分子生物學(xué) 分子生物學(xué)研究方法（上）課件

分子生物學(xué)_許曉東_5-NXPowerLite5分子生物學(xué)研究方法（上）——DNA、RNA及蛋白質(zhì)操作技術(shù)分子生物學(xué)_許曉東_5-NXPowerLite

從20世紀(jì)中葉開始，分子生物學(xué)研究得到高速發(fā)展，主要原因之一是研究方法，特別是基因操作和基因工程技術(shù)的進(jìn)步。 基因操作主要包括DNA分子的切割與連接、核酸分子雜交、凝膠電泳、細(xì)胞轉(zhuǎn)化、核酸序列分析以及基因人工合成、定點(diǎn)突變和PCR擴(kuò)增等，是分子生物學(xué)研究的核心技術(shù)。分子生物學(xué)_許曉東_5-NXPowerLite基因工程是指在體外將核酸分子插入病毒、質(zhì)?；蚱渌d體分子，構(gòu)成遺傳物質(zhì)的新組合，使之進(jìn)入原先沒有這類分子的寄主細(xì)胞內(nèi)并進(jìn)行持續(xù)穩(wěn)定的繁殖和表達(dá)?；蚬こ碳夹g(shù)是核酸操作技術(shù)的一部分，只不過它強(qiáng)調(diào)了外源核酸分子在另一種不同的寄主細(xì)胞中的繁衍與性狀表達(dá)。事實(shí)上，這種跨越物種屏障、把來自其它生物的基因置于新的寄主生物細(xì)胞之中的能力，是基因工程技術(shù)區(qū)別于其它技術(shù)的根本特征。分子生物學(xué)_許曉東_5-NXPowerLite5.1重組DNA技術(shù)回顧三大成就40年代確定了遺傳信息的攜帶者，即基因的分子載體是DNA而不是蛋白質(zhì)，解決了遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)問題；50年代提示了DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和半保留復(fù)制機(jī)制,解決了基因的自我復(fù)制和世代交替問題；50年代末至60年代，相繼提出了“中心法則”和操縱子學(xué)說,成功地破譯了遺傳密碼，充分認(rèn)識(shí)了遺傳信息的流動(dòng)和表達(dá)。

分子生物學(xué)_許曉東_5-NXPowerLite重組DNA技術(shù)歷史上的主要事件年份事

件

1869FMiescher首次從萊茵河鮭魚精子中分離DNA。1944O.T.Avery證實(shí)DNA是遺傳物質(zhì)。1952A.D.Hershey和M.Chase再次證實(shí)和噬菌體的遺傳物質(zhì)是DNA。1953J.D.Watson和F.H.C.Crick提出DNA分子結(jié)構(gòu)的雙螺旋模型。M.Wilkins用X-射線衍射法證實(shí)了這一結(jié)構(gòu)。1957A.Kornberg從大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)了DNA聚合酶I。1958M.Meselson和F.W.Stahl提出了DNA的半保留復(fù)制模型。1959-1960S.Ochoa發(fā)現(xiàn)RNA聚合酶和信使RNA，并證明mRNA決定了蛋白質(zhì)分子中的氨基酸序列。1961Nirenberg破譯了第一個(gè)遺傳密碼；F.Jacob和J.Monod提出了調(diào)節(jié)基因表達(dá)的操縱子模型。1964

C.Yanofsky和S.Brenner等人證明，多肽鏈上的氨基酸序列與該基因中的核苷酸序列存在著共線性關(guān)系。分子生物學(xué)_許曉東_5-NXPowerLite1965

S.W.Holley完成了酵母丙氨酸t(yī)RNA的全序列測(cè)定；科學(xué)家證明細(xì)菌的抗藥性通常由"質(zhì)粒"DNA所決定。1966

M.W.Nirenberg，S.Ochoa、H.G.Khorana、F.H.C.Crick等人破譯了全部遺傳密碼。1970H.O.Smith，K.W.Wilcox和T.J.Kelley分離了第一種限制性核酸內(nèi)切酶。H.M.Temin和D.Baltimore從RNA腫瘤病毒中發(fā)現(xiàn)反轉(zhuǎn)錄酶。1972-1973H.Boyer，P.Berg等人發(fā)展了DNA重組技術(shù)，于72年獲得第一個(gè)重組DNA分子，73年完成第一例細(xì)菌基因克隆。1975-1977F.Sanger與A.Maxam、W.Gilbert等人發(fā)明了DNA序列測(cè)定技術(shù)。1977年完成了全長(zhǎng)5387bp的噬菌體φ174基因組測(cè)定。1978

首次在大腸桿菌中生產(chǎn)由人工合成基因表達(dá)的人腦激素和人胰島素。1980美國(guó)聯(lián)邦最高法院裁定微生物基因工程可以專利化。1981R.D.Palmiter和R.L.Brinster獲得轉(zhuǎn)基因小鼠；A.C.Spradling和G.M.Rubin得到轉(zhuǎn)基因果蠅。分子生物學(xué)_許曉東_5-NXPowerLite1982美、英批準(zhǔn)使用第一例基因工程藥物--胰島素；Sanger等人完成了λ噬菌體48,502bp全序列測(cè)定。1983

獲得第一例轉(zhuǎn)基因植物。1984

斯坦福大學(xué)獲得關(guān)于重組DNA的專利。1986

GMO(geneticallymodifiedorganism)首次在環(huán)境中釋放。1988

J.D.Watson出任"人類基因組計(jì)劃"首席科學(xué)家。1989DuPont公司獲得轉(zhuǎn)腫瘤基因小鼠--"Oncomouse"。1992

歐共體35個(gè)實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合完成酵母第三染色體全序列測(cè)定。1994第一批基因工程西紅柿在美國(guó)上市。1996完成了酵母基因組(1.25×107bp)全序列測(cè)定。1997英國(guó)愛丁堡羅斯林研究所獲得克隆羊。2000完成第一個(gè)高等植物擬南芥的全序列測(cè)定。2001完成第一個(gè)人類基因組全序列測(cè)定。2004中國(guó)科學(xué)家完成家蠶基因組全序列測(cè)定。2005中、美、日科學(xué)家聯(lián)合完成水稻基因組全序列測(cè)定。分子生物學(xué)_許曉東_5-NXPowerLite質(zhì)粒是真核細(xì)胞細(xì)胞核外或原核生物擬核區(qū)外能夠進(jìn)行自主復(fù)制的遺傳單位，包括真核生物的細(xì)胞器（主要指線粒體和葉綠體）中和細(xì)菌細(xì)胞擬核區(qū)以外的環(huán)狀脫氧核糖核酸(DNA)分子。現(xiàn)在習(xí)慣上用來專指細(xì)菌、酵母菌和放線菌等生物中染色體DNA以外的DNA分子。在基因工程中質(zhì)粒常被用做基因的載體(Vector)。嚴(yán)緊型質(zhì)粒，當(dāng)細(xì)胞染色體復(fù)制一次時(shí)，質(zhì)粒也復(fù)制一次，每個(gè)細(xì)胞內(nèi)只有1～2個(gè)質(zhì)粒。松弛型質(zhì)粒，當(dāng)染色體復(fù)制停止后仍然能繼續(xù)復(fù)制，每一個(gè)細(xì)胞內(nèi)一般有10-200份拷貝，如果用一定的藥物處理（如氯霉素）抑制寄主蛋白質(zhì)的合成還會(huì)使質(zhì)?？截悢?shù)增至幾千份。功能：進(jìn)行細(xì)胞間接合，并帶有一些基因，如產(chǎn)生毒素、抗藥性、固氮、產(chǎn)生酶類、降解功能等。質(zhì)粒分子生物學(xué)_許曉東_5-NXPowerLite一個(gè)質(zhì)粒實(shí)例分子生物學(xué)_許曉東_5-NXPowerLite限制性內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶能夠識(shí)別DNA上的特定堿基序列并從這個(gè)位點(diǎn)切開DNA分子。1972年Boyer實(shí)驗(yàn)室第一個(gè)發(fā)現(xiàn)了核酸內(nèi)切酶EcoRI的識(shí)別序列。命名：Escherichia

coli

RY13中第一個(gè)內(nèi)切酶EcoRIEcoRIEcoRVBsaISfiI同裂酶ApaIGGGCC/CPspOMIG/GGCCC同工同裂酶EcoRIG/AATTCFunIIG/AATTC同尾酶NcoIC/CATGGBspHIT/CATGA分子生物學(xué)_許曉東_5-NXPowerLite雙酶切分子生物學(xué)_許曉東_5-NXPowerLite單酶切分子生物學(xué)_許曉東_5-NXPowerLite去磷酸化防止自連分子生物學(xué)_許曉東_5-NXPowerLiteNcoIBspHIPciIBsaI一個(gè)克隆實(shí)驗(yàn)實(shí)例NcoI載體質(zhì)粒上的多克隆位點(diǎn)分子生物學(xué)_許曉東_5-NXPowerLite限制性核酸內(nèi)切酶切割DNADNA連接酶生成3′-5′磷酸二酯鍵DNA聚合酶Ⅰ探針標(biāo)記、補(bǔ)平3′末端反轉(zhuǎn)錄酶cDNA合成多聚核苷酸激酶5′磷酸化、探針標(biāo)記末端轉(zhuǎn)移酶3′末端多聚尾吧堿性磷酸酶3′切除末端磷酸基DNA外切酶Ⅲ3′末端切除單核苷酸λ噬菌體DNA外切酶5′末端切除單核苷酸重組DNA實(shí)驗(yàn)中常見的主要工具酶分子生物學(xué)_許曉東_5-NXPowerLite轉(zhuǎn)化外源DNA的進(jìn)入而使細(xì)胞遺傳性改變稱為轉(zhuǎn)化。早在1943年，Avery等就發(fā)現(xiàn)有毒肺炎雙球菌的DNA與無毒肺炎雙球菌共培養(yǎng)后產(chǎn)生有毒性的肺炎雙球菌后代的轉(zhuǎn)化現(xiàn)象。由于天然狀態(tài)下DNA進(jìn)入細(xì)胞的效率很低，在分子生物學(xué)和基因工程工作中可采取一些方法處理細(xì)胞，經(jīng)處理后的細(xì)胞就容易接受外界DNA，稱為感受態(tài)細(xì)胞，再與外源DNA接觸，就能提高轉(zhuǎn)化效率。例如大腸桿菌經(jīng)冰冷CaCl2的處理，就成為感受態(tài)細(xì)菌，當(dāng)加入重組質(zhì)粒并突然由4℃轉(zhuǎn)入42℃作短時(shí)間處理，質(zhì)粒DNA就能進(jìn)入細(xì)菌；用高電壓脈沖短暫作用于細(xì)菌也能顯著提高轉(zhuǎn)化效率，這稱為電穿孔（electroporation）轉(zhuǎn)化法。分子生物學(xué)_許曉東_5-NXPowerLite將連接有所需要的DNA的載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞的常用方法有四種：

①轉(zhuǎn)化，用質(zhì)粒作載體所常用的方法。

②轉(zhuǎn)染，用噬菌體DNA作載體所用的方法，這里所用的噬菌體DNA并沒有包上它的外殼。轉(zhuǎn)染是轉(zhuǎn)化的一種特殊形式。

③轉(zhuǎn)導(dǎo)，用噬菌體作載體所用的方法，這里所用的噬菌體DNA被包上了它的外殼，不過這外殼并不是在噬菌體感染過程中包上，而是在離體情況下包上的，所以稱為離體包裝。

④注射，如果宿主是比較大的動(dòng)植物細(xì)胞則可以用注射方法把重組DNA分子導(dǎo)入。分子生物學(xué)_許曉東_5-NXPowerLite分子生物學(xué)_許曉東_5-NXPowerLite核酸凝膠電泳技術(shù)細(xì)菌轉(zhuǎn)化與目標(biāo)DNA分子的增殖聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)實(shí)時(shí)定量PCR基因組DNA文庫構(gòu)建5.2DNA基本操作技術(shù)分子生物學(xué)_許曉東_5-NXPowerLite5.2.1核酸凝膠電泳技術(shù)在生理?xiàng)l件下，核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基團(tuán)，呈離子化狀態(tài)，DNA和RNA多核苷酸鏈稱為多聚陰離子，把它們放置在電場(chǎng)當(dāng)中，會(huì)向正電極的方向遷移。由于糖-磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性質(zhì)，相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以同樣的速度向正電極方向遷移。在一定的電場(chǎng)強(qiáng)度下，DNA分子的遷移速度，取決于核酸分子本身的大小和構(gòu)型。這就是應(yīng)用凝膠電泳技術(shù)分離DNA片段的基本原理。分子生物學(xué)_許曉東_5-NXPowerLite準(zhǔn)備膠板配制瓊脂糖凝膠倒膠分子生物學(xué)_許曉東_5-NXPowerLite上樣分子生物學(xué)_許曉東_5-NXPowerLite分子生物學(xué)_許曉東_5-NXPowerLite溴化乙錠由于插入了溴化乙錠分子，在紫外光照射下，瓊脂糖凝膠電泳中DNA的條帶便呈現(xiàn)出橘黃色熒光，易于鑒定。分子生物學(xué)_許曉東_5-NXPowerLiteDNA的遷移速度與構(gòu)型有關(guān)分子生物學(xué)_許曉東_5-NXPowerLite聚丙烯酰胺凝膠電泳分子生物學(xué)_許曉東_5-NXPowerLiteDNA雙脫氧法測(cè)序原理分子生物學(xué)_許曉東_5-NXPowerLite普通的瓊脂糖凝膠電泳，很難分離大于50kb的DNA分子，而要進(jìn)行超大分子研究，要用到脈沖電場(chǎng)凝膠電泳分子生物學(xué)_許曉東_5-NXPowerLite脈沖電場(chǎng)凝膠電泳原理分子生物學(xué)_許曉東_5-NXPowerLite脈沖電場(chǎng)凝膠電泳效果分子生物學(xué)_許曉東_5-NXPowerLite5.2.2細(xì)菌轉(zhuǎn)化與目標(biāo)DNA分子的增殖準(zhǔn)備轉(zhuǎn)化態(tài)細(xì)胞42℃熱沖擊電轉(zhuǎn)化加入外源DNA細(xì)胞復(fù)蘇平板篩選CaCl210%甘油藍(lán)白斑篩選+抗生素+IPTG+X-gal要靈活運(yùn)用，根據(jù)不同情況設(shè)計(jì)篩選策略！分子生物學(xué)_許曉東_5-NXPowerLite電轉(zhuǎn)化儀分子生物學(xué)_許曉東_5-NXPowerLite利用噬菌體顆粒能夠有效將DNA注入到宿主細(xì)胞這一特點(diǎn)，科學(xué)家又發(fā)明了DNA分子的體外包裝法分子生物學(xué)_許曉東_5-NXPowerLite延伸：其他基因?qū)敕椒ǚ肿由飳W(xué)_許曉東_5-NXPowerLite藍(lán)白斑篩選分子生物學(xué)_許曉東_5-NXPowerLite5.2.3聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)模板引物DNA聚合酶dNTPMg2+PolymeraseChainReaction，PCR分子生物學(xué)_許曉東_5-NXPowerLite變性退火延伸分子生物學(xué)_許曉東_5-NXPowerLitePCR引物設(shè)計(jì)：①引物的長(zhǎng)度一般為15-30bp。

②引物在模板內(nèi)最好具有單一性，特別是3’端。

③引物序列的GC含量最好在40％一60％，且上下游引物序列GC含量的差異不要太大。

④避免形成穩(wěn)定的引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)。引物二聚體引物不專一分子生物學(xué)_許曉東_5-NXPowerLite聚合酶（Taq酶）Taq酶是從水生棲熱菌ThermusAquaticus（Taq）中分離出的具有熱穩(wěn)定性的DNA聚合酶。與一般酶不同,用Taq酶擴(kuò)增DNA時(shí)常使3‘端凸出一個(gè)A，可用于TACloning.分子生物學(xué)_許曉東_5-NXPowerLiteRT-PCR(反轉(zhuǎn)錄PCR)分子生物學(xué)_許曉東_5-NXPowerLite5.2.4實(shí)時(shí)定量PCR分子生物學(xué)_許曉東_5-NXPowerLite分子生物學(xué)_許曉東_5-NXPowerLiteTaqMan熒光探針SYBRGreen熒光染料分子生物學(xué)_許曉東_5-NXPowerLite5.2.5基因組DNA文庫的構(gòu)建從生物組織細(xì)胞提取出全部DNA將其切成預(yù)期大小的片段，分別與載體連接，轉(zhuǎn)入受體細(xì)菌或細(xì)胞，形成克隆。這樣每一個(gè)細(xì)胞接受了含有一個(gè)基因組DNA片段與載體連接的重組DNA分子，而且可以繁殖擴(kuò)增，許多細(xì)胞一起組成一個(gè)含有基因組各DNA片段克隆的集合體，就稱為基因組DNA文庫。如果這個(gè)文庫足夠大，能包含該生物基因組DNA全部的序列，就是該生物完整的基因組文庫。分子生物學(xué)_許曉東_5-NXPowerLite用λ噬菌體建立DNA文庫示意圖其他載體：bacterialartificialchromosome(BAC)p1artificialchromosome(PAC)yeastartificialchromosome(PAC)分子生物學(xué)_許曉東_5-NXPowerLite5.3RNA基本操作技術(shù)總RNA的提取mRNA的純化cDNA的合成cDNA文庫的構(gòu)建基因文庫的篩選分子生物學(xué)_許曉東_5-NXPowerLite5.3.1總RNA的提取RNA易遭降解，實(shí)驗(yàn)要求較嚴(yán)格?？俁NA提取的方法有多種，主要有LiCl法、CTAB法、異硫氰酸胍法（TriZol）。異硫氰酸胍法（TriZol）原理：TRIZOL試劑中的主要成分為異硫氰酸胍和苯酚，其中異硫氰酸胍可裂解細(xì)胞，促使核蛋白體的解離，使RNA與蛋白質(zhì)分離，并將RNA釋放到溶液中。當(dāng)加入氯仿時(shí)，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA進(jìn)入水相，離心后可形成水相層和有機(jī)層，這樣RNA與仍留在有機(jī)相中的蛋白質(zhì)和DNA分離開。水相層（無色）主要為RNA，有機(jī)層（黃色）主要為DNA和蛋白質(zhì)。分子生物學(xué)_許曉東_5-NXPowerLite5.3.2mRNA的純化分子生物學(xué)_許曉東_5-NXPowerLite5.3.3cDNA的合成cDNA(complementaryDNA)分子生物學(xué)_許曉東_5-NXPowerLite分子生物學(xué)_許曉東_5-NXPowerLite5.3.4cDNA文庫的構(gòu)建cDNA文庫是指某生物某發(fā)育時(shí)期所轉(zhuǎn)錄的全部mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄形成的cDNA片段與某種載體連接而形成的克隆的集合。經(jīng)典cDNA文庫構(gòu)建的基本原理是用Oligo(dT)作逆轉(zhuǎn)錄引物，或者用隨機(jī)引物，給所合成的cDNA加上適當(dāng)?shù)倪B接接頭，連接到適當(dāng)?shù)妮d體中獲得文庫。步驟：在獲得高質(zhì)量的mRNA后，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，合成接頭的加入、將雙鏈DNA克隆到載體中去、分析cDNA插入片斷，擴(kuò)增cDNA文庫、對(duì)建立的cDNA文庫進(jìn)行鑒定。這里強(qiáng)調(diào)的是對(duì)載體的選擇，常規(guī)用的是λ噬菌體，這是因?yàn)棣薉NA兩端具有由12個(gè)核苷酸的粘性末端，可用來構(gòu)建柯斯質(zhì)粒，這種質(zhì)粒能容納大片段的外源DNA。分子生物學(xué)_許曉東_5-NXPowerLite5.3.4基因文庫的篩選基因文庫的篩選是指通過某種特殊方法從基因文庫中鑒定出含有所需重組DNA分子的特定克隆的過程。篩選方法有很多種，常用的有：核酸雜交法PCR篩選法免疫篩選法分子生物學(xué)_許曉東_5-NXPowerLite核酸雜交法分子生物學(xué)_許曉東_5-NXPowerLitePCR篩選后稀釋PCR篩選后稀釋PCR篩選后稀釋PCR篩選法分子生物學(xué)_許曉東_5-NXPowerLite免疫篩選法分子生物學(xué)_許曉東_5-NXPowerLite5.4SNP的理論與應(yīng)用人類基因組由30億個(gè)核苷酸組成，它們攜帶著人類的遺傳信息并決定人體的生理特性。人類基因組序列的0.1%-0.2%在人種、人群和個(gè)體之間存在DNA序列的差異，即單核苷酸多態(tài)性（SNP,singlenucleotidepolymorphism）。許多的這些單核苷酸多態(tài)性可引起不同的遺傳性狀，即遺傳的多態(tài)性（polymorphism），如ABO血型位點(diǎn)標(biāo)記，白細(xì)胞HLA位點(diǎn)標(biāo)記和個(gè)體藥物代謝差異等。了解這些DNA序列的差異和單核苷酸多態(tài)性以及這些差異所表現(xiàn)的意義將對(duì)疾病的預(yù)測(cè)、診斷、預(yù)后和預(yù)防帶來革命性的變化。分子生物學(xué)_許曉東_5-NXPowerLite5.5基因克隆技術(shù)在多細(xì)胞的高等生物個(gè)體水平上，人們用克?。╟lone）表示由具有相同基因型的同一物種的兩個(gè)或數(shù)個(gè)個(gè)體組成的群體。從同一受精卵分裂而來的單卵雙生子（monozygotictwins）便是屬于同一克隆。在細(xì)胞水平上，克隆一詞是指由同一個(gè)祖細(xì)胞（progenitorcell）分裂而來的一群遺傳上同一的子細(xì)胞群體。在分子生物學(xué)上，人們把將外源DNA插入具有復(fù)制能力的載體DNA中，使之得以永久保存和復(fù)制這種過程稱為克隆。分子生物學(xué)_許曉東_5-NXPowerLite5.5.1RACE技術(shù)RACE（rapidamplificationofcDNAends,cDNA末端快速擴(kuò)增）是一種獲得轉(zhuǎn)錄本5‘或3’未知序列的方法。它根據(jù)已知序列設(shè)計(jì)基因片段內(nèi)部特異引物，用cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到目的序列。用于擴(kuò)增5’端的方法稱為5’RACE，用于擴(kuò)增3’端的稱為3’RACE。已知cDNA序列可來自序列表達(dá)標(biāo)簽、減法cDNA庫、差法顯示和基因文庫篩選。分子生物學(xué)_許曉東_5-NXPowerLite分子生物學(xué)_許曉東_5-NXPowerLite5.5.2應(yīng)用cDNA差示法分析克隆基因cDNA差示分析法（representationaldifferenceanalysis,RAD）充分發(fā)揮了PCR能以指數(shù)形式擴(kuò)增雙鏈DNA模板，僅以線形形式擴(kuò)增單鏈模板的特性，通過降低cDNA群體復(fù)雜性和更換cDNA兩端接頭等方法，特異性擴(kuò)增目的基因片斷。分子生物學(xué)_許曉東_5-NXPowerLite加去磷酸化的接頭混合、變性、復(fù)性填平粘性末端指數(shù)擴(kuò)增線性擴(kuò)增無擴(kuò)增以為引物的PCR試驗(yàn)材料Tester探針材料Driver分子生物學(xué)_許曉東_5-NXPowerLite加去磷酸化的接頭混合、變性、復(fù)性填平粘性末端指數(shù)擴(kuò)增線性擴(kuò)增無擴(kuò)增以為引物的PCR試驗(yàn)材料Tester探針材料Driver分子生物學(xué)_許曉東_5-NXPowerLite5.5.3Gateway大規(guī)?？寺〖夹g(shù)分子生物學(xué)_許曉東_5-NXPowerLite分子生物學(xué)_許曉東_5-NXPowerLite分子生物學(xué)_許曉東_5-NXPowerLite分子生物學(xué)_許曉東_5-NXPowerLite5.5.4基因的位圖克隆法所有具有某種表現(xiàn)型的基因都可通過該法克隆得到。首先，通過構(gòu)建遺傳連鎖圖，將目的基因定位到某染色體的特定位點(diǎn)，并在其兩側(cè)確定緊密連鎖的RFLP或RAPD分子標(biāo)記。通過對(duì)許多不同的生態(tài)型及大量限制性內(nèi)切酶和雜交探針的分析，找出與目的基因距離最近的RFLP標(biāo)記，通過染色體步移技術(shù)將位于這兩個(gè)標(biāo)記之間的基因片段克隆并分離出來。分子生物學(xué)_許曉東_5-NXPowerLite分子生物學(xué)_許曉東_5-NXPowerLite5.6蛋白質(zhì)組與蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)蛋白質(zhì)組學(xué)（Proteomics）一詞，源于蛋白質(zhì)（protein）與基因組學(xué)（genomics）兩個(gè)詞的組合，意指“一種基因組所表達(dá)的全套蛋白質(zhì)”，即包括一種細(xì)胞乃至一種生物所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組本質(zhì)上指的是在大規(guī)模水平上研究蛋白質(zhì)的特征，包括蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，翻譯后的修飾，蛋白與蛋白相互作用等，由此獲得蛋白質(zhì)水平上的關(guān)于疾病發(fā)生，細(xì)胞代謝等過程的整體而全面的認(rèn)識(shí)。分子生物學(xué)_許曉東_5-NXPowerLite5.6.1雙向電泳技術(shù)雙向電泳（2-DE）由O’Farrell’s于1975年首次建立并成功地分離約1000個(gè)E.coli蛋白，并表明蛋白質(zhì)譜不是穩(wěn)定的，而是隨環(huán)境而變化。雙向電泳原理簡(jiǎn)明，第一向進(jìn)行等電聚焦，蛋白質(zhì)沿pH梯度分離，至各自的等電點(diǎn)；隨后，再沿垂直的方向進(jìn)行分子量的分離。pH3pH10IEFSDS分子生物學(xué)_許曉東_5-NXPowerLiteBiochem.J.(2004)378(929–937)分子生物學(xué)_許曉東_