靈芝gpd-Gl啟動子功能活性分析

序號：編碼：第九屆“挑戰(zhàn)杯”廣東大學(xué)生課外學(xué)術(shù)科技作品競賽作品申報書作品名稱：靈芝gpdGl啟動子功能活性分析學(xué)校全稱：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)申報者姓名（集體名稱）：劉志明李昭萍類別：√□自然科學(xué)類學(xué)術(shù)論文 □哲學(xué)社會科學(xué)類社會調(diào)查報告和學(xué)術(shù)論文□科技發(fā)明制作A類□科技發(fā)明制作B類報送方式：□省級報送作品□高校直送作品

說明1.申報者應(yīng)在認真閱讀此說明各項內(nèi)容后按要求詳細填寫。2．申報者在填寫申報作品情況時只需根據(jù)個人項目或集體項目填寫A1或A2表，根據(jù)作品類別（自然科學(xué)類學(xué)術(shù)論文、哲學(xué)社會科學(xué)類社會調(diào)查報告和學(xué)術(shù)論文、科技發(fā)明制作）分別填寫B(tài)1、B2或B3表。所有申報者可根據(jù)情況填寫C表。3.表內(nèi)項目填寫時一律用鋼筆或打印，字跡要端正、清楚，此申報書可復(fù)制。4.序號、編碼由第九屆“挑戰(zhàn)杯”廣東大學(xué)生課外學(xué)術(shù)科技作品競賽組委會填寫。5．學(xué)術(shù)論文、社會調(diào)查報告及所附的有關(guān)材料必須是中文（若是外文，請附中文本），請以4號楷體打印在A4紙上，附于申報書后，字數(shù)在8000字左右（文章版面尺寸14.5×22cm）。6．作品申報書須按要求由各校競賽組織協(xié)調(diào)機構(gòu)統(tǒng)一寄送。7.其他參賽事宜請向本校競賽組織協(xié)調(diào)機構(gòu)咨詢。A2申報者情況（集體項目）說明：1．必須由申報者本人按要求填寫；2．申報者代表必須是作者中學(xué)歷最高者，其余作者按學(xué)歷高低排列；3．本表中的學(xué)籍管理部門簽章視為申報者情況的確認。申報者代表情況姓名劉志明性別男出生年月1984年4月學(xué)校華南農(nóng)業(yè)大學(xué)系別、專業(yè)、年級2003級食品學(xué)院生物工程（1）班學(xué)歷本科學(xué)制4入學(xué)時間2003年9月作品名稱靈芝gpdGl啟動子功能活性分析畢業(yè)論文題目銀耳芽孢電擊轉(zhuǎn)化體系的建立通訊地址華南農(nóng)業(yè)大學(xué)華山宿舍24棟502房郵政編碼510642辦公電住地通訊地址廣州市白云區(qū)增槎路榕桂街5號南棟西梯902B房郵政編碼510165住宅電他作者情況姓名性別年齡學(xué)歷所在單位李昭萍女22本科2003級食品學(xué)院生物工程（一）班資格認定學(xué)校學(xué)籍管理部門意見以上作者是否為2006年7月1日前正式注冊在校的全日制非成人教育、非在職的高等學(xué)校中國籍?？粕?、本科生、碩士研究生或博士研究生?！獭跏恰醴瘢ú块T簽章）年月日院系負責(zé)人或?qū)熞庖姳咀髌肥欠駷檎n外學(xué)術(shù)科技或社會實踐活動成果√□是□否負責(zé)人簽名：年月日

B1．申報作品情況（自然科學(xué)類學(xué)術(shù)論文）說明：1．必須由申報者本人填寫；2．本部分中的科研管理部門簽章視為對申報者所填內(nèi)容的確認；3．作品分類請按作品的學(xué)術(shù)方向或所涉及的主要學(xué)科領(lǐng)域填寫；4．碩士研究生、博士研究生作品不在此列。作品全稱作品分類（D）A．機械與控制（包括機械、儀器儀表、自動化控制、工程、交通、建筑等）B．信息技術(shù)（包括計算機、電信、通訊、電子等）C．?dāng)?shù)理（包括數(shù)學(xué)、物理、地球與空間科學(xué)等）D．生命科學(xué)（包括生物、農(nóng)學(xué)、藥學(xué)、醫(yī)學(xué)、健康、衛(wèi)生、食品等）E．能源化工（包括能源、材料、石油、化學(xué)、化工、生態(tài)、環(huán)保等）作品撰寫的目的和基本思路目的：食用菌具有與高等真核生物相似的蛋白質(zhì)糖基化等翻譯后加工模式，新型的生物合成能力和有效的分泌機制，能使人們得到大量生物活性蛋白。因此食用菌表達系統(tǒng)是目前較細菌和酵母更具優(yōu)勢的外源蛋白表達系統(tǒng)。但是，食用菌外源基因表達系統(tǒng)尚不完善，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率低，以及外源基因表達水平不高，主要原因之一就是缺乏有效的啟動子。本作品的目的就是利用gfp報告基因，檢測靈芝gpdG1啟動子的功能活性，以期獲得功能活性強的啟動子，為完善食用菌外源基因表達系統(tǒng)提供必要的順式元件?；舅悸罚罕咀髌防脧撵`芝（Ganodermalucidum）菌絲體中克隆到的假定gpdGl啟動子（gpd啟動子是3磷酸甘油醛脫氫酶基因的啟動子）與gfp報告基因（綠色熒光蛋白基因）串連，構(gòu)建成GFP蛋白表達載體pLBG。用PEG法介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法將輔助質(zhì)粒pCc1001（含trp1基因）和質(zhì)粒pLBG（含靈芝gpdGl啟動子和gfp基因），共轉(zhuǎn)化至色氨酸營養(yǎng)缺陷型的灰蓋鬼傘（Coprinuscinereu）菌粉孢子的原生質(zhì)體中。通過選擇培養(yǎng)基篩選色氨酸營養(yǎng)恢復(fù)型（trp+）的假定轉(zhuǎn)化子。然后利用PCR技術(shù)，Southern雜交技術(shù)和綠色熒光分析技術(shù)鑒定假定轉(zhuǎn)化子。實驗結(jié)果顯示：在熒光顯微鏡下，部分Southern雜交陽性轉(zhuǎn)化子能觀察到綠色熒光，說明假定靈芝gpdG1啟動子能在灰蓋鬼傘中啟動綠色熒光蛋白基因的表達，即證明了靈芝gpdG1啟動子在灰蓋鬼傘中具有啟動外源基因轉(zhuǎn)錄的活性，可為建立食用菌外源基因表達系統(tǒng)提供必要的基因表達元件。作品的科學(xué)性、先進性及獨特之處科學(xué)性：本研究的科學(xué)性體現(xiàn)在以下3方面：(1)選擇灰蓋鬼傘為宿主研究顯示同源啟動子有利于受體細胞調(diào)控因子的識別，減少甲基化，促進外源基因整合到染色體上，從而提高轉(zhuǎn)化效率和外源基因的表達效率。靈芝與灰蓋鬼傘同為大型真菌，在分類學(xué)上都屬于擔(dān)子菌綱，有一定的親緣性，因此其啟動子識別因子相同或相似，靈芝gpd啟動子轉(zhuǎn)化進灰蓋鬼傘后，能被識別并發(fā)揮啟動子活性。本試驗轉(zhuǎn)化的受體為灰蓋鬼傘粉孢子，其為單核體。在細胞的有絲分裂過程中，單核體能夠把一套完整的DNA復(fù)制傳給子代細胞，能增加繼代的穩(wěn)定性。此外，灰蓋鬼傘是大型真菌研究的模式材料之一，其基因組序列已經(jīng)公布，研究背景清楚，且生長速度快，易于在實驗室培養(yǎng)。因此選擇灰蓋鬼傘為宿主菌具有科學(xué)性和可靠性。(2)gpd啟動子真核生物基因由增強子、位于基因上游的啟動子、結(jié)構(gòu)基因（由許多非編碼序列，內(nèi)含子間隔開）、終止子組成。這些元件控制了基因的表達和調(diào)控。其中，啟動子是指能被RNA聚合酶識別，與之結(jié)合并開始轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列，是基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵性順式元件。gpd啟動子是食用菌遺傳轉(zhuǎn)化中研究和應(yīng)用最多的啟動子之一，gpd基因編碼3磷酸甘油醛脫氫酶，為糖酵解途徑中的一個關(guān)鍵酶。在釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）中，GPD蛋白的含量達到細胞中可溶性蛋白總量的5%，從而推斷gpd的啟動子為強啟動子。HiranoT等（1999）用香菇gpd啟動子構(gòu)建了載體pLGhpt轉(zhuǎn)化香菇，得到了高效表達潮霉素抗性基因的轉(zhuǎn)化子。此后，由香菇gpd啟動子構(gòu)建的外源表達載體在平菇、靈芝里也得到了高效穩(wěn)定的表達。在國外的報道中，gpd啟動子也從雙孢蘑菇、裂褶菌、金針菇、云芝等其他食用菌中分離得到，并在各自同源轉(zhuǎn)化中都表現(xiàn)出很強的功能活性。因此我們推斷靈芝gpd啟動子是高效的啟動子，其功能活性值得探究。(3)綠色熒光蛋白報告基因綠色熒光蛋白來源于維多利亞生物發(fā)光水母，具有熒光性質(zhì)穩(wěn)定、直觀、操作方便，不需添加外源底物就可以在活細胞中直接檢測且檢測靈敏度高，安全無害等的優(yōu)點。以gfp基因作為啟動子活性檢測的報告基因，只要檢測熒光的存在，就可以證明啟動子的啟動活性，操作方便，結(jié)果可靠。先進性及獨特之處：(1)靈芝gpd啟動子功能活性鑒定的重要性目前，雖然食用菌生產(chǎn)已成為我國農(nóng)業(yè)中種植業(yè)、養(yǎng)殖業(yè)、菌物業(yè)三大產(chǎn)業(yè)之一，但是對食用菌生物技術(shù)研究相對很少，大多只是集中在常規(guī)的菌種選育，引種馴化，引進開發(fā)，技術(shù)推廣上。本研究立足于食用菌基礎(chǔ)研究，研究結(jié)果將有益于我國食用菌生物技術(shù)的發(fā)展。食用菌基因工程的研究滯后的主要原因是缺乏有效的啟動子和穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化體系，從而導(dǎo)致了食用菌轉(zhuǎn)化效率低，外源基因表達水平低。目前基因工程技術(shù)在食用菌中的應(yīng)用主要集中在生物反應(yīng)器研究，即通過轉(zhuǎn)入特定基因，表達有價值的外源蛋白，使其具有各種抗性能力或提高生理代謝能力。這些方面的應(yīng)用都涉及外源基因的表達問題，要使外源基因在食用菌內(nèi)得到高水平的表達，高效的啟動子是必不可少的。本作品證明了靈芝gpd啟動子確實具有很強的啟動活性，可以應(yīng)用于食用菌外源基因表達系統(tǒng)的構(gòu)建，從而解決食用菌基因工程中的瓶頸難題。迄今，未見有對靈芝gpd啟動子在灰蓋鬼傘中功能活性的研究報道，因此本研究具有先導(dǎo)意義。(2)啟動子序列分析及轉(zhuǎn)化分析的比較目前啟動子功能預(yù)測主要是以轉(zhuǎn)錄因子特異結(jié)合的啟動子元件序列特征為依據(jù)。對于典型的基因結(jié)構(gòu)和啟動子特征，某些軟件一般能預(yù)測出來，但是就目前的數(shù)據(jù)庫而言，仍然有相當(dāng)一部分預(yù)測不出來或預(yù)測出錯，尤其采用人類基因組信息來預(yù)測植物、真菌等遠緣物種的基因結(jié)構(gòu)時更是如此，原因在于目前植物、真菌等自身的生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫遠沒有人類的全面和完善。而且這些特征結(jié)構(gòu)并不為啟動子所獨有，它們散布在整個基因組中。目前，只是在序列的生物學(xué)功能如mRNA的轉(zhuǎn)錄起始和轉(zhuǎn)錄機制都清楚的情況下，基于此方法才能獲得滿意的識別率（熊清，2004）。而轉(zhuǎn)化分析仍然是啟動子分析最為主要和準確的途徑。在啟動子的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化分析過程中，其最大的難點是外源基因的轉(zhuǎn)化和報告基因的檢測。不同的受體細胞，其轉(zhuǎn)化的方法和報告基因的選擇與檢測都有不同的選擇。而本實驗合理選擇大型真菌灰蓋鬼傘為受體，利用綠色熒光蛋白基因(gfp基因)為報告基因，采用PEG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法，把靈芝gpd－G1啟動子與綠色熒光蛋白基因構(gòu)建的表達載體導(dǎo)入受體中，成功鑒定靈芝gpd－G1啟動子的功能活性。作品的實際應(yīng)用價值和現(xiàn)實意義用于建立食用菌外源基因表達系統(tǒng)，即食用菌生物反應(yīng)器，由于食用菌具有很強的外泌蛋白能，非常適合生產(chǎn)各種有價值的外源基因編碼的蛋白產(chǎn)品，由于食用菌的食用安全性，其產(chǎn)品將更為安全，更易被消費者接受。例如：CyanovirinN是新發(fā)現(xiàn)的一種能夠有效抑制HIV感染的天然蛋白，ZhangC等（2004）利用雙孢蘑菇成功的表達了CyanovirinN，從而使得能大量獲得這種蛋白用于醫(yī)學(xué)治療。用于構(gòu)建食用菌遺傳轉(zhuǎn)化載體，應(yīng)用于食用菌的基因工程育種，大大縮短傳統(tǒng)菌種選育的周期，同時為提高食用菌品質(zhì)和培育新菌種開辟新的途徑，有益于我國食用菌產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。例如：草菇不耐低溫，不能低溫保藏，從而限制了草菇的銷售和生產(chǎn)。郭麗瓊等（2003）將來源于昆蟲的高活性抗冷凍蛋白基因（THP）轉(zhuǎn)化草菇，獲得耐寒凍的轉(zhuǎn)基因草菇，初步解決了草菇不能低溫保藏的問題。又例如：將編碼纖維素或木質(zhì)素降解酶基因?qū)耸秤镁w內(nèi)，以提高食用菌菌絲體對栽培基質(zhì)的利用率或開拓新的栽培基質(zhì)，最終提高食用菌產(chǎn)量。這些都是是常規(guī)育種很難實現(xiàn)的。用于解決當(dāng)前食用菌遺傳轉(zhuǎn)化研究中整合表達率不高，轉(zhuǎn)化子不穩(wěn)定等問題。PengM等(1992)使用由構(gòu)巢曲霉gpd啟動子驅(qū)動hph基因的質(zhì)粒pAN7–1在轉(zhuǎn)化平菇時，雖然得到了轉(zhuǎn)化子，但是一些轉(zhuǎn)化子在沒有潮霉素選擇壓力的條件下培養(yǎng)3到6周后，出現(xiàn)了抗性丟失的現(xiàn)象,究其原因是hph基因并沒有整合到染色體上。IrieT等（2001）同樣使用質(zhì)粒pAN7–1及其衍生載體轉(zhuǎn)化平菇，同樣沒有得到潮霉素抗性的轉(zhuǎn)化子，而使用擔(dān)子菌香菇的gpd啟動子則得了穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化子，可能是平菇和香菇都屬于擔(dān)子菌，他們的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制相近。然而啟動活性強的啟動子是上述食用菌基因工程項目的廣泛開展的關(guān)鍵之一。相信我們的實驗結(jié)果能為食用菌啟動子研究提供一定依據(jù)。

學(xué)術(shù)論文文摘本作品利用從靈芝（Ganodermalucidum）菌絲體中克隆到的假定gpdGl啟動子與gfp報告基因串連，構(gòu)建GFP蛋白表達載體pLBG。用PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法將表達載體pLBG和輔助質(zhì)粒pCc1001（含trp1基因），共轉(zhuǎn)化至色氨酸營養(yǎng)缺陷型的灰蓋鬼傘菌粉孢子的原生質(zhì)體中。通過選擇培養(yǎng)基篩選色氨酸營養(yǎng)恢復(fù)型（trp+）的假定轉(zhuǎn)化子。然后利用PCR技術(shù)，Southern雜交技術(shù)和綠色熒光分析鑒定假定轉(zhuǎn)化子。實驗結(jié)果顯示：在熒光顯微鏡下，部分Southern雜交陽性轉(zhuǎn)化子能觀察到綠色熒光，證明靈芝gpdG1啟動子在灰蓋鬼傘中具有啟動轉(zhuǎn)錄活性。作品在何時、何地、何種機構(gòu)舉行的會議上或報刊上發(fā)表及所獲獎勵2007年11月廣州市微生物學(xué)年會所做“銀耳外源基因表達系統(tǒng)的建立”報告中有提及本結(jié)果，但該結(jié)果目前尚未在學(xué)術(shù)期刊上發(fā)表。鑒定結(jié)果請?zhí)峁τ诶斫?、審查、評價所申報作品具有參考價值的現(xiàn)有技術(shù)及技術(shù)文獻的檢索目錄[1]BitterGA,EganKM.ExpressionofheterousgenesinSaccharomycescerevisiaefromvectorsutilizingtheglyceraldehyde3phosphatedehydrogenasegenepromoter.Gene,1984.32(3):26374.[2]HiranoT,SatoT,OkawaK,etal.Isolationandcharacterizationoftheglyceroldehydes3phosphatedehydrogenasegeneofLentinusedodes.BiosciencebiotechnologyandBiochemistry,1999,63(7):12231227.[3]SunL,CaiH,XuW,HuY,GaoY,LinZ.EfficienttransformationofthemedicinalmushroomGanodermalucidum.PlantMolecularBiologyReporter,2001.19:383383.I[4]IrieT,HondaY,HiranoT,etal.StabletransformationofpleurotusoftreatustohygromycinBresistanceusingLentinusedodesGPDexpressionsignals.ApplMicrobiolBiotechnol,2001.56:707~709.[[5]SunL,CaiH,XuW,etal.EfficienttransformationofthemedicinalmushroomGanodermalucidum.PlantMolecularBiologyReporter,2001.19:383~383.[6]KuoCT,ChouSY,HuangCT.Cloningofglyceraldehyde3phosphatedehydrogenasegeneanduseofthegpdpromoterfortransformationinFlammulinavelutipes.Appl.Miotechnol.,2004.65:593~599.[7]NittaY,MiyazakiY,NakamuraM,etal.Molecularcloningofthepromoterregionoftheglyeraldehyde3phosphatedehydrogenasegenethatcontributestotheconstructionofanewtransformationsysteminCoriolusversicolor.Mycoscience,2004.45:131~136.[8]BurnsC,GregoryKE,KirbyM,CheungMK,etal.EfficientGFPexpressioninthemushroomsAgaricusbisporusandCoprinuscinereusrequiresintrons.FungalGeneticsandBiology,2005,42：191～199.[9]柳永，郭麗瓊，林俊芳.靈芝啟動子同源序列的克隆及其分析.食用菌學(xué)報，2006，13(1)：24～28申報材料清單（申報論文一篇，相關(guān)資料名稱及數(shù)量）申報論文一篇《靈芝gpd－G1啟動子功能活性分析》科研管理部門簽章年月日

C.當(dāng)前國內(nèi)外同類課題研究水平概述說明：1.申報者可根據(jù)作品類別和情況填寫；2.填寫此欄有助于評審。gpd啟動子研究概況目前，在食用菌中分離得到的啟動子主要有ras啟動子、gpd啟動子、pri啟動子、gla1啟動子、cel1啟動子、cel3啟動子、cel4啟動子、spr1啟動子、trp1啟動子、trp2啟動子、gdhA啟動子、hypa啟動子、lcc1啟動子、βtub啟動子。其中在食用菌遺傳轉(zhuǎn)化的研究與應(yīng)用的領(lǐng)域里，對ras啟動子和gpd啟動子研究最為集中。國外：BitterGA等人（1984）研究發(fā)現(xiàn)釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）中的GPD蛋白的含量達到細胞中可溶性蛋白總量的5%，并通過驗證表明其gpd啟動子其具有很強的功能活性。TatsuyaHirano等人（1999）實驗證明釀酒酵母gpd啟動子具有很強的調(diào)控異源基因表達的作用。HiranoT等（1999）首次從香菇中分離得到gpd基因，并對其啟動子進行了分析，并預(yù)測其具有較高的啟動子功能活性。次年他們用香菇gpd啟動子構(gòu)建了載體pLGhpt轉(zhuǎn)化香菇，得到了高效表達潮霉素抗性基因的轉(zhuǎn)化子。由香菇gpd啟動子構(gòu)建的外源表達載體在平菇(IrieTetal.,2001)、靈芝（SunLetal.,2001）里也得到了高效穩(wěn)定的表達。此外，gpd啟動子也從雙孢蘑菇(VandeRheeMDetal.,1996)、裂褶菌（SchurenFHJetal.,1994）、金針菇（KuoCTetal.,2004）、云芝（NittaYetal.,2004）等其他食用菌中分離得到，并在各自同源轉(zhuǎn)化中都表現(xiàn)出很強的功能活性。國內(nèi)：揚帆等（2004）從草菇中克隆到一個gpd啟動子片段，gpd－vv。但是只對其啟動子活性進行預(yù)測，沒有進行實驗驗證。王海燕等（2005）從灰樹花中克隆得到了一個Lgpd114的gpd啟動子片段。通過與gus基因串連構(gòu)成表達載體轉(zhuǎn)化草菇。檢測結(jié)果表明該片斷有很強的啟動活性。于曉玲（2005）也從香菇中克隆得到613bp和1143bp的香菇gpd啟動子片段，并將其與gus報告基因構(gòu)建的表達載體轉(zhuǎn)化草菇，結(jié)果表明這兩個片段都具有啟動子功能活性，其中啟動子長片段具有更強的啟動子功能活性。柳永等（2006）首次從赤芝中克隆gpd啟動子片段，實驗共得到12個片斷。序列分析分析表明，有四個片段（LY17.1、LY19.3、LY26、LY31）預(yù)測有啟動子活性。其中LY17.1和LY26有完全的啟動子特征，LY31與香菇gpd啟動子具有98%的相似性。但是沒有對啟動子片段啟動活性進行實驗鑒定。綜上所述，目前，未見有對靈芝gpd啟動子功能活性的研究報道，因此本研究具有先導(dǎo)意義和創(chuàng)新性。（2）gfp基因在食用菌遺傳轉(zhuǎn)化上的應(yīng)用綠色熒光蛋白基因在食用菌中的應(yīng)用研究比較少，能夠成功表達綠色熒光蛋白基因的食用菌目前只有裂褶菌（LugonesLGetal.,1999）、黃孢原毛平革菌(MaBetal.,2001)、雙孢蘑菇和灰蓋鬼傘（BurnsCetal.,2004）。D.推薦者情況及對作品的說明說明：1．由推薦者本人填寫；2．推薦者必須具有高級專業(yè)技術(shù)職稱，并是與申報作品相同或相關(guān)領(lǐng)域的專家學(xué)者或?qū)I(yè)技術(shù)人員（教研組集體推薦亦可）；3．推薦者填寫此部分，即視為同意推薦；4．推薦者所在單位簽章僅被視為對推薦者身份的確認。推薦者情況姓名郭麗瓊性別女年齡44職稱教授工作單位華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院生物工程系通訊地址廣東省廣州市天河區(qū)五山郵政編碼510640單位電話02085285382住宅電話02038902762推薦者所在單位簽章（簽章）年月日請對申報者申報情況的真實性作出闡述劉志明和李昭萍兩位同學(xué)自2004年暑假起就開始本實驗的研究工作，這兩位同學(xué)學(xué)習(xí)認真，責(zé)任心強，試驗結(jié)果真實可靠。請對作品的意義、技術(shù)水平、適用范圍及推廣前景作出您的評價食用菌安全可食、易培養(yǎng)且具有很好的蛋白質(zhì)分泌能力，以它作為外源基因的表達系統(tǒng)比大腸桿菌、酵母和動物細胞等表達系統(tǒng)具有更好的優(yōu)勢。但是目前缺乏高效表達外源基因的啟動子，本研究證明了靈芝gpdGl啟動子具有高效驅(qū)動外源基因表達的活性，這一結(jié)果將為建立高效表達高價值的外源基因的食用菌表達系統(tǒng)提供重要的表達元件。其它說明推薦者情況姓名李斌性別女年齡46職稱教授工作單位華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院通訊地址廣東省廣州市華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院郵編510642單位電話02085280266住宅電話推薦者所在單位簽章簽章日期年月日請對申報者申報情況的真實性作出闡述劉志明、李昭萍同學(xué)是我院生物工程專業(yè)2003級1班本科生,2004年7月起,師從林俊芳和郭麗瓊教授開展“靈芝gpd－G1啟動子功能活性分析”研究。該研究實驗設(shè)計合理，試驗結(jié)果真實可靠，表明研究者已具備該領(lǐng)域良好的理論基礎(chǔ)和實驗操作技能。請對作品的意義、技術(shù)水平、適用范圍及推廣前景作出您的評價食用菌因其食用安全性，易培養(yǎng)，蛋白分泌能力強等特點，而成為生物反應(yīng)器研究家族中一個特殊的群體。由于缺乏研究背景，食用菌遺傳轉(zhuǎn)化研究進展緩慢。本作品采用的是牛津大學(xué)Lorna教授等提供的國際公認模式系統(tǒng)，作品的完成為食用菌遺傳轉(zhuǎn)化研究增添了一個新的高效啟動子元件。這對食用菌生物反應(yīng)器研究具有重要的借鑒意義。其它說明學(xué)校組織協(xié)調(diào)機構(gòu)確認并蓋章（團委代章）年月日校主管領(lǐng)導(dǎo)或校主管部門確認蓋章年月日

E．大賽組織委員會秘書處資格和形式審查意見組委會秘書處資格審查意見審查人（簽名）年月日組委會秘書處形式審查意見審查人（簽名）年月日組委會秘書處審查結(jié)果□合格□不合格負責(zé)人（簽名）年月日

F．參賽作品打印處靈芝gpdG1啟動子功能活性分析劉志明李昭萍指導(dǎo)老師:林俊芳(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣州，510642)摘要：本作品利用從靈芝（Ganodermalucidum）菌絲體中克隆到的假定gpdGl啟動子與gfp報告基因串連，構(gòu)建GFP蛋白表達載體pLBG。用PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法將表達載體pLBG和輔助質(zhì)粒pCc1001（含trp1基因），共轉(zhuǎn)化至色氨酸營養(yǎng)缺陷型的灰蓋鬼傘菌粉孢子的原生質(zhì)體中。通過選擇培養(yǎng)基篩選色氨酸營養(yǎng)恢復(fù)型（trp+）的假定轉(zhuǎn)化子。然后利用PCR技術(shù)，Southern雜交技術(shù)和綠色熒光分析鑒定假定轉(zhuǎn)化子。實驗結(jié)果顯示：在熒光顯微鏡下，部分Southern雜交陽性轉(zhuǎn)化子能觀察到綠色熒光，證明靈芝gpdG1啟動子在灰蓋鬼傘中具有啟動轉(zhuǎn)錄活性。關(guān)鍵詞：靈芝gpd啟動子灰蓋鬼傘gfp基因前言目前，我國是全球食用菌生產(chǎn)第一大國，食用菌年產(chǎn)量占世界總產(chǎn)量的65%以上，其栽培種類也位居世界首位。但是我國對食用菌的生物技術(shù)研究相對較少。食用菌經(jīng)過基因工程技術(shù)改良后，可在更寬廣的領(lǐng)域得到應(yīng)用：第一，建立食用菌表達系統(tǒng)。食用菌表達系統(tǒng)比酵母表達系統(tǒng)更適用于表達真核蛋白，因為食用菌是比酵母高級的真核生物，對真核蛋白的修飾模式更接近于高等真核生物，更能保持蛋白質(zhì)活性。再者，食用菌有良好的蛋白分泌能力，有利于目的蛋白的分離和純化

[1]。最后，食用菌不僅可以利用發(fā)酵罐進行大規(guī)模的深層發(fā)酵培養(yǎng)，也可以利用農(nóng)業(yè)下腳料，如稻草、棉籽殼、秸稈等作為培養(yǎng)料進行固體發(fā)酵培養(yǎng)，適合工業(yè)化生產(chǎn)。第二，生物質(zhì)能的開發(fā)利用。纖維素是自然界含量最豐富的碳水化合物，但由于自身致密的結(jié)構(gòu)而不易降解而難以被利用。食用菌轉(zhuǎn)化特定功能基因構(gòu)建成高效的纖維素分解菌，使纖維素分解成小分子糖類，可作為酵母發(fā)酵的原料，制取燃料酒精，是生物質(zhì)能利用的一個趨勢。第三，環(huán)境保護。在造紙工業(yè)中，常用熱堿來處理木質(zhì)素，該工藝不僅耗能巨大，而且產(chǎn)生的廢液還會造成嚴重的環(huán)境污染

。通過構(gòu)建能高效分解木質(zhì)素的食用菌基因工程菌株降解木質(zhì)素，不僅可以緩解環(huán)境污染，還可以變廢為寶，實現(xiàn)資源再利用。OgawaK等[2]就將平菇中分離得到的錳過氧化物酶（II）導(dǎo)入灰蓋鬼傘中，得到了木質(zhì)素類化合物降解活性很高的轉(zhuǎn)化子。然而缺少食用菌外源基因表達調(diào)控的元件，尤其是優(yōu)良驅(qū)動活性的啟動子，成了食用菌基因工程研究的瓶頸問題，從而大大制約食用菌在更廣大領(lǐng)域里的有益應(yīng)用。目前gpd啟動子是食用菌遺傳轉(zhuǎn)化中研究和應(yīng)用最多的啟動子之一，gpd基因編碼3磷酸甘油醛脫氫酶，為糖酵解途徑中的一個關(guān)鍵酶。其基因在細胞內(nèi)具有很高的表達水平（Krebsetal.,1953；HollandMJetal.,1978），從而推斷gpd啟動子可能是一個非常高效的啟動子。HiranoT等（1999）用香菇gpd啟動子構(gòu)建了載體pLGhpt轉(zhuǎn)化香菇，得到了高效表達潮霉素抗性基因的轉(zhuǎn)化子。此后，由香菇gpd啟動子構(gòu)建的外源表達載體在平菇[3]、靈芝[4]里也得到了高效穩(wěn)定的表達。其次，在國外的報道中，gpd啟動子也從雙孢蘑菇[5]、裂褶菌[6]、金針菇[7]、云芝[8]等其他食用菌中分離得到，并在各自同源轉(zhuǎn)化中都表現(xiàn)出很強的功能活性。本研究立足于食用菌基礎(chǔ)研究，旨在利用gfp基因（綠色熒光蛋白基因）為報告基因，利用模式大型真菌灰蓋鬼傘營養(yǎng)缺陷型菌株檢測從靈芝（Ganodermalucidum）中克隆的gpdG1啟動子功能活性，以獲得能夠高效啟動外源基因表達的食用菌同源啟動子，為建立高效的食用菌外源基因表達系統(tǒng)及定向改良食用菌菌株提供基因表達元件，同時為食用菌基因表達調(diào)控研究提供實驗材料基礎(chǔ)，研究成果將有益于我國食用菌生物技術(shù)的發(fā)展。1材料與方法1.1實驗材料1.1.1質(zhì)粒與菌株（1）功能活性檢測表達質(zhì)粒pLBG，如圖1，由本實驗室提供。（2）輔助質(zhì)粒pCc1001（含有trp1基因）、灰蓋鬼傘(Coprinuscinereus)色氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株LT2由英國牛津大學(xué)Lorna教授饋贈，本實驗室保存。圖1靈芝gpdG1啟動子功能活性檢測表達質(zhì)粒pLBGFig.1TheexpressionvectorpLBGforpromoterfunctionalanalysis1.1.2培養(yǎng)基（1）灰蓋鬼傘的再生培養(yǎng)基（1000mL）：5g葡萄糖，172g蔗糖（0.5moL），0.1g腺嘌呤硫酸鹽，25mLStockAbuffer，1mLStockBbuffer，10mLStockCbuffer，蒸餾水溶解定容至1000mL，加入14g瓊脂粉，121℃高壓滅菌15min（2）灰蓋鬼傘的完全培養(yǎng)基（1000mL）：10g葡萄糖，2g天冬酰胺，0.1g腺嘌呤硫酸鹽，0.75g酵母提取液，1.13g麥芽提取物，0.75g酪蛋白胨，25mLStockAbuffer，1mLStockBbuffer，10mLStockCbuffer蒸餾水溶解定容至1000mL（固體培養(yǎng)基另加入14g瓊脂），121℃高壓滅菌15min。使用時待培養(yǎng)基溫度降至60℃后加入色氨酸儲藏液(10mL/L)（3）灰蓋鬼傘的基本培養(yǎng)基（1000mL）：10g葡萄糖，2g天冬酰胺，0.1g腺嘌呤硫酸鹽，25mLStockAbuffer，1mLStockBbuffer，10mLStockCbuffer，蒸餾水溶解定容至1000mL（固體培養(yǎng)基另加入14g瓊脂），121℃高壓滅菌15min1.1.3試劑HindIII限制性內(nèi)切酶，購自賽百勝公司。TaqDNA聚合酶，dNTPs，購自上海申能博彩生物技術(shù)。去壁酶，購自廣東省微生物研究所。DNA膠回收試劑盒，購自UGene公司。引物，接頭，上海生工合成。TrisHCl、EDTA，購自MB公司。Southern雜交地高辛試劑盒，購自Roche公司。其他國產(chǎn)分析純化學(xué)試劑，購自廣州威佳生物技術(shù)公司。1.2實驗方法1.2.1轉(zhuǎn)化灰蓋鬼傘原生質(zhì)體1）制備灰蓋鬼傘原生質(zhì)體[9]（1）將色氨酸營養(yǎng)缺陷型灰蓋鬼傘菌種接種于完全培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)7（2）在無菌條件下，向每皿培養(yǎng)物加入5mL無菌水，用無菌的接種刀刮取表面的粉孢子。用移液器吸取孢子懸液。無菌過濾孢子懸液，除去菌絲和培養(yǎng)基。（3）濾液以7000rpm離心6～7min。去掉上清，然后加入10mLMMbuffer，重懸孢子。（4）重懸液以7000rpm離心5min，去掉上清液，然后加入2mL去壁酶液（1.5%，w/v)。（5）30℃水浴1～1.5（6）顯微鏡下觀察，當(dāng)70%的孢子被酶解時，停止酶解，離心收集原生質(zhì)體（離心的速度<2500rpm，以防止原生質(zhì)體破裂）。（7）先用5mLMMbuffer洗滌原生質(zhì)體兩次，再用5mLMMCbuffer洗滌一次，最后收集原生質(zhì)體。（8）向收集到的原生質(zhì)體中加入400μLMMCbuffer和100μLPEGbuffer混勻，每管50μL分裝于1.5mL離心管中。2）提取pLBG功能活性檢測質(zhì)粒。（1）活化與培養(yǎng)將實驗室保存的含有pLBG功能活性檢測質(zhì)粒的大腸桿菌菌種接種于5mLLB(80μg/mLAmp)抗性培養(yǎng)基中，活化培養(yǎng)。然后在LB(100μg/mLAmp)抗性板上劃線，分離單菌落，37℃培養(yǎng)18h。挑取一單菌落接種于100mL液體LB(80μg/mLAmp)（2）提取質(zhì)粒按文獻[10]操作。3）共轉(zhuǎn)化灰蓋鬼傘原生質(zhì)體用PEG法將pLBG功能活性檢測質(zhì)粒和輔助質(zhì)粒pCc1001共轉(zhuǎn)化色氨酸營養(yǎng)缺陷型灰蓋鬼傘菌株粉孢子原生質(zhì)體，并設(shè)置陰性對照。（1）向從1.2.1制備得到的每管50μL原生質(zhì)體中加入1μL（約1μg）pLBG功能活性檢測質(zhì)粒、1μL(約1μg)pCc1001DNA和12.5（2）再加入0.5mLPEGbuffer，室溫放置5min。（3）加入1.0mLSTCbuffer，輕輕混勻。（4）將該混合物涂布于再生培養(yǎng)基上，37（5）3～5天后長出轉(zhuǎn)化子。1.2.2PCR鑒定假定轉(zhuǎn)化子1）小量提取假定轉(zhuǎn)化子基因組（1）把保存的假定轉(zhuǎn)化子菌種接種于固體基本培養(yǎng)基平板上，37（2）向平板內(nèi)加入5mL去離子水，用灼燒過的接種刀延平板表面刮下菌絲，用移液器吸取菌液轉(zhuǎn)入2mL離心管。（3）以12000rpm離心5min，去掉上清液，收集菌絲。（4）加入600μLFDEB溶液，振蕩均勻。68℃（5）以12000rpm離心5min，把上清夜轉(zhuǎn)移到另一個2mL離心管中。加入1/3體積的3moL/L的KAc溶液（pH5.2），充分搖勻，冰浴30min。（6）以12000rpm離心5min，取上清夜，加入等體積氯仿，搖勻。（7）以12000rpm離心5min，取上清夜，加入2倍體積無水乙醇，搖勻，冰浴30min。（8）以12000rpm離心5min，去掉上清夜，用70％乙醇洗滌沉淀2次。（9）在超凈工作臺上吹干。（10）加入30μLTE溶液溶解。2）PCR鑒定假定轉(zhuǎn)化子從所得到的轉(zhuǎn)化子中小量提取基因組DNA，利用克隆靈芝gpd啟動子基因的上游引物和gfp基因的下游引物進行PCR檢測，擴增出900bp的檢測條帶，并設(shè)置陽性對照和陰性對照。反應(yīng)體系如下：10×PCRBuffer（含Mg2+）3μLddH2O14.76μLPrimergpdF1（2.5μmol/L）4.2μLPrimergfpR1（2.5μmol/L）4.2μLdNTPs(10mmol/L)0.6μLTemplate（GenomicDNA）3μLTaqDNApolymerase（5U/μL）0.24μLTotalvolume30μL加樣后輕輕混勻，放在PCR儀進行擴增。反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，52℃退火30s，72℃延伸90s，34個循環(huán)后72℃繼續(xù)延伸10min，1.2.3Southernblot分析假定轉(zhuǎn)化子(1)以pLBG質(zhì)粒為模板，通過gfp基因的上下游引物制備探針。具體方法按Dig試劑盒說明書進行。(2)分別提取灰蓋鬼傘假定轉(zhuǎn)化子和LT2陰性對照的基因組DNA15μg用Hind=3\*ROMANIII限制性內(nèi)切酶進行酶切，37℃溫浴過夜，10μg，pLBG質(zhì)粒DNA用SacI酶切作為陽性對照。酶切后的DNA在0.8%的瓊脂糖凝膠上電泳分離。(3)DNA印跡轉(zhuǎn)膜、洗滌、預(yù)雜交和雜交、洗膜、顯影以及探針標記等參照文獻[11]及Dig試劑盒說明書進行。1.2.4熒光檢測假定轉(zhuǎn)化子將Southern雜交鑒定陽性的轉(zhuǎn)化子和LT2陰性菌株重新接種于基本培養(yǎng)基上，用滅菌的載玻片斜插在距離接種塊0.5cm的培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)，待菌絲蔓延到蓋玻片上，取出附有菌絲的載2結(jié)果與分析2.1共轉(zhuǎn)化灰蓋鬼傘原生質(zhì)體用PEG法將pLBG功能活性檢測質(zhì)粒和輔助質(zhì)粒pCc1001共轉(zhuǎn)化色氨酸營養(yǎng)缺陷型灰蓋鬼傘菌株粉孢子原生質(zhì)體，實驗結(jié)果如圖2所示，轉(zhuǎn)入了色氨酸t(yī)rp1基因的轉(zhuǎn)化子在不含有色氨酸的再生培養(yǎng)基上能長出白色單菌落，而非轉(zhuǎn)化色氨酸缺陷型原生質(zhì)體在該培養(yǎng)基上不能生長。a b圖2灰蓋鬼傘原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化后在選擇再生培養(yǎng)基上的再生菌落（圖未全附）a：共轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pLBG和pCc1001菌落；b：陰性對照（無轉(zhuǎn)化質(zhì)粒）Fig.2TheregenerationcoloniesgrowingontheselectivemediumfromtheprotoplastofC.cinereustransfored.a：TransforedwithplasmidpLBGandpCc1001;b：Nontransfored2.2PCR鑒定假定轉(zhuǎn)化子從再生培養(yǎng)基上隨機挑取24個假定轉(zhuǎn)化子并提取少量基因組DNA，利用克隆靈芝gpd啟動子基因的上游引物和gfp基因的下游引物進行PCR檢測，實驗結(jié)果如圖3所示，在24個受檢轉(zhuǎn)化子中有12個假定轉(zhuǎn)化子的基因組DNA能擴增出約900bp的目的條帶，與陽性對照擴增的條帶大小一致，同時陰性對照沒有擴增出目的條帶。結(jié)果表明，gpd基因和gfp基因片斷已整合到基因組DNA，沒有擴增出特異條帶的轉(zhuǎn)化子可能只轉(zhuǎn)化了色氨酸基因（trp1）。1800bp→1200bp1800bp→1200bp→圖3假定轉(zhuǎn)化子基因組DNA的PCR產(chǎn)物電泳圖M：DNAMarkerIII；1～24：假定轉(zhuǎn)化子基因組PCR產(chǎn)物；CK+：質(zhì)粒pLBGPCR產(chǎn)物；CK：非轉(zhuǎn)化子LT2基因組PCR產(chǎn)物；Fig.3PCRproductionofgenomicDNAfromputativetransformantsM：DNAMarker；1~24：PCRproductionofputativetransformants；CK+：PCRproductionofplasmidpLBG；CK：PCRproductionofnontransformant2.3Southernblot分析假定轉(zhuǎn)化子2.3.1假定轉(zhuǎn)化子基因組DNA用FDEB法大量提取12個PCR鑒定陽性轉(zhuǎn)化子基因組DNA，通過電泳檢測其質(zhì)量。實驗結(jié)果如圖4所示，基因組DNA條帶清晰，無拖尾現(xiàn)象，即所提取的轉(zhuǎn)化子基因組DNA無降解，質(zhì)量良好。圖4假定轉(zhuǎn)化子基因組DNA電泳圖M：MarkerDNA/HindIII；1～12：質(zhì)粒pLBG和pCc1001的共轉(zhuǎn)化子基因組；Fig.4ElectrophoresisanalysisofgenomicDNAM：DNAMarkerDNA/HindIII；1~12：GenomicDNAofcotransformants；2.3.2HindIII酶切轉(zhuǎn)化子基因組DNA基因組DNA經(jīng)限制性內(nèi)切酶HindIII酶切后，進行電泳檢測。實驗結(jié)果如圖5所示，基因組DNA經(jīng)限制性內(nèi)切酶HindIII酶切后的電泳條帶分布均勻，顯示基因組DNA酶切完全。圖5假定轉(zhuǎn)化子基因組DNAHindIII酶切電泳圖CK：LT2基因組；1～12：轉(zhuǎn)化子基因組；M&CK+：MarkerDNA/HindIII和pLBGFig.5ElectrophoresisanalysisofgenomicDNAofputativecotransformantsdigestedbyHindⅢCK：GenomicDNAofnontransformant；1~12：GenomicDNAofcotransformants；M&CK+：DNAMarkerDNA/HindIIIandplasmidpLBG2.3.3Southernblot分析利用gfp基因作為探針對轉(zhuǎn)膜后的基因組DNA進行雜交檢測，實驗結(jié)果如圖6所示，有8個假定轉(zhuǎn)化子有雜交信號，其中1、2、4、5、7、9、11、12號轉(zhuǎn)化子有單條雜交信號，表明gfp基因以單拷貝形式整合到共轉(zhuǎn)化子的基因組DNA中。9號轉(zhuǎn)化子有2條信號帶，表明gfp基因以雙拷貝形式整合到基因組DNA中。3、6、8、10號假定轉(zhuǎn)化子沒有雜交信號，原因可能是繼代培養(yǎng)過程中外源基因的丟失或者是PCR假陽性所致。同時陽性對照有雜交信號而陰性對照沒有。圖6轉(zhuǎn)化子的Southernblot分析CK+為質(zhì)粒pLBG；112為PCR陽性轉(zhuǎn)化子；CK為非轉(zhuǎn)化子LT2Fig.6SouthernblotanalysisofcotransformantsCK+：PlasmidpLBG；112:CotransformantsprimaryidentifiedbyPCR;CK：NontransformantLT22.4熒光檢測假定轉(zhuǎn)化子實驗結(jié)果如圖5所示，在熒光顯微鏡下，對照的非轉(zhuǎn)化子的菌絲沒有熒光出現(xiàn)，有7個轉(zhuǎn)化子的菌絲發(fā)出綠色熒光，5號觀察不到熒光，但southern雜交有信號，這一結(jié)果與BurnsC等報道的相一致[12]。結(jié)果表明，靈芝gpdG1啟動子具有驅(qū)動外源gfp基因表達的活性。藍光視野白光視野abc圖5熒光顯微鏡在藍光和白光視野下觀察到的菌絲圖片（圖未全附）a：非轉(zhuǎn)化子對照菌絲；b、c：轉(zhuǎn)化子菌絲Fig.4ThehyphaundertheFluorescentElectronicMicroscopea：Thehyphaeofnontransformantunderfluorescentelectronicmicroscopeb、c：Thehyphaeofcotransformantunderfluorescentelectronicmicroscope3討論3.1PCR假陽性通過PCR鑒定得出的12個假定陽性轉(zhuǎn)化子中，只有8個在Southernblot分析中顯示雜交信號，假陽性率為33.3％，為較高水平。國內(nèi)外近年來也有不少對PCR法的可靠性提出質(zhì)疑的報道[1718]。然而PCR法具有簡便、靈敏、快速的優(yōu)點，能方便，快速地對轉(zhuǎn)化子的轉(zhuǎn)基因情況進行分析，從數(shù)量眾多的轉(zhuǎn)化子中篩選有研究價值的菌株。因此，只要做好預(yù)防假陽性的措施，運用PCR法將能得到更真實的結(jié)果。3.2目的基因的拷貝數(shù)和整合方式通過雜交分析可知，本實驗中目的gfp基因大部分以單拷貝，隨機整合在轉(zhuǎn)化子染色體基因組上，而多數(shù)食用菌轉(zhuǎn)化中則報道（MellonFMetal.,1987;KuoCYetal.,2004;YanaiKetal.,1996;Jiaetal.,1998;KimBKetal.,1999;HondaYetal,2000）gfp基因以多拷貝，隨機整合在轉(zhuǎn)化子染色體基因組上。原因可能與食用菌的品種有關(guān)。3.3基因沉默現(xiàn)象對8個Southern雜交有信號的轉(zhuǎn)化子進行熒光檢測發(fā)現(xiàn)，有1個轉(zhuǎn)化子沒有熒光現(xiàn)象，判斷是gfp基因在該轉(zhuǎn)化子中不能表達，出現(xiàn)基因沉默現(xiàn)象。相同的現(xiàn)象在BurnsC等[12]在轉(zhuǎn)化灰蓋鬼中同樣出現(xiàn)。這可能與水稻[13]、擬南芥[14]等多種植物中發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)基因沉默現(xiàn)象一致。原因主要包括[1516]：(1)轉(zhuǎn)錄水平基因沉默。機制包括：甲基化作用、位置效應(yīng)、正、反向同源基因、多拷貝重復(fù)基因引起的TGS、復(fù)雜結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)基因引起的TGS。(2)轉(zhuǎn)錄后水平基因沉默。機制包括：RNA域值效應(yīng)、異位配對和異常RNA、雙鏈RNA。Burnsetal.（2004）[19]利用雙孢蘑菇啟動子gpdⅡ連接gfp基因構(gòu)建表達載體，與潮霉素抗性(hpt)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化至灰蓋鬼傘及雙孢蘑菇的研究發(fā)現(xiàn)，只有在雙孢蘑菇啟動子gpdⅡ后面連上雙孢蘑菇gpd基因的第一個內(nèi)含子的轉(zhuǎn)化子才能觀察到綠色熒光。他還指出，Maetal.（2001）[20]在裂褶菌和白腐菌黃袍原毛平革菌中能成功表達gfp基因也是因為載體上有g(shù)pd基因的內(nèi)含子。本實驗使用的pLBG質(zhì)粒也含有一小段gpd基因的內(nèi)含子，因此降低了外源基因甲基化程度，從而降低了轉(zhuǎn)基因沉默現(xiàn)象。啟動子活性分析3.4.1目前，同源啟動子的應(yīng)用有：HiranoT等（1999，2000）[21,22]用香菇gpd啟動子構(gòu)建了載體pLGhpt轉(zhuǎn)化香菇；ChunYiK等（2004）[23]用金針菇gpd啟動子構(gòu)建載體轉(zhuǎn)化金針菇；VandeRhee等（1996）[24]用雙孢蘑菇gpd啟動子構(gòu)建了載體轉(zhuǎn)化雙孢蘑菇均得到了高效表達潮霉素抗性基因的轉(zhuǎn)化子。對近源啟動子的應(yīng)用有：Casselton等(1989)發(fā)現(xiàn)來自兩株擔(dān)子菌的trp基因可以在灰蓋鬼傘中表達,而來自子囊菌構(gòu)巢曲霉的trp基因在灰蓋鬼傘中不能表達,推測其原因是擔(dān)子菌不易識別外源啟動子。Schuncn(1994)在研究裂褶菌的轉(zhuǎn)化時,用裂褶菌的gfp基因的啟動子控制來自鏈霉菌的標記基因ble,得到了較高的轉(zhuǎn)化率,當(dāng)改用構(gòu)巢曲霉的gfp啟動子時,則得不到轉(zhuǎn)化子。Chen[25]轉(zhuǎn)化雙孢蘑菇時發(fā)現(xiàn)，使用雙孢蘑菇的gpd啟動子、構(gòu)巢曲霉的gpd動子和花椰菜病毒35S啟動子的轉(zhuǎn)化率分別為15%、1%、0。上述研究主要從菌種之間的親源性作比較，表明了同源或近源啟動子有利于宿主菌的識別，從而有利于外源基因的表達。3.4.2靈芝啟動子序列分析應(yīng)用DNAssist2.0軟件，將靈芝gpdG1（柳永，2006）[26]啟動子序列與灰樹花(王海燕，2004)[27]、香菇(GeneBankAccession：AB013136)、草菇(GeneBankAccession：AY842301)的gpd啟動子序列進行比對。結(jié)果如圖6所示，上述四種擔(dān)子菌的gpd啟動子序列的相似性很高，再經(jīng)過BLASTn程序分析，其相似程度達98％。另外，將靈芝gpdG1啟動子序列與灰蓋鬼傘（GeneBankAccession：AB094148）的gpd啟動子序列進行比對。結(jié)果如圖7所示，兩個啟動子序列中只有零星的短小片斷相同，再經(jīng)過BLASTn程序分析，其相似程度低于3％。序列相似程度高的啟動子容易被對方宿主識別，而有利于外源基因的表達。比如香菇gpd啟動子構(gòu)建的外源表達載體能成功轉(zhuǎn)化靈芝（SunLetal.,2001）[4]。然而，序列上相似程度低的啟動子也有成功轉(zhuǎn)化的例子，如雙孢蘑菇gpdⅡ啟動子序列與灰蓋鬼傘的gpdⅡ啟動子序列相似性很低，但用雙孢蘑菇gpdⅡ啟動子構(gòu)建的gfp表達載體能成功轉(zhuǎn)化灰蓋鬼傘。同樣，本實驗的靈芝gpd啟動子序列與灰蓋鬼傘的gpd序列相似性也很低，但同樣獲得gfp蛋白的表達。由此可見，啟動子序列的相似性不是影響食用菌外源基因轉(zhuǎn)化的主要原因。Ganodermalucidum2TATGCTGGTTATCTGAGCGGGCCCGTATCCTATCGGCGTTAGAGTGCAG50Grifolafrondosa2TATGCTGGTTATCTGAGCGGGCCCGTATCCTATCGGCGTTAGAGTGCAG50Lentinusedodes1548TTATGCTGGTTATCTGAGCGGGCCCGTATCCTATCGGCGTTAGAGTGCAG1597Volvariellavolvacea791TTATGCTGGTTATCTGAGCGGGCCCGTATCCTATCGGCGTTAGAGTGCAG840Ganodermalucidum51TCGGAGAGCCGCATGTATCACGGAAAGGACTCGGACAGGGAGTTTTATCT100Grifolafrondosa51TCGGAGAGCCGCGTGTATCACGGAAAGGACTCGGACAGGGAGTTTTATCT100Lentinusedodes1598TCGGAGAGCCGCATGTATCACGGAAAGGACTCGAACAGGGAGTTTTATCT1647Volvariellavolvacea841TCGGAGAGCCGCATGTATCACGGAAAGGACTCGAACAGGGAGTTTTATCT890Ganodermalucidum101ATTCTTATTGGTCGATATCAGTCAGATTGTCAGTGCGTCAAAGTTGCATC150Grifolafrondosa101ATTCTTATTGGTCGATATCAGTCAGATTGTCAGTGCGTCAAAGTTGCATC150Lentinusedodes1648ATTTATATTGGTCGATATCAGTCAGATTGTCAGTGCGTCAAAGTTGCATC1697Volvariellavolvacea891ATTTTTATTGGTCGATATCAGTCAGATTGTCAGTGCGTCAAAGTTGCATC940Ganodermalucidum151CATAAGGCTACTACGGTGAAACCGGTGTATCCTGGGATAGCATGAAATGG200Grifolafrondosa151CATAAGGCTACTACGGTGAAACCGGTGTATCCTGGGATATCATGAAATGG200Lentinusedodes1698CATAAGGCTACTACGGTGAAACCGGTGTATCCTGGGATATCATGAAATGG1747Volvariellavolvacea941CATAAGGCTACTACGGTGAAACCGGTGTATCCTGGGATATCATGAAATGG990Ganodermalucidum201TTGTATGCAGAAGATAAGAATGAGAGTAGTTCTAGAACAACAAACCCAGG250Grifolafrondosa201TTGTATGCAGAAGATAAGAATGAGAGTAGTTCTAGAACAACAAACCCAGG250Lentinusedodes1748TTGTATGCAGAAGATAAGAATGAGAGTAGTTCTAGAACAACAAACCCAGG1797Volvariellavolvacea991TTGTATGCAGAAGATAAGAATGAGAGTAGTTCTAGAACAACAAACCCAGG1040Ganodermalucidum251CCAGGGAGGAAGCTGTAGCATTTGCAAGACTTTGCAGGGCTTTTCAAAGG300Grifolafrondosa251CCAGGGAGGAAGCTGTAGCATTTGCAAGACTTTGCAGGGCTTTTCAAAGG300Lentinusedodes1798CCAGGGAGGAAACTGTAGCATTTGCAAGACTTTGCAGGGCTCTTCAAAGG1847Volvariellavolvacea1041CCAGGGAGGAAGCTGTAGCATTTGCAAGACTTTGCAGGGCTTTTCAAAGG1090Ganodermalucidum301CACTTCCATCCAAAGCTCGAGCACGGTTCCAGGCAACCTTAGTCATGGGG350Grifolafrondosa301CACTTCCATCCAAAGCTCGAGCACGGTTCCAGGCAACCTTAGTCATGGGG350Lentinusedodes1848CACTTCCATCCAAAGCTCGAGCACGGTTCCAGGCAACCTTAGTCATGGGG1897Volvariellavolvacea1091CACTTCCATCCAAAGCTCGAGCACGGTTCCAGGCAACCTTAGTCATGGGG1140Ganodermalucidum351CGATAGAACTGGAGAACGTTTGCTGATTGGCAGTCCATCCCAAAGGACTC400Grifolafrondosa351CGACAGAACTGAAGAACGTTTGCTGATTGGCAGTCCATCCCAAAGGACTC400Lentinusedodes1898CGATAGAACTGAAGAACGTTTGCTGATTGGCAGTCCATCCCAAAGGACTC1947Volvariellavolvacea1141CGATAGAACTGAAGAACGTTTGCTGATTGGCAGTCCATCCCAAAGGACTC1190Ganodermalucidum401GGCCAATAAATCCTACCCAATCGCAGGTCCGAGGTACTAAAGTGTTTTAA450Grifolafrondosa401GGCCAATAAATCCTACCCAATCGCAGGTCCGAGGTACTAAAGTGTTTTAA450Lentinusedodes1948GGCCAATAAATCCTATCCAATCGCAGGTCCGAGGTACTAAAGTGTTTTAG1997Volvariellavolvacea1191GGCCAATAAACCTACCCAATCGCAGGTCCGAGGTACTAAAGTGTTTTAA1239Ganodermalucidum451GGTCTAGACTTTAGGGCTATTGTCGAAGTCACAACATCACGCAATCAAG549Grifolafrondosa451GGTCTAGACTTTTAGGGCTATTGTCGAAGTCACAACATCACGCAATCAAG500Lentinusedodes1998GGTCTAGACTTTTAGGGCTATTGTCGAAGTCACAACATCACGCAATCAAG2047Volvariellavolvacea1240GGTCTAGACTTTTAGGGCTATTGCCGAAGTCACAACATCACGCAATCAAG1289Ganodermalucidum500ATTTGACTGAAGCGCGATTATCTATAAAAGGATCAGTTGTGTTTTTCGTC549Grifolafrondosa501ATTTGACTGAAGCGCGATTATCTATAAAAGGATCAGTTGTGTTTTTCGTC550Lentinusedodes2048ATTTGACTGAAGCGCGATTATCTATAAAAGGATCAGTTGTGTTTTTCGTC2097Volvariellavolvacea1290ATTTGACTGAAGCGCGATTATCTATAAAAAGATCAGTTGTGTTTTTCGTC1339Ganodermalucidum550CGCATCTTTTCCTTGTTCCACAACCTTCGATTCTAAATACACTCCAATCC649Grifolafrondosa551CGCATCTTTTCCTTGTTCCACAACCTTCGATTCTAAATACACTCCAATCC600Lentinusedodes2098CGCATCTTTTCCTTGTTCCACAACCTTCGATTCTAAATACCCTCCAATCC2147Volvariellavolvacea1340CGCATCTTTTCCTTGTTCCACAACCTTCGATTCTAAATACCCTCCCTGC1388Ganodermalucidum650ATTGACTGCTTGAATAATCACTAGTG675Grifolafrondosa601ATTGACTGCTTGAATA616Lentinusedodes2101ATTGACTGCTTGAATTAAAA2120Volvariellavolvacea1389AGTTA1393圖6靈芝（Ganodermalucidum）、灰樹花（Grifolafrondosa）、香菇（Lentinusedodes）、草菇（Volvariellavolvacea）gpd啟動子序列比對Fig.6parisonofgpdsequenceofGanodermalucidum，Grifolafrondosa，Lentinusedodes，VolvariellavolvaceaGanodermalucidum1TATGCTGGTTA11Coprinuscinereu53GCCCTGAAGTGCCCCCCTGCGCATGGCGACTTGGGACTAGTTTAGCTCAGCG104Ganodermalucidum12TCTGAGCGGGCCCGTATCCTATCGGCGTTAGAGTGCAGTCGGAGAGCCG60Coprinuscinereu105TCGCGGCTCGCCCATAGCAAACGCTGAGGTAGAACATGACGTTGCATGCCGG156Ganodermalucidum61CATGTATCACGGAAAGGACTCGGACAGGGAGTTTTATCTATTCT104Coprinuscinereu157CTTGAACTCAAACACTCGCCATCCACAGCCTGCGCGGAGCTTGTGGATTGCG208Ganodermalucidum105TATTGGTCGATATCAGTCAGATTGTCAGTGCGTCAAAGTTGCAT148Coprinuscinereu209TCTGCATTAGAGAGCAGAGGGCGTCGTACATGTCAGAGCGCGAGTCTGACAA260Ganodermalucidum149CCATAAGGCTACTACGGTGAAACCGGTGTATCCTGGGATAGCATGAAATG198Coprinuscinereu261ATGTCTGACAGAGCGGCGGAGGCGCCGTGCGAGCGGCGGGAGAGGAGAAG310Ganodermalucidum199GTTGTATGCAGAAGATAAGAATGAGAGTAGTTCTAGAACAACAAACCCAGGC250Coprinuscinereu311GACCGCGGTGTGATTGGCTGGGGAGACGCGTCGTGGCGCGTCCTGCCCAGAC362Ganodermalucidum251CAGGGAGGAAGCTGTAGCATTTGCAAGACTTTGCAGGGCTTTTCAAAG298Coprinuscinereu363CGCGACGTCGGAGAAGAGACGAGGACGGGCGAGAAGGGCGAGCAGCCGTAGanodermalucidum299GCACTTCCATCCAAAGCTCGAGCACGGTTCCAGGCAACCTTAGTCATGGGGC350Coprinuscinereu414GTCCGCCGCGCCAGAGCGCTATCGATTGATGGTCGTCACACCCGCGGCGA463Ganodermalucidum351GATAGAACTGGAGAACGTTTGCTGATTGGCAGTCCATCCCAAAGGAC397Coprinuscinereu464GGCAGTGTTCTCTCGCGCAGAGTCGCTGGGCTGACTGAGAGTGTGCAGCGAC515Ganodermalucidum398TCGGCCAATAAATCCTACCCAATCGCAGGTCCGAGGTACTAAAGTGTTT446Coprinuscinereu516TGGGCAGATCGTACGTGCGGGGTCGGACGCGGCGAACGGCACGGACGAAGGC567Ganodermalucidum447TAAGGTCTAGACTTTAGGGCTATTGTCGAAGTCACAACATCACGCAATC495Coprinuscinereu568GACCGATCCGCGCGATGAGCAAATGTCGGACGAGTCATTGCCTCACGCACGT619Ganodermalucidum496AAGATTTGACTGAAGCGCGATTATCTATAAAAGGATCAGTTGTGTTTTTCGT547Coprinuscinereu620TCGATCGCGCACAACTTGCATCCCCAGCAGCTGGCACTGTGGGCAGCTCACT671Ganodermalucidum548CCGCATCTTTTCCTTGTTCCACAACCTTCGATTCTAAATACACTCCAA595Coprinuscinereu672CGGGCTGGTCGTCGACGTCGGGAAAGCGAGTCCGTCTGGACGTCGAACGT721Ganodermalucidum596TCCATTGACTGCTTGAATAATCACTAGTG624Coprinuscinereu722GAGCGTCGTCGGAACGGAGGAAGGAGGACGAGCGGGGACCCGGCACGGACAG773圖7靈芝（Ganodermalucidum）、灰蓋鬼傘（Coprinuscinereu）gpd啟動子序列比對Fig.7parisonofgpdsequenceofGanodermalucidum，Coprinuscinereu3.4.3啟動子核心元件分析進一步分析上述7種菌的啟動子核心元件，見表1，發(fā)現(xiàn)7個菌種均沒有GC富含區(qū)（GGGCGG）。它們的啟動子核心元件TATAbox序列非常保守，除雙孢蘑菇是TACAAAAA（Harmsenetal.1992）[19]外，其他都是TATAAAA。CAATbox的序列也非常保守，雙孢蘑菇是CAAT外，其他都是CCAAT或TCAAT。兩種box在數(shù)量上相差不大。靈芝、灰樹花、草菇的TATAbox與CAATbox的距離幾乎一樣，香菇、金針菇、灰蓋鬼傘的TATAbox與CAATbox距離則相差較大。我們猜測啟動子的識別可能與核心元件的序列、個數(shù)有關(guān)，與核心元件之間的距離關(guān)系不密切。因此，即便是啟動子的序列相似程度低，只要核心元件的序列和個數(shù)相當(dāng)，也能啟動外源基因表達。另外，比較灰蓋鬼傘和靈芝的啟動子發(fā)現(xiàn)，灰蓋鬼傘的啟動子元件很少，甚至連重要的CAATbox元件都沒有。而靈芝gpdG1啟動子含有豐富的啟動子元件，包括真核生物啟動子關(guān)鍵的TATAbox和CAATbox元件。即靈芝gpdG1啟動子能滿足灰蓋鬼傘轉(zhuǎn)錄因子對啟動子元件的需要，從而使靈芝gpdG1啟動子在灰蓋鬼傘發(fā)揮啟動活性。比較灰蓋鬼傘和表1其他擔(dān)子菌發(fā)現(xiàn)，其余的各個啟動子核心元件均比其他7種菌要少，也就是說，該7種擔(dān)子菌的啟動子的核心元件在序列上和數(shù)量上能滿足灰蓋鬼傘啟動表達的要求，均可以在灰蓋鬼傘中啟動表達。然而目前的實驗數(shù)據(jù)還沒足以證明這一猜測，有待以后研究。表1啟動元件列表Tab.1Listofpromoterelements啟動子TATAbox（個)CAATbox（個)GCstretches(GGGCGG)（個)GATAbox（個)TATAbox與CAATbox的距離靈芝1204100bp～114bp灰樹花1203101bp～115bp草菇1206101bp～114bp香菇1409101bp～1505bp雙孢蘑菇gpdⅡ1103149bp金針菇1405580bp～1158bp灰蓋鬼傘1001－3.4.4靈芝gpdG1啟動子活性高低分析從觀察到的轉(zhuǎn)化子熒光分析，靈芝gpdG1啟動子在灰蓋鬼傘中有啟動活性，但活性高低無法定量作出判斷。這是因為綠色熒光蛋白熒光強度與其含量的線性關(guān)系不強，因此無法對綠色熒光蛋白作出準確的定量分析，從而不能對啟動子活性作出定量的描述；其次其在灰蓋鬼傘菌絲中表達的不均一性和復(fù)雜性也使通過熒光定量檢測比較不同轉(zhuǎn)化子中g(shù)fp基因的表達效率成為一個難題。因此無法對啟動子的啟動活性高低作出準確的比較和判斷。如果要進一步定量分析啟動子活性高低，可采用能定量分析的報告基因。3.4目前，gpd啟動子序列的長短與基因表達調(diào)控的機理及其啟動活性之間的關(guān)系還不清楚。HiranoT等[12]采用香菇gpd啟動子遠離轉(zhuǎn)錄起始位點的上游缺失片段，構(gòu)建不同長度gpd啟動子片段的轉(zhuǎn)化載體，同源轉(zhuǎn)化香菇，試驗結(jié)果表明，香菇啟動子中位于起始位點上游442bp和985bp之間的序列對啟動子功能活性無明顯影響，即轉(zhuǎn)錄起始