人教版高中生物選修一專題五《DNA和蛋白質(zhì)技術(shù)》知識(shí)點(diǎn)歸納

專題五DNA和蛋白質(zhì)技術(shù)

課題一DNA的粗提取與鑒定

一、提取DNA的溶解性原理包括哪些方面？

1.DNA在不同濃度NaCl溶液中溶解度不同;DNA

不溶于酒精。

①DNA在不同濃度NaCl溶液中溶解度有何特0.14

NaCl法度(mol/L)

點(diǎn)？要使DNA溶解，須要運(yùn)用什么濃度？要使DNA

析出，又須要運(yùn)用什么濃度？

在0.14mol/L時(shí)溶解度最??；較高濃度可使DNA溶解；0.14mol/L可

使DNA析出。

②在溶解細(xì)胞中的DNA時(shí)，人們通常選用2mol/LNaCl溶液;將DNA

分子析出的方法是向溶有DNA的NaCl溶液中緩慢注入蒸儲(chǔ)水，以稀釋

NaCl溶液。酒精是一種常用有機(jī)溶劑，但DNA卻不能溶于酒精（特殊是

95%冷卻酒精），但細(xì)胞中蛋白質(zhì)可溶于酒精。

2.從理論上分析，預(yù)冷的乙醉溶液具有以下優(yōu)點(diǎn)。

一是抑制核酸水解酶活性，防止DNA降解；

二是降低分子運(yùn)動(dòng)，易于形成沉淀析出；

三是低溫有利于增加DNA分子柔韌性，削減斷裂。

3.采納DNA不溶于酒精的原理，可以達(dá)到什么目的？

將DNA和蛋白質(zhì)進(jìn)一步分別。

,4.提取DNA還可以利用DNA對(duì)酶、高溫柔洗滌劑的耐受性原理。利

用該原理時(shí)，應(yīng)選用怎樣的酶和怎樣的溫度值?

蛋白酶，因?yàn)槊妇哂袑Ｒ恍裕鞍酌钢凰獾鞍踪|(zhì)而不會(huì)對(duì)DNA產(chǎn)生

影響。溫度值為60?8(TC,因?yàn)樵摐囟戎档鞍踪|(zhì)變性沉淀，而DNA不

會(huì)變性。

補(bǔ)充：DNA的變性是指DNA分子在高溫下解螺旋，其溫度在80C以上,

如在PCR技術(shù)中DNA變性溫度在95℃o

5.洗滌劑在提取DNA中有何作用？

洗滌劑將細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)，從,而瓦解細(xì)胞膜。

6.當(dāng)鑒定提取出的物質(zhì)是否是DNA時(shí)，須要運(yùn)用什么指示劑進(jìn)行鑒

定？在沸水浴條件下，DNA遇二苯胺呈現(xiàn)藍(lán)色。

原理總結(jié)：通過利用不同濃度NaCl溶液溶

解或析出DNA,可以從細(xì)胞中提取和提純DNA;再利用酒精進(jìn)一步將

DNA與蛋白質(zhì)分別開來，達(dá)到提純的目的；最終利用二苯胺試劑鑒定提

取的物質(zhì)是否是DNAO

二、試驗(yàn)材料的選取

不同生物的組織中DNA含量不同。在選取材料時(shí)，應(yīng)本著DNA含量

高、材料易得、便于提取的原則。

本試驗(yàn)用雞血細(xì)胞做試驗(yàn)材料有兩個(gè)緣由。

一是因?yàn)殡u血細(xì)胞核的DNA含量豐富，材料易得；

二是雞血細(xì)胞極易吸水脹破，而用動(dòng)物肝臟細(xì)胞作試驗(yàn)材料經(jīng)常須要

勻漿和離心，對(duì)設(shè)備耍求較高，操作繁瑣，歷時(shí)較長。

雞血細(xì)胞裂開以后釋放出的DNA,簡單被玻璃容器吸附，所以在提取過

程中為了削減DNA的損失，最好運(yùn)用塑料的燒杯和試管盛放雞血細(xì)胞液。

三、裂開細(xì)胞，獲得含DNA的濾液

1、若選用雞血和洋蔥作試驗(yàn)材料，則怎樣獲得含DNA的濾液？

在雞血細(xì)胞液中加入肯定量蒸播水并用玻棒攪拌，過濾后收集濾液；

切碎洋蔥，加入肯定量洗滌劑和食鹽，攪拌研磨，過濾后收集濾液。

2.為什么加入蒸儲(chǔ)水能使雞血細(xì)胞裂開？

答：蒸儲(chǔ)水對(duì)于雞血細(xì)胞來說是一種低滲液體，水分可以大量進(jìn)入血

細(xì)胞內(nèi)，使血細(xì)胞脹裂，再加上攪拌的機(jī)械作用，就加速了雞血細(xì)胞的裂

開（細(xì)胞膜和核膜的裂開），從而釋放出DNA。

3.在以上試驗(yàn)中，加入蒸儲(chǔ)水、洗滌劑和食鹽的作用分別是什么？過

濾時(shí)應(yīng)當(dāng)選用（濾紙、尼龍布）。血細(xì)胞在蒸福水中大量吸水而張裂；洗

滌劑瓦解細(xì)胞膜；食鹽溶解DNA物質(zhì)；選用尼龍布進(jìn)行過濾。

4.在處理植物組織時(shí)須要進(jìn)行研磨，其目的是什么？研磨不充分產(chǎn)生

什么結(jié)果？

裂開細(xì)胞壁,使核物質(zhì)簡單溶解在NaCl溶液中;研磨不充分會(huì)使DNA

的提取量削減，影響試驗(yàn)結(jié)果，導(dǎo)致看不到絲狀沉淀物、用二苯胺鑒定不

顯示藍(lán)色等。

詳細(xì)做法。10mL雞血+20mL蒸鏘水一同方向攪拌-3層尼龍布過

濾一濾液

三、去除濾液中的雜質(zhì)

1.為什么反復(fù)地溶解與析出DNA,能夠去除雜質(zhì)？

用高鹽濃度的溶液溶解DNA,能除去在高鹽中不能溶解的雜質(zhì)；用低

鹽濃度使DNA析出，能除去溶解在低鹽溶液中的雜質(zhì)。因此，通過反復(fù)

溶解與析出DNA,就能夠除去與DNA溶解度不同的多種雜質(zhì)。

最初獲得的DNA濾液含有蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等雜質(zhì),須要進(jìn)一步提純DNAo

方案一的原理是DNA在不同濃度NaCl溶液中溶解度不同；方案二的

原理是蛋白的分解蛋白質(zhì)，不分解DNA;方案三的原理是蛋白質(zhì)和DNA

的變性溫度不同。

方案二與方案三的原理有什么不同？

答：方案二是利用蛋白酶分解雜質(zhì)蛋白，從而使提取的DNA與蛋白質(zhì)

分開；方案三利用的是DNA和蛋白質(zhì),對(duì)高溫耐受性的不同，從而使蛋白

質(zhì)變性，與DNA分別。

四、析出與鑒定

1.在濾液中仍舊含有一些雜質(zhì)，怎樣除去這些雜質(zhì)呢？得到的DNA呈

何顏色？

濾液與等體積的冷卻酒精混合勻稱，靜置2?3分鐘，析出

的白色絲狀物就是DNA。DNA呈白色。

2.怎樣鑒定析出的白色絲狀物就是DNA呢？

詳細(xì)做法。試管2支，編號(hào)甲乙一各加等量5mLNaCl

溶液一甲中放入少量白色絲狀物，使之溶解-各加4mL二

苯胺，混合勻稱一沸水浴視察顏色改變

五、試驗(yàn)操作

制備雞血細(xì)胞液.......加檸檬酸鈉，靜置或離心

裂開細(xì)胞，釋放DNA…加蒸儲(chǔ)水，同一方向快速通方向攪拌

【一過濾，除去細(xì)胞壁、細(xì)胞膜等。

溶解核內(nèi)DNA加入NaCl至2mol/L,同一方向緩慢攪拌

DNA析出.............加蒸儲(chǔ)水至O.14mol/L,過濾，在溶解到2moi/L

溶液中

If除去細(xì)胞質(zhì)中的大部分物質(zhì)。

DNA初步純化........與等體積95%冷卻酒精混合，析出白色絲狀物

AB

1一除去核蛋白、RNA、多糖等。

DNA鑒定.............二苯胺，沸水浴，呈現(xiàn)藍(lán)色

留意事項(xiàng)：在雞血中加入檸檬酸鈉防止凝固；雞血靜置或離心以提高細(xì)胞

懸液濃度；運(yùn)用塑料燒杯；運(yùn)用尼龍布過濾；玻棒沿同一方向攪拌；玻棒

攪拌要緩慢（細(xì)胞裂開快速攪拌）；玻棒不要遇到燒杯壁；二苯胺試劑要

現(xiàn)用現(xiàn)配等。

課題二多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段

基礎(chǔ)學(xué)問

PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA的過程，與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制過程類似:

1.細(xì).胞內(nèi)DNA復(fù)制條件分析：

條件組分作用

模板DNA的兩條單鏈供應(yīng)復(fù)制的模板

原料四種脫氧核甘酸合成DNA子鏈的原料

解旋酶打開DNA雙螺旋

酶

DNA聚合酶催化合成DNA子鏈

能量ATP為解螺旋和合成子鏈供能

為DNA聚合酶供應(yīng)合成的3,

引物RNA

端起點(diǎn)

2.細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制過程的解析：

解旋：解旋酶、ATP,DNA兩條鏈打開，形成兩條DNA單鏈.

引物結(jié)合：在DNA單鏈3'端與DNA反向配對(duì)結(jié)合。

DNA聚合酶結(jié)合：DNA聚合酶與模板鏈結(jié)合，標(biāo)記著單鏈合成起先。

子鏈合成：DNA聚合酶從引物3'端起先，將配對(duì)的脫氧核甘酸連接

起來。

后續(xù)加工：D.NA聚合酶I將引物切去，并合成空缺處的DNA單鋅，

再由DNA連接酶將不連續(xù)的DNA子鏈連接起來(半不連續(xù)合成。先導(dǎo)鏈,

滯后鏈)

3.DNA分子復(fù)制的人工限制

試驗(yàn)操作步驟

照PCR反應(yīng)體系配方配制反應(yīng)液；

②將PCR反應(yīng)體系50pL用微量移液器轉(zhuǎn)移到微量離心管

(0.5mL)中；

③將微量離心管放到PCR儀中；

④設(shè)置PCR儀的工作參數(shù)。

⑤DNA在PCR儀中大量擴(kuò)增。。

4.試驗(yàn)留意事項(xiàng)

(1)避開外源DNA污染：所用儀器、緩沖液、蒸鏘水等運(yùn)用前高壓

滅菌。

(2)緩沖液和酶分裝成小份，一2。七低溫保存。

(3)每添加一種反應(yīng)成分，更換一個(gè)移液器的槍頭。

(4)混勻后離心處理，使反應(yīng)液集中在離心管底部。

總結(jié)、點(diǎn)評(píng)

多

聚DNA的復(fù)制須要酶、原料、能量、引物

—?PCR原理—>

酶DNA的變性和復(fù)性受溫度影響

鏈

式

反—?PCR過程—?變性—>復(fù)性延長

應(yīng)

擴(kuò)

增移入離心管

D

N

A

片

段

課題三血紅蛋白的提取和分別

一、試驗(yàn)原理

蛋白質(zhì)的物化理性質(zhì)：形態(tài)、大小、電荷性質(zhì)和多少、溶解度、吸附性質(zhì)、

親和力等千差萬別，由此提取和分別各種蛋白質(zhì)。

1.凝膠色譜法(安排色譜法)：

(1)原理：分子量大的分子通過多孔凝膠顆粒的間隙，路程短，流淌快;

分子量小的分子穿過多孔凝膠顆粒內(nèi)部，路程長，流淌慢。

(2)凝膠材料：多孔性，多糖類化合物，如葡聚糖、瓊脂糖。

(3)分別過程：

混合物上柱一洗脫一大分子流淌快、小分子流淌慢一收集大分子一收集小

分子

洗脫：從色譜柱上端不斷注入緩沖液，促使蛋白質(zhì)分子的差速流淌。

(4)作用：分別蛋白質(zhì)，測(cè)定生物大分子分子量，蛋白質(zhì)的脫鹽等。

2.緩沖溶液

(1)原理：由弱酸和相應(yīng)的強(qiáng)堿弱酸鹽組成(如H2CO3-NaHCO3,

NaH2PO4/Na2HPO4^),調(diào)整酸和鹽的用量，可配制不同pH的緩沖

液。

(2)緩沖液作用：抵制外界酸、堿對(duì)溶液pH的干擾而保持pH穩(wěn)定°

3.凝膠電泳法：

(1)原理：不同蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)、電量、形態(tài)和大小不同,在電場(chǎng)中

受到的作用力大小、方向、阻力不同，導(dǎo)致不同蛋白質(zhì)在電場(chǎng)中的運(yùn)動(dòng)方

向和運(yùn)動(dòng)速度不同。

(2)分別方法：瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳等。

(3)分別過程：在肯定pH下，使蛋白質(zhì)基團(tuán)帶上正電或負(fù)電；加入帶

負(fù)電荷多的SDS,形成“蛋白質(zhì)一SDS復(fù)合物”，使蛋白質(zhì)遷移速率僅

取決于分子大小。

二、試驗(yàn)步驟

1.樣品處理

紅細(xì)胞的洗滌

洗滌紅細(xì)胞的目的是去除雜蛋白,采集的血樣要與時(shí)采納低速短時(shí)間

離心分別紅細(xì)胞，然后用膠頭吸管吸出上層透亮的黃色血漿,將下層暗紅

色的紅細(xì)胞液體倒入燒杯,再加入五倍體積的生理鹽水，緩慢攪拌lOmin,

低速短時(shí)間離心，如此重復(fù)洗滌三次，直至上清液中沒/黃色,表明紅細(xì)

胞已洗滌干凈。

②血紅蛋白的釋放

在蒸儲(chǔ)水和甲苯作用下,紅細(xì)胞裂開釋放出血紅蛋白。

注：加入蒸儲(chǔ)水后紅細(xì)胞液體積與原血液體積要相同。加入甲苯的目

的是溶解細(xì)胞膜，有利于血紅蛋白的釋放和分別。

2.粗分別

①分別血紅蛋白溶液

將攪拌好的混合溶液離心后，試管中的溶液分為4層。第一層為無色

透亮的甲苯層,第2層為白色薄層固體，是脂溶性物質(zhì)的沉淀層,第3層

是紅色透亮液體，這是血紅蛋白的水溶液,第4層是其他雜質(zhì)的暗紅色沉

淀物。將試管中的液體用濾紙過濾，除去之溶性沉淀層，于分液漏斗中靜

置片刻后，分出下層的紅色透亮液體。

②透析

取1mL的血紅蛋白溶液裝入透析袋中,將透析袋放入盛有300mL的

物質(zhì)的量的濃度為20mmol/L的磷酸緩沖液中，透析12ho透析可以去

除樣品中分子量較小的雜質(zhì),或用于更換樣品的緩沖液。

3.純化

調(diào)整緩沖液面：打開色譜柱下端的流出口，使柱內(nèi)凝膠面上的緩沖液

緩慢下降到與凝

；膠面平齊，關(guān)閉出口。

加入蛋白質(zhì)樣品：用吸管將透析后的樣品沿管壁環(huán)繞移動(dòng)加到色譜柱

的頂端。加樣后，

I打開下端出口，使樣品滲入凝膠床內(nèi)，等樣品完全滲入凝

膠層后，

3關(guān)閉出口。

調(diào)整緩沖液面：加入20mmol/L的磷酸緩沖液到適當(dāng)高度

洗脫：連接緩沖液洗脫瓶，打開下端出口，進(jìn)行洗脫。

收集分裝蛋白質(zhì)：待紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時(shí)，用試管收集。

4.純度鑒定—SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（選做）

三.、留意事項(xiàng)

電泳技術(shù)

電泳技術(shù)就是在電場(chǎng)的作用下，利用待分別樣品中各種分子帶電性質(zhì)

以與分子本身大小、形態(tài)等性質(zhì)的差異，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度,

從而達(dá)到對(duì)樣品進(jìn)行分別、鑒定或提純的目的。

2.紅細(xì)胞的洗滌

假如分層不明顯，可能是洗滌次數(shù)少、未能除去血漿蛋白的緣由。此

外，離心速度過高和時(shí)間過長，會(huì)使白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞一同沉淀，也得不

到純凈的紅細(xì)胞，影響后續(xù)血紅蛋白的提取純度。

3.如何檢測(cè)凝膠色譜柱的裝填是否