蛋白，為生產(chǎn)或科研所用。(3)功能基因＋功能基因分為兩類：一是相同功能基因的融合(目的是增強(qiáng)基因的功能，擴(kuò)大基因的應(yīng)用范圍，例如殺蟲基因之間的融合)；二是不同功能基因的融合(為特殊需要而構(gòu)建，例如將編碼大腸桿菌熱不穩(wěn)定性毒素B亞單位基因EtxB與腫瘤抗原基因連接，制成一種融合基因腫瘤疫苗。腫瘤抗原的免疫原性弱，而細(xì)菌抗原EtxB的免疫原性強(qiáng)，免疫系統(tǒng)對(duì)細(xì)菌抗原會(huì)產(chǎn)生很強(qiáng)的免疫應(yīng)答反應(yīng)，而在反應(yīng)中被激活的針對(duì)細(xì)菌抗原的CD4Th免疫細(xì)胞可通過鏈接產(chǎn)生針對(duì)腫瘤抗原的體液免疫和細(xì)胞免疫，從而高效增強(qiáng)腫瘤疫苗的效力)。[例1]

(2024·南通高三質(zhì)檢)OsGLO1、EcCAT、EcGCL和TSR四個(gè)基因分別編碼四種不同的酶，研究人員將這些基因分別與葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽(引導(dǎo)合成的蛋白質(zhì)進(jìn)入葉綠體)基因連接，構(gòu)建多基因表達(dá)載體(載體中部分序列如下圖所示)，利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化水稻，在水稻葉綠體內(nèi)構(gòu)建了一條新代謝途徑，提高了水稻的產(chǎn)量。下列敘述正確的是(

)A.四個(gè)基因轉(zhuǎn)錄時(shí)都以DNA的同一條單鏈為模板B.四個(gè)基因都在水稻葉綠體內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄、翻譯C.應(yīng)選用含卡那霉素的培養(yǎng)基篩選被農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的水稻細(xì)胞D.可用抗原—抗體雜交技術(shù)檢測(cè)四種酶在轉(zhuǎn)基因水稻中的表達(dá)情況D[例2]

(2024·北京海淀區(qū)高三上學(xué)期期末節(jié)選)(2)熱纖梭菌中Co和Do蛋白能以高親和力相互作用，形成復(fù)合物?？蒲腥藛T將Cas9蛋白的N端和C端兩個(gè)片段分別與Co和Do蛋白融合，構(gòu)建Cas9(N)－Co復(fù)合物和Cas9(C)－Do復(fù)合物，這兩個(gè)復(fù)合物在細(xì)胞中相遇時(shí)，Cas9可恢復(fù)全酶活性，科研人員構(gòu)建圖1所示的表達(dá)載體，導(dǎo)入受體細(xì)胞。啟動(dòng)子1為遠(yuǎn)紅光誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，啟動(dòng)子2為持續(xù)表達(dá)啟動(dòng)子。據(jù)此分析，在沒有遠(yuǎn)紅光照射時(shí)，受體細(xì)胞中Cas9(N)、Cas9(C)和Cas9蛋白的存在狀態(tài)及位置是_____________________________________。無Cas9(N)和Cas9，Cas9(C)存在于細(xì)胞質(zhì)與持續(xù)表達(dá)Cas9全酶相比，上述方法的優(yōu)勢(shì)是__________________________________________________________________________________________________。

僅在遠(yuǎn)紅光誘導(dǎo)時(shí)才有全酶進(jìn)入細(xì)胞核，可減少Cas9全酶長(zhǎng)時(shí)間在細(xì)胞核中對(duì)非目標(biāo)DNA的切割3.獲得融合基因的方法——以重疊延伸PCR技術(shù)為例以融合基因M和基因N為例，步驟是：(1)設(shè)計(jì)4種引物：引物1和引物4為普通引物。引物2的3′端含有基因M的序列，5′端含有基因N的序列；引物3的3′端含有基因N的序列，5′端含有基因M的序列；引物2和引物3完全互補(bǔ)配對(duì)。(2)PCR擴(kuò)增：利用引物1和引物2擴(kuò)增基因M，2輪循環(huán)可得到M′型DNA分子；利用引物3和引物4擴(kuò)增基因N，2輪循環(huán)可得到N′型DNA分子。(3)獲得融合基因M＋N：將M′型DNA分子和N′型DNA分子放在同一個(gè)PCR管里，變性、復(fù)性、延伸后，就得到了拼接好的融合基因M＋N。[例3]

(2024·江西南昌質(zhì)檢)透明顫菌血紅蛋白基因vgb表達(dá)產(chǎn)物VHb蛋白能使其在低氧的環(huán)境中生長(zhǎng)良好。頂頭孢霉是好氧型真菌，其發(fā)酵產(chǎn)物頭孢菌素C有很大的市場(chǎng)需求量，但低氧環(huán)境影響其產(chǎn)量，傳統(tǒng)發(fā)酵生產(chǎn)的增氧成本高。為提高產(chǎn)量科研人員將透明顫菌血紅蛋白基因vgb基因和頂頭孢霉pcpC啟動(dòng)子進(jìn)行PCR拼接，并與質(zhì)粒1構(gòu)建重組質(zhì)粒，如下圖。注：hph是潮霉素抗性基因，Vgb基因與hph基因共用終止子。回答下列問題：(1)PCR過程除了需要引物外，還需要的條件有________________________________________________________(寫三點(diǎn))。pcpC啟動(dòng)子是____________識(shí)別和結(jié)合的部位。(2)據(jù)圖所示，重疊延伸PCR拼接時(shí)，若啟動(dòng)子啟動(dòng)方向與引物3延伸方向一致，引物2和引物3的5′端需分別添加_______________的酶切位點(diǎn)。拼接形成重組基因的目的是_________________________________________________________________________。DNA模板、四種游離的脫氧核苷酸、耐高溫的DNA聚合酶RNA聚合酶XbaⅠ、BamHⅠ使頂頭孢霉在低氧的環(huán)境中生長(zhǎng)良好，提高其發(fā)酵產(chǎn)物頭孢菌素C的產(chǎn)量(3)利用含有____________的選擇培養(yǎng)基初步篩選菌種；最后從個(gè)體生物學(xué)水平上鑒定，若在低氧環(huán)境下，檢測(cè)到頭孢菌素C表達(dá)量________，則表示轉(zhuǎn)化成功。潮霉素增多4.融合蛋白的分離(1)融合蛋白存在的問題如果二者翻譯成一條多肽鏈，有可能影響彼此的折疊和空間結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響彼此的生物學(xué)活性；如果二者翻譯成一條多肽鏈，有可能影響彼此的亞細(xì)胞定位。目的蛋白不能正確的進(jìn)入它正常要去的場(chǎng)所，導(dǎo)致不能正常的發(fā)揮生物學(xué)功能。(2)融合蛋白分離措施①使用2A序列：2A序列是一對(duì)來源于病毒的短肽(18～25個(gè)氨基酸)，通常被稱為“自我剪切肽”，能使一條轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物產(chǎn)生多種蛋白，其原理如圖：②使用“IRES序列”：“IRES”是內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)序列，能招募核糖體對(duì)mRNA進(jìn)行翻譯，使用單個(gè)啟動(dòng)子啟動(dòng)多個(gè)基因表達(dá)時(shí)，可以將多個(gè)基因通過IRES序列分隔開，一條mRNA就會(huì)翻譯成多條多肽鏈，其原理如圖：[例4]

(2024·江蘇南通一模)通常真核細(xì)胞翻譯的起始必須依賴于mRNA的5′端帽子結(jié)構(gòu)，而內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)則是位于mRNA內(nèi)部的核糖體識(shí)別、結(jié)合序列，IRES使翻譯可以從mRNA內(nèi)部開始。人溶菌酶和人乳鐵蛋白是人乳中重要的抗菌蛋白，科研人員構(gòu)建人溶菌酶基因(hLYZ)和人乳鐵蛋白基因(hLTF)雙基因表達(dá)載體，并獲得轉(zhuǎn)基因牛胚胎。如圖表示雙基因表達(dá)載體的主要構(gòu)建過程，請(qǐng)回答下列問題。限制酶識(shí)別序列：BamHⅠ：G↓GATCCNheⅠ：G↓CTAGCXbaⅠ：T↓CTAGA相關(guān)結(jié)構(gòu)：Ori：復(fù)制原點(diǎn)AmpR：氨芐青霉素抗性基因NeoR：新霉素抗性基因(1)IRES的基本組成單位是__________，翻譯時(shí)核糖體在mRNA移動(dòng)的方向是________(填“5′→3′”或“3′→5′”)。與兩個(gè)基因直接連接形成融合基因相比，兩個(gè)基因之間插入IRES序列的意義是_____________________________________________________________________。核糖核苷酸5′→3′便于得到兩種具有功能的蛋白質(zhì)(一種mRNA可翻譯形成兩種蛋白質(zhì))(2)為實(shí)現(xiàn)hLTF與IRES序列的連接，在PCR擴(kuò)增基因片段時(shí)通常在引物的5′端添加特定的限制酶識(shí)別序列，而不在3′端添加的原因是__________________________________________________________________。(3)過程①中，用_________________切割質(zhì)粒a、b后，再用________(方法)分離，收集質(zhì)粒a的hLTF片段，與質(zhì)粒b的大片段連接，獲得重組質(zhì)粒1。使引物的3′端與模板鏈嚴(yán)格互補(bǔ)配對(duì)，保證子鏈的延伸XbaⅠ和NheⅠ電泳法(4)過程②中，用BamHⅠ分別處理重組質(zhì)粒1和質(zhì)粒c，再連接形成的重組質(zhì)粒不止一種，這是因?yàn)開__________________________________________________________________。用BamHⅠ對(duì)重組質(zhì)粒2進(jìn)行酶切，獲得的DNA片段大小為_______________________。

目的基因與質(zhì)粒c存在正反連接、目的基因多拷貝與質(zhì)粒c連接等3.2kb和8.2kb(5)科研人員以包含重組質(zhì)粒2的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染乳腺上皮細(xì)胞時(shí)，在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入一定濃度的新霉素的主要目的是______________________________________。選擇乳腺上皮細(xì)胞作為受體細(xì)胞便于檢測(cè)______________________________________。便于篩選導(dǎo)入重組質(zhì)粒2的牛乳腺上皮細(xì)胞hLYZ和hLTF(目的基因)能否表達(dá)(6)研究人員試圖以轉(zhuǎn)hLYZ與hLTF的奶牛乳腺上皮細(xì)胞作為供體細(xì)胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因克隆胚胎，在此過程中主要涉及的現(xiàn)代生物技術(shù)有________________________________________________________________________________________________________(答出兩條即可)。體細(xì)胞核移植技術(shù)、早期胚胎培養(yǎng)技術(shù)(動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)、卵母細(xì)胞采集與培養(yǎng)技術(shù))突破3

酵母雙雜交系統(tǒng)與免疫共沉淀(2022·山東卷，25)某種類型的白血病由蛋白P引發(fā)，蛋白UBC可使P被蛋白酶識(shí)別并降解，藥物A可通過影響這一過程對(duì)該病起到治療作用。為探索藥物A治療該病的機(jī)理，需構(gòu)建重組載體以獲得融合蛋白FLAG－P和FLAG－P△。P△是缺失特定氨基酸序列的P，F(xiàn)LAG是一種短肽，連接在P或P△的氨基端，使融合蛋白能與含有FLAG抗體的介質(zhì)結(jié)合，但不影響P或P△的功能。(1)為構(gòu)建重組載體，需先設(shè)計(jì)引物，通過PCR特異性擴(kuò)增P基因。用于擴(kuò)增P基因的引物需滿足的條件是__________________________________________________________，為使PCR產(chǎn)物能被限制酶切割，需在引物上添加相應(yīng)的限制酶識(shí)別序列，該限制酶識(shí)別序列應(yīng)添加在引物的________(填“3′端”或“5′端”)。能與P基因母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對(duì)、短單鏈核酸5′端(2)PCR擴(kuò)增得到的P基因經(jīng)酶切連接插入載體后，與編碼FLAG的序列形成一個(gè)融合基因，如圖甲所示，其中“ATGTGCA”為P基因編碼鏈起始序列。將該重組載體導(dǎo)入細(xì)胞后，融合基因轉(zhuǎn)錄出的mRNA序列正確，翻譯出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正確，但P基因?qū)?yīng)的氨基酸序列與P不同。據(jù)圖甲分析，出現(xiàn)該問題的原因是_________________________________________________________________________________________________________________________。P基因編碼鏈的第一個(gè)堿基與EcoRⅠ識(shí)別序列的最后兩個(gè)堿基編碼一個(gè)氨基酸，導(dǎo)致mRNA的密碼子被錯(cuò)位讀取修改擴(kuò)增P基因時(shí)使用的帶有EcoRⅠ識(shí)別序列的引物來解決該問題，具體修改方案是_________________________________________________________________。圖甲在引物中的EcoRⅠ識(shí)別序列3′端添加1個(gè)堿基(3)融合蛋白表達(dá)成功后，將FLAG－P、FLAG－P△、藥物A和UBC按照?qǐng)D乙中的組合方式分成5組。各組樣品混勻后分別流經(jīng)含F(xiàn)LAG抗體的介質(zhì)，分離出與介質(zhì)結(jié)合的物質(zhì)并用UBC抗體檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖丙所示。已知FLAG－P和FLAG－P△不能降解UBC，由①②③組結(jié)果的差異推測(cè)，藥物A的作用是______________________________________________________________；增強(qiáng)FLAG－P與UBC的結(jié)合由②④組或③⑤組的差異推測(cè)，P△中缺失的特定序列的作用是______________________。(4)根據(jù)以上結(jié)果推測(cè)，藥物A治療該病的機(jī)理是_________________________________________________________________。參與P與UBC的結(jié)合藥物A通過增強(qiáng)P與UBC結(jié)合，促進(jìn)P降解角度1酵母雙雜交系統(tǒng)1.酵母菌的轉(zhuǎn)錄激活因子含有兩個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域：DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(BD)和DNA轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(AD)，這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域可以獨(dú)立分開，功能互不影響。2.BD和AD分別單獨(dú)作用并不能激活轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，只有當(dāng)二者在空間上充分接近時(shí)，才呈現(xiàn)完整的轉(zhuǎn)錄激活因子活性，使下游基因得到轉(zhuǎn)錄，可將兩個(gè)待研究蛋白(蛋白X與蛋白Y)分別與BD、AD結(jié)構(gòu)域構(gòu)建質(zhì)粒來探究其是否具有相互作用，如果X與Y不存在相互作用，則下游基因不會(huì)表達(dá)；如果X與Y存在相互作用，則下游基因表達(dá)。(如圖所示)命題要點(diǎn)提醒：(1)一般不將BD－X與AD－Y兩融合蛋白構(gòu)建在同一質(zhì)粒上，而是將BD－X與AD－Y構(gòu)建在兩個(gè)質(zhì)粒上，然后共轉(zhuǎn)染到同一酵母細(xì)胞。(2)下游常用熒光蛋白基因作為報(bào)告基因來驗(yàn)證X與Y是否有相互作用。(3)融合基因的構(gòu)建：如想要把兩基因(CD163與RFP)融合并成功表達(dá)出對(duì)應(yīng)的融合蛋白，要將上游基因即靠近啟動(dòng)子的基因(CD163)中編碼終止密碼子的序列去除，這樣才不會(huì)使得在融合蛋白表達(dá)過程中翻譯完CD163后終止。[例1]

蛋白質(zhì)甲基化是最廣泛的翻譯后修飾之一，組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶G9a主要修飾蛋白質(zhì)中賴氨酸、精氨酸，從而調(diào)控基因表達(dá)。酵母細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄因子BD(含賴氨酸)和AD兩結(jié)構(gòu)域結(jié)合時(shí)才能激活轉(zhuǎn)錄，兩結(jié)構(gòu)域分開時(shí)不能激活轉(zhuǎn)錄，為了篩選賴氨酸甲基化閱讀器(只有甲基化的賴氨酸才能被“閱讀器”識(shí)別)，研究人員進(jìn)行了如圖1所示實(shí)驗(yàn)，其中TRP1、LEU2分別是色氨酸、亮氨酸合成基因，G9a基因表達(dá)產(chǎn)物(含G9a)能與BD基因表達(dá)產(chǎn)物結(jié)合，當(dāng)賴氨酸甲基化閱讀器與G9a、BD復(fù)合體相互作用后，BD就可以與AD一起激活報(bào)告基因LacZ轉(zhuǎn)錄，如圖2。請(qǐng)回答下列問題。(1)組蛋白甲基化影響基因表達(dá)水平，并可遺傳給后代，這種現(xiàn)象________(填“屬于”或“不屬于”)基因突變，________(填“會(huì)”或“不會(huì)”)遺傳給后代。(2)為了使“閱讀器”基因定向插入載體中，通過PCR技術(shù)擴(kuò)增“閱讀器”基因時(shí)，需在引物5′端添加______________________________________序列。不屬于會(huì)GAATTC、GGATCC(3)質(zhì)粒甲、乙導(dǎo)入代謝缺陷型酵母菌時(shí)，需用氯化鈣(CaCl2)處理酵母菌，其目的是____________________________________________________________________________________。兩培養(yǎng)基中需分別不添加________________才可篩選出導(dǎo)入重組質(zhì)粒的酵母菌。轉(zhuǎn)化后需要在相應(yīng)的培養(yǎng)基上培養(yǎng)和篩選，選擇導(dǎo)入了__________________________________________(填“融合表達(dá)載體”“報(bào)告基因載體”或“融合表達(dá)載體和報(bào)告基因載體”)的酵母細(xì)胞。使酵母菌處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)，有利于吸收外源DNA色氨酸、亮氨酸融合表達(dá)載體和報(bào)告基因載體(4)已知LacZ基因表達(dá)產(chǎn)物，能將無色化合物X－gal水解成藍(lán)色產(chǎn)物。Y2H和Y187接合生殖、培養(yǎng)時(shí)，如需篩選Y3H中含所需的“閱讀器”，所需要進(jìn)行的操作是：_______________________________________________________________________________________________________________。Y2H和Y187在含有無色化合物X－gal的培養(yǎng)基上完成接合生殖、培養(yǎng)，并在Y3H中挑選藍(lán)色菌落角度2免疫共沉淀1.探究蛋白是否有相互作用 (1)加標(biāo)簽：通過構(gòu)建融合基因完成，A蛋白添加Flag標(biāo)簽，B蛋白添加HA標(biāo)簽。 (2)拉蛋白：使蛋白提取混合物通過含有Flag抗體的介質(zhì)，這樣就可將含有Flag標(biāo)簽的蛋白質(zhì)篩選出來。(3)共沉淀檢測(cè)：該沉淀復(fù)合物如用A蛋白抗體檢測(cè)為陽性，如圖①，然后在沉淀復(fù)合物中添加HA標(biāo)簽的抗體，如果顯示陽性，則表明A蛋白和B蛋白有相互作用，如圖②，在沉淀復(fù)合物中添加B蛋白的抗體，如果