食品三級質量檢驗員培訓筆記-微生物

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歡迎各位老師指正

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目錄：

001樓：細菌檢驗基礎知識-分類、形態(tài)、生理、培養(yǎng)分離

002樓：細菌檢驗基礎知識-生化試驗、菌種保存

005樓入口：沙門氏菌

014樓入口：志賀氏菌-待補充

030樓入口：金黃色葡萄球菌

039樓入口：溶血性鏈球菌

待續(xù)。。。

細菌檢驗基礎知識

1、分類

細菌屬于原核細胞型微生物。

最精確的方法為遺傳學分類方法。

最常用的是經典傳統(tǒng)分類法：按照細菌的親緣關系，界門綱目科屬種型株分類。

科：由共同情書關系的屬組成，如腸桿菌科；

屬：是種的高一級分類單位，通常包含有共同特征或關系密切的種，用以描述微生物的主要

特征，如埃希氏菌屬；

種：是分類等級的基本單位，同一種微生物形態(tài)、生理學特征和組成成分基本相同，用以描

述微生物的次要特征，如大腸埃希氏菌；

菌株或品系：同種微生物中不同來源的純培養(yǎng)物，如大腸埃希氏菌CGMCC1.3373。

2、細菌形態(tài)學及形態(tài)學檢查法

細菌形態(tài)結構主要指細菌的大小、形狀、排列及超微結構。細菌結構與其生理功能、致病性、

免疫性有關。

2.1形態(tài)結構

2.1.1基本形態(tài)3類：球菌、桿菌、螺旋菌，桿菌是最常見的形態(tài)。

2.1.2大小

測量細菌大小的單位為微米Um。球菌以直徑表示大小，桿菌以長與寬表示大小，

同一種細菌在不同情況下大小形態(tài)也有差別：涂片干燥、固定、染色時細菌收縮；快速生長

的球菌往往呈短桿狀。

菌齡與細菌大小的關系受許多因素影響，主要與代謝廢物的積累及培養(yǎng)基中滲透壓上升等因

素有關。

2.1.3結構

基本結構：細胞壁、細胞膜、細胞質、核質；

特殊結構：鞭毛、菌毛、莢膜、芽抱等。

菌毛是什么？-菌毛(Pilus)許多革蘭氏陰性菌菌體表面遍布的比鞭毛更為細、短、直、硬、

多的絲狀蛋白附屬器，也叫做纖毛其化學組成是菌毛蛋白菌毛與運

（Fimbriae）o（Pilin）,

動無關。菌毛可分為普通菌毛（Commonpilus）和性菌毛（Sexpilus）兩種。普通菌毛長0.3?l.Oum,

直徑7nm。具有粘著細胞（紅細胞、上皮細胞）和定居各種細胞表面的能力，它與某些細

菌的致病性有關。無菌毛的細菌則易被粘膜細胞的纖毛運動、腸蠕動或尿液沖洗而被排除,

失去菌毛，致病力亦隨之喪失。性菌毛有的細菌還有1?4根較長的性菌毛，比普通菌毛而

粗，中空呈管狀。性菌毛由質粒攜帶的?種致育因子（Ferilityfactor）的基因編碼，故性菌

毛又稱F菌毛。帶有性菌毛的細菌稱為F+菌或雄性菌，無性菌毛的細菌稱為F-菌或雌性菌。

F+菌體內的質粒或染色體DNA可通過中空的性菌毛進入F-菌體內，這個過程稱為接合

（conjugation）,細菌的毒性及耐藥性等性狀可通過此方式傳遞，這是某些腸道桿菌容易產

生耐藥性的原因之一。（摘自百度）

2.2形態(tài)學檢查法

分為不染色標本檢查法和染色標本檢查法。

不染色標本檢查法：依靠普通顯微鏡，雖可觀察細菌大小、形態(tài)，但主要用于觀察細菌的動

力。

觀察細菌有動力時，應選用新鮮的幼齡培養(yǎng)物（幼到啥程度？-對數(shù)期），并在20℃以上室

溫中進行，同時應掌握區(qū)別細菌真正運動與溶膠的布朗運動。常用的方法有壓滴法、懸滴法、

暗視野映光法等。

染色標本檢驗法：分為單染色法、復染色法、特殊染色法。

觀察細菌菌毛應使用鞭毛染色法。

細菌學中最常用的鑒別染色法是革蘭氏染色法。

基本步驟為：涂片一干燥一固定一染色

革蘭氏染色的結果與培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)條件及操作技術等有著密切關系。酒精脫色為關鍵步

驟。

3、細菌生理學

3.1化學組成

水、蛋白質、糖類、脂類、無機鹽、核酸、維生素，各種組成隨細菌種類、菌齡、細菌所處

環(huán)境不同而有差異。

固形成分占菌體質量15%~25%,其中碳、氫、氧、氮四種元素占90%~97%,其他元素占3%~10%。

水分：占細菌質量75%~85%,芽抱約40%。繁殖體內主要是游離水，芽抱內主要是結合水。

結合水不易蒸發(fā)，不凍結，不能作為溶劑，也不能滲透。

蛋白質：分布在菌體各個組成部分，占菌體固形成分50%~80%。除少量白蛋白、球蛋白等

單純蛋白質外，絕大部分與其他物質結合成復合蛋白質，如核蛋白、糖蛋白、脂蛋白等，其

中核蛋白含量最高。蛋白質是維持細菌生命活動的最基本物質，是細菌酶類的主要組成部分。

核酸：分RNA（細胞質、細胞膜中，約占固形成分10%）與DNA（染色體、質粒中，占固

形成分3%左右）兩種。

糖類：占固形成分10%~30%,主要以多糖形式存在，如莢膜多糖、纖維素、淀粉、糖原等。

脂類：細菌體內能量儲存場所。

無機鹽類：調節(jié)劑滲透壓和維持酶活性的作用。

其他：生長因子主要是B族維生素，大多數(shù)是菌體內的輔酶成分。色素種類很多，一般都是

含氮的有機物。

3.2物理性狀

帶電現(xiàn)象：菌體蛋白質由許多氨基酸組成。氨基酸是兼性離子，在等電點時，其所帶正電荷

與負電荷相等。革蘭氏陽性菌pH2~3,革蘭氏陰性菌pH4~5。一般培養(yǎng)、染色、血清學試驗

中，多數(shù)為中性或弱堿性環(huán)境，pH值高于細菌等電點，均帶負電荷。環(huán)境中pH值越高所帶

負電荷越多。帶電現(xiàn)象與細菌的染色反應、凝集反應、抑菌、殺菌作用等都有密切關系。

多相膠體：原生質中具有多種蛋白質，成分結構各不相同，為多相膠體，因此可同時進行各

種性質不同的生化反應。細胞外濃度較低的化學物質可被原生質中的某一相選擇性的吸收濃

縮于細胞內。

表面積：單位體積的表面積比其他大生物的表面積大。每立方厘米葡萄球菌的表面積為

60000cm2?因而細菌代謝活躍，繁殖速度很快，同樣對外界環(huán)境因素的影響也十分敏感。

布朗運動：在溶液中，因受到分散酶分子的撞擊，發(fā)生不移動位置的顫動，叫做布朗運動。

光學性質：菌體呈半透明狀態(tài)，光線照射菌體時，一部分光被吸收，一部分光發(fā)生散射，所

以細菌懸液呈現(xiàn)渾濁現(xiàn)象。

滲透性:細菌的細胞壁和細胞膜都有半滲透性,吸收營養(yǎng)和代謝產物均依賴于這種通透作用。

細菌具有堅韌的細胞壁，除能耐受菌體內部的高滲透壓外，還能保護細菌在滲透壓較低的環(huán)

境中不致破裂，但在純水中也不免吸收水分而脹裂。

3.3代謝

細菌為了生長繁殖,必須從環(huán)境中吸取營養(yǎng)物質作為能源和基本原料,并排出不需要的產物,

這些生化過程稱為細菌的代謝，包括分解代謝和合成代謝。

3.3.1分解代謝及生化反應

定義：將復雜的營養(yǎng)物質分解為簡單的化合物，一方面提供合成菌體成分的原料，一方面從

物質分解中獲得能量。

（1）糖類：大多數(shù)細菌能利用糖，由于各種細菌所具有的酶系統(tǒng)不同，故分解糖類的能力

也不同?；镜奶谴x過程：多糖一單糖一丙酮酸，而丙酸酮進一步分解的后續(xù)過程則因各

種細菌而異。

1）糖發(fā)酵試驗：經常用于細菌的鑒別。如大腸埃希氏菌，使丙酮酸生成甲酸，并由甲酸解

氫酶分解甲酸生成C02和H2,所以分解葡萄糖時產酸產氣；而傷寒桿菌只有使丙酮酸生成

甲酸的能力，分解葡萄糖只能產酸不能產氣。

2）V-P試驗：產氣桿菌能使丙酮酸脫竣，生成中性乙酰甲基甲醉。乙酰甲基甲醇在堿性溶

液中被大氣中的氧分子氧化，生成紅色化合物，這一反應成為V-P試驗陽性。大腸埃希氏菌

不生成乙酰甲基甲醇，故陰性。該實驗腸道菌必做。

3）甲基紅試驗：在上述產氣桿菌培養(yǎng)液中，由于2個分子的丙酮酸已變?yōu)?個分子的中性

乙酰甲基甲醉（位于有氧無氧分解的交界點上），生成的酸量就相應減少，故pH值相應較

高（PH5.4以上），用甲基紅做指示劑時，培養(yǎng)液呈現(xiàn)橘黃色，稱為甲基紅試驗陰性。而大

腸埃希氏菌因分解丙酮酸時不產生乙酰甲基甲醉，產生的酸較多，故培養(yǎng)液的pH值下降到

4.5或更低，因此甲基紅指示劑呈紅色反應，即陽性。

（2）蛋白質：蛋白質分子量大，不能被菌體直接吸收作為營養(yǎng)基質，有必要先通過細菌的

胞外酶，如蛋白酶，把蛋白質分解成為能透進細胞壁與細胞膜的多肽或氨基酸，才能運轉入

菌細胞內被利用。細菌分解蛋白質的過程一般為：蛋白質一蛋白口（音“示”）一蛋白豚一

多肽f氨基酸。不同細菌分解蛋白質的能力不同，可用明膠液化試驗或蛋白質消化試驗來鑒

別細菌的種類。氨基端進一步分解主要分三種方式進行：脫氨基作用、脫竣基作用、其他分

解作用（生成明跺、生成硫化氫、分解尿素）。

（3）枸椽酸鹽利用試驗：產氣桿菌能利用枸檬酸鹽作為碳源，因而在僅含枸檬酸鹽而不含

其他碳源的培養(yǎng)基上生長，分解枸椽酸鹽生成碳酸鹽，使培養(yǎng)基山原來的中性變?yōu)閴A性，以

嗅麝香草酚藍為指示劑可顯示出培養(yǎng)基由綠色變?yōu)樯钏{色，即枸檬酸鹽陽性。相反，大腸桿

菌不能利用枸椽酸鹽為唯一碳源，故不能在此培養(yǎng)基上生長，培養(yǎng)基顏色不變,為陰性反應。

3.3.2合成代謝及其產物

（1）毒素與侵襲性酶：

細菌產生的內毒素和外毒素均有強烈毒性，尤以外毒素為甚。

內毒素為革蘭氏陰性菌的細胞壁成分，即脂多糖，其毒性存在于脂類A部分，當菌體死亡

崩解后才游離出來。其性質穩(wěn)定，加熱至160℃2~4h或用強酸、強堿或強氧化劑加溫煮沸

30min才滅活。

外毒素是蛋白質，在細菌生活過程中即可釋放出菌體。產生外毒素的細菌大多是革蘭氏陽性

菌，但也有少數(shù)革蘭氏陰性菌。其性質不穩(wěn)定，易被熱（50~60℃20~120min）破壞。

某些細菌還能產生具有侵襲性的酶，能損傷機體組織，如產氣莢膜梭菌的卵磷脂酶、鏈球菌

的透明質酸酶等。

（2）熱原質：許多革蘭氏陰性桿菌能產生一種多糖，將它注入人體或動物體內能引起發(fā)熱

反應，故稱熱原質。121℃20min也不能破壞。用吸附劑和特制石棉濾板可除去輸液中的大

部分熱源質，玻璃器皿上的熱原質則需在250℃高溫下干烤才能破壞（時間？）。如變形桿

菌、銅綠假單胞菌（舊稱綠膿桿菌）。

（3）色素：有些細菌在一定條件下（氧氣充足、溫度適宜或暴露陽光）能產生各種顏色的

色素。產生的色素有的能溶于水而擴散至周圍環(huán)境中，另一些色素為脂溶性不溶于水僅使菌

落本身有色。

（4）抗生素：主要是由某些微生物在代謝過程中產生的一種抗生物質，能抑制或殺死某些

生物細胞（主要是微生物和腫瘤細胞）?？股刂饕煞啪€菌和真菌產生，由細菌產生的較

少，只有多黏芽泡桿菌產生的一組多肽類抗生素（多黏菌素）和由第一芽抱桿菌產生的多肽

類抗生素（桿菌肽）等少數(shù)幾種。

（5）細胞素：某系細菌種株間產生的一類具有抗菌作用的蛋白質。與抗生素不同，其抗菌

范圍狹窄，僅對■產生與細胞素的菌株有近緣關系的細菌才有抑殺作用。由于其具有特異性,

已用于細菌種內的分型。

（6）維生素：維生素是細菌必須的生長因子，有些細菌能自己合成，除供菌體本身所需外，

也能分泌至菌體外。人體腸道內的大腸埃希氏菌能合成維生素B6、B12、K2等，可供人體

所需。

4、細菌的培養(yǎng)和分離技術

4.1用途

通過細菌培養(yǎng)可以研究細菌的形態(tài)、代謝活動、生化反應、抗原結構及致病力等，并且對細

菌進行鑒定。

細菌培養(yǎng)應用于食品和環(huán)境等樣品的細菌學檢驗，以評價食品或環(huán)境的衛(wèi)生情況。

對患者或帶菌者體內（代謝物）的病原菌進行培養(yǎng)，鑒定其種屬并對病原菌進行藥物敏感性

試驗，從而做出確切的病原學診斷，選擇有效藥物進行治療。

4.2培養(yǎng)所需條件

4.2.1培養(yǎng)基：細菌培養(yǎng)所使用的培養(yǎng)基應滿足細菌生長和鑒別所需要的條件，選擇相應的

營養(yǎng)要素和基質成分。

按其用途可分為六大類：基礎培養(yǎng)基、營養(yǎng)培養(yǎng)基、選擇培養(yǎng)基、鑒別培養(yǎng)基、特殊培養(yǎng)基

和厭氧培養(yǎng)基。

現(xiàn)使用的商業(yè)化的培養(yǎng)基為干燥培養(yǎng)基，其中含有培養(yǎng)基的各種成分，使用時只要按一定比

例加入適量水分即可，具有節(jié)省制備時間、質量穩(wěn)定、攜帶方便等優(yōu)點。

4.2.2細菌培養(yǎng)的其他條件

合適的酸堿度:對細菌的生長繁殖影響很大。多數(shù)病原菌最適宜的酸堿度在pH7.2~7.6之間，

個別細菌如霍亂弧菌可在堿性PH8.4~9.2環(huán)境中生長。許多細菌在培養(yǎng)過程中因分解糖類而

產酸，影響了本身的生長，因此有時需在培養(yǎng)基中加入磷酸氫二鉀、磷酸氫二鈉等緩沖劑,

防止溶液pH值波動過大.

適宜的溫度：一般細菌在15~40℃都能生長，但多數(shù)病原菌的最適生長溫度為36~37℃。

一定的濕度：細菌生長需要?定的水分，以利于營養(yǎng)物質的滲透。干燥不利于細菌的生長。

必要的氣體環(huán)境：需氧菌須在有氧環(huán)境下生長，厭氧菌須在無氧條件中才能生長。牛布魯氏

菌及腦膜炎球菌初分離時，必須在培養(yǎng)環(huán)境的大氣中增加5%~10%的CO2o

4.3細菌培養(yǎng)法

根據對氧氣需求不同可分為需氧培養(yǎng)和厭氧培養(yǎng)。

根據培養(yǎng)基的物理狀態(tài)不同分為液體培養(yǎng)、固體培養(yǎng)、半固體培養(yǎng)。

4.3.1液體培養(yǎng)：不同類型的細菌在液體培養(yǎng)基中會出現(xiàn)不同的生長現(xiàn)象。

（1）渾濁：細菌向四周均勻擴散，出現(xiàn)肉眼可見的不同程度的均勻渾濁生長。

（2）沉淀：少數(shù)排列成鏈狀的細菌可呈沉淀式生長，沉淀物上面的液體清澈，如鏈球菌。

（3）菌膜：專性需氧菌多生長在液體表面，形成菌膜，如枯草桿菌。

4.3.2固體培養(yǎng)

將檢材中的目標對象菌用人工培養(yǎng)法分離出來成為純種，稱為分離培養(yǎng)。

常用的分離方法有平板劃線分離法利涂布法。

分離培養(yǎng)可使細菌在平板培養(yǎng)基表面生長。

如果接種的細菌能適當?shù)姆珠_，經一定時間培養(yǎng)后，便形成單?菌落。

菌落的大小、形狀、色澤、邊緣、透明度、濕潤度、溶血現(xiàn)象等特點則因細菌的種類和所用

培養(yǎng)基不同而異。

菌落的這些特征是識別細菌的重要依據。

當細菌在固體培養(yǎng)基表面密集生長時，多個菌落融合在一起，稱為菌苔。

4.3.3半固體培養(yǎng)

細菌在半固體培養(yǎng)基中生長時，無鞭毛的細菌沿著穿刺線生長，有鞭毛的細菌，除了沿穿刺

線生長外，還可看見從穿刺線向外擴散生長的趨勢。

因此，以穿刺法將細菌接種于半固體培養(yǎng)基中有助于鑒別細菌是否有動力，是否有鞭毛。

細菌檢驗基礎知識

本帖最后由渾身是血于2011-3-1523:18編輯

5、細菌的生物化學試驗

利用生物化學的方法來檢查這些代謝產物以鑒別細菌的方法稱為細菌的生物化學試驗，簡稱

生化試驗。

5.1糖類代謝試驗

5.1.1糖（醇）類發(fā)酵試驗

不同細菌含有發(fā)酵不同糖（醇）的酶，因而發(fā)酵糖（醇）的能力各不相同。即使某些能發(fā)酵

同樣的糖（醇），但其產物也不同，有的產酸產氣，有的產酸不產氣，可根據這些特點來鑒

別細菌。

大致可分為：

液體發(fā)酵管：無糖肉湯或蛋白陳水中，加入1%糖（醇）類指示劑，一支小玻管，經滅菌后

備用。若被檢細菌對營養(yǎng)要求較高時，則在試驗前加入2%~5%無菌血清。

半固體發(fā)酵管：在液體糖（醇）發(fā)酵培養(yǎng)基中，加入0.3%~0.5%瓊脂，溶化后分裝試管，滅

菌后讓試管直立，使瓊脂凝固，做成高層培養(yǎng)基，接種細菌應用接種針穿刺接種。

固體發(fā)酵管：此類培養(yǎng)基一般不常用，僅用于營養(yǎng)要求較高的某些細菌，在含糖類及5%~10%

血清瓊脂斜面上進行發(fā)酵試驗。另外固體高層糖發(fā)酵管，可用于厭氧細菌糖發(fā)酵試驗，如產

氣莢膜桿菌在含糖的固體高層發(fā)酵管中出現(xiàn)洶涌發(fā)酵（產生大量氣體）。

雙糖（或三糖）高層斜面發(fā)酵管：這種培養(yǎng)基含有葡萄糖和乳糖（或再加蔗糖），這兩種糖

（或三種糖）混在一起，制成高層斜面（有沒有直徑與高的比例？），其中葡萄糖和乳糖（或

蔗糖）比例為1:10。

各種糖（醇）發(fā)酵管含糖（醇）的濃度，一般為0.5%~1%,有時可達2%。經121℃20~30min

滅菌，容易水解變質，特別是在堿性溶液中更易破壞。

故糖（醇）發(fā)酵培養(yǎng)基常用高壓蒸汽115°C15min滅菌。

應用的糖（醇）種類很多：

單糖：葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖、果糖、木膠糖、半乳糖；

雙糖：乳糖、麥芽糖、蔗糖、覃糖（啥糖？-音qin2,應該是海藻糖）；

多糖：菊糖、肝糖、糊精、淀粉；

醇：甘露醇、衛(wèi)矛醇、山梨醇、側金盞花醇、肌醇、丙三醇（甘油）；

糖甘：水楊昔等。

最常用的指示劑有酚紅、溟麝香草酚藍、嗅甲酚紫、酸性復紅。

前兩者顏色反應較敏感，但穩(wěn)定性差，后二者比較穩(wěn)定。特別是一些遲緩發(fā)酵的細菌，培養(yǎng)

時間長，應用后二者指示劑。

酚紅pH6.8（黃色）~pH8.4（紅色）

5.1.2甲基紅試驗（methylred）

甲基紅指示劑變色范圍是PH4.4（紅色）~pH6.2（黃色），產氣腸桿菌分解葡萄糖產生丙酮

酸，但又很快將丙酮酸脫竣，轉化成醇等物質，則培養(yǎng)液的pH值仍在6.2以上，故此時加

入甲基紅指示劑，培養(yǎng)液呈黃色，此為陰性對照菌。陽性對照菌是大腸埃希氏菌，呈現(xiàn)紅色

為陽性。

5.1.3V-P試驗

伏-普試驗，目的是檢查細菌是否能分解葡萄糖，產生乙酰甲基甲醇。

陽性對照菌是產氣腸桿菌，分解葡萄糖（被檢細菌接種到葡萄糖蛋白陳水中，36℃18-24h）

產生丙酮酸，再將丙酮酸脫竣形成乙酰甲基甲醉，在堿性條件下（乙液-40%KOH溶液），被

氧化為二乙酰，與培養(yǎng)基蛋白豚中精氨酸等所含的胭基（甲液-6%a一蔡酚酒精溶液？）結合，

通常在lOmin內形成紅色化合物。

若不顯色，放置于50℃水浴2h,或放置于37℃培養(yǎng)箱中4h,充分搖動，觀察培養(yǎng)液反應

結果，不顯紅色為陰性，陰性對照菌是大腸埃希氏菌。

5.1.4ONPG試驗

鄰硝基酚-B-D-半乳糖甘的縮寫，利用該試劑可以檢查被檢細菌有無B-半乳糖甘酶和滲透酶,

發(fā)酵乳糖的細菌具有這兩種酶。

滲透酶將乳糖分子帶入菌細胞內，而半乳糖甘酶可將乳糖的B-半乳糖甘鏈切斷，產生葡

萄糖和半乳糖。

遲緩發(fā)酵乳糖的細菌，缺乏滲透酶，而ONPG滲入菌細胞內，被B-半乳糖甘酶分解產生鄰

位硝基苯酚，一般在20~30min內顯黃色，為陽性，對照菌為枸椽酸鹽桿菌和亞利桑那菌。

方法：將被檢細菌接種到1%的乳糖肉湯瓊脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)過夜。取菌苔接種于0.25ml

生理鹽水中做成懸液。加入1滴甲苯，并充分振搖，使酶釋放。在懸液中再加入ONPG液

0.25ml,混勻，置于37℃培養(yǎng)箱或水浴箱中，分別在20min和3h后觀察培養(yǎng)液反應結果

不出現(xiàn)黃色者為陰性，對照菌是沙門氏菌。

5.1.4氧化發(fā)酵試驗

測定糖類的氧化或發(fā)酵及糖類未被利用的代謝類型。

氧化型：細菌在分解葡萄糖過程中，必須有氧分子參加。無氧環(huán)境中不能分解葡萄糖。

發(fā)酵型：在分解葡萄糖的過程中，可以進行無氧降解。發(fā)酵型細菌無論在有氧或無氧的環(huán)境

中都能分解葡萄糖。

產堿型：不分解葡萄糖的細菌。

將待檢菌同時穿刺接種兩支HL培養(yǎng)基，其中一支培養(yǎng)基滴加無菌的液體石蠟油，高度不少

于1cm,37℃培養(yǎng)48h或更長，觀察反應結果。

培養(yǎng)基變黃色為產酸。

兩支培養(yǎng)基均產酸為發(fā)酵型細菌，僅不加石蠟的培養(yǎng)基產酸的是氧化型細菌，兩支培養(yǎng)基均

不變化的為產堿型細菌。

5.2蛋白質、氨基酸及含氮化物代謝試驗

5.2.1苯丙氨酸脫氨酶試驗

原理：某些細菌具有苯丙疑酸脫氨酶，可使苯丙氨酸脫氨形成苯丙酮酸，苯丙酮酸與三氯化

鐵發(fā)生螯合作用，形成綠色絡合物。

方法:將被檢細菌的斜面培養(yǎng)物（先增菌）大量移種到苯丙氨酸瓊脂斜面上,37℃培養(yǎng)18-24h,

再從斜面上滴加10%三氯化鐵溶液4-5滴，使其自斜面培養(yǎng)物上緩緩流下（?多慢，快了會

怎樣？），觀察結果。

結果：溶液出現(xiàn)綠色為陽性，對照菌是變形桿菌；不變色為陰性，對照菌是產氣腸桿菌。

5.2.2脫竣酶試驗

原理：某些細菌具有某種氨基酸的脫竣能，可使氨基酸脫去炭基產生胺和二氧化碳，胺使

pH值＞7,此時指示劑溪麝香草酚藍由綠色變?yōu)樗{色。

濱麝香草酚藍酸性顯黃色，堿性顯紫色。

方法：將被檢細菌接種到兩支脫竣酶培養(yǎng)基中，其中一支不加氨基酸，另一支加賴氨酸/精

氨酸/鳥氨酸，再在培養(yǎng)基上覆蓋一層滅菌的液體石蠟，37℃培養(yǎng)18-24h,觀察結果。

結果：兩管培養(yǎng)基均含有葡萄糖，產酸，浪麝香草酚藍山藍變黃。含有氨基酸的一管出現(xiàn)脫

竣基降解作用，產生堿性反應，浪麝香草酚藍再由黃變藍，為陽性。

鳥氨酸陰性對照菌為陰溝腸桿菌，顯黃色。

5.2.3靛基質（口引咪）試驗

原理：某些細菌能分解蛋白豚中的色氨酸，產生靛基質（寫I躲），靛基質與對二甲氨基苯甲

醛結合，形成玫瑰紅色化合物。

方法：將被檢細菌接種到胰蛋白陳水培養(yǎng)基中，37c培養(yǎng)24-48h后，滴加數(shù)滴試劑于培養(yǎng)

基液面，輕輕搖動（不可劇烈振動），觀察結果。

結果：出現(xiàn)紅色為陽性，對照菌是大腸埃希氏菌；出現(xiàn)黃色為陰性，對照菌是產氣腸桿菌。

5.2.4硫化氫試驗

原理：某些細菌能分解含硫的氨基酸（胱氨酸、半胱氨酸等），產生硫化氫，硫化氫與培養(yǎng)

基中的鉛鹽或鐵鹽反應，形成黑色沉淀硫化鉛或硫化鐵。

方法：將被檢細菌以接種針穿刺接種于醋酸鉛或雙糖鐵培養(yǎng)基（哪雙糖？-乳糖+葡萄糖）中，

37℃培養(yǎng)24h,觀察結果。

結果：有黑色出現(xiàn)為陽性。

說明：在硫化氫試驗的培養(yǎng)基加入硫代硫酸鈉的作用是還原作用，以保持培養(yǎng)基處于還原狀

態(tài)，是產生的硫化氫不被氧化。

產硫化氫較少的菌種可在試管口放置醋酸鉛試條。

5.2.5尿素酶試驗

原理：某些細菌具有尿素酶，在含有尿素的培養(yǎng)基中，分解尿素產生氨，使培養(yǎng)基呈堿性,

此時培養(yǎng)基中的酚紅指示劑顯紅色。

方法：將被檢細菌接種的尿素固體斜面培養(yǎng)基上，36℃培養(yǎng)4h檢查一次，再每天檢查詼，

培養(yǎng)5天，觀察結果。

結果：出現(xiàn)紅色為陽性，對照菌為變形桿菌；變色為陰性，對照菌是大腸埃希氏菌。

5.3枸椽酸鹽利用試驗

原理：

枸檬酸鹽培養(yǎng)基系一綜合性培養(yǎng)基，其中枸椽酸鈉為碳的唯一來源，磷酸二氫錢是氮的唯一

來源。

有的細菌能利用枸檬酸鈉為碳源，能在培養(yǎng)基上生長，并且能分解枸檬酸鹽，最后產生碳酸

鹽，使培養(yǎng)基變?yōu)閴A性。

培養(yǎng)基中的澳麝香草酚藍指示劑由綠色變?yōu)樯钏{色。

不能利用枸椽酸鹽為碳源的細菌在該培養(yǎng)基上不生長，培養(yǎng)基不變色。

方法：

將被檢細菌的菌懸液（啥是菌懸液？-挑取菌苔后，洗至生理鹽水中）接種到枸椽酸鹽培養(yǎng)

基上，37℃培養(yǎng)24h,觀察結果。

結果：

培養(yǎng)基上有菌生長，培養(yǎng)基變?yōu)樯钏{色為陽性，對照菌是產氣腸桿菌；若培養(yǎng)基不變色，則

繼續(xù)培養(yǎng)7天，培養(yǎng)基仍不變色者為陰性，對照菌為大腸桿菌。

5.4呼吸酶類試驗

5.4.1氧化醐試驗

原理：某些細菌具有氧化酶，能將二甲基對苯二胺或四甲基對苯二胺試劑氧化（先使細胞色

素C氧化，電子傳遞體）成紅色配類化合物。

方法：取白色潔凈濾紙蘸取待測菌落，加鹽酸二甲基對苯二胺溶液1滴；Ewing氏改進法,

再加a-蔡酚溶液1滴。

結果：陽性者立即出現(xiàn)粉紅色，并逐漸加深，變?yōu)榈仙?，再到深紫色，Ewing氏改進法陽

性于0.5min內呈現(xiàn)鮮藍色，對照菌為綠膿桿菌（銅綠假單細胞菌）；陰性者顏色無變化,Ewing

氏法陰性為2min內不變色，對照菌為大腸桿菌。

1%鹽酸二甲基對苯二胺溶液要避免接觸含鐵物質，防止出現(xiàn)假陽性反應。此試劑應少量新

鮮配制，于冰箱內避光保存，也可購置氧化酶試條。

該實驗用于分辨革蘭氏陰性桿菌中的腸桿菌科（陰性）與弧菌科（陽性）。

5.4.2觸酶活力試驗

原理：具有觸酶的細菌能催化過氧化酶，放出生態(tài)氧，繼而形成氧分子，出現(xiàn)氣泡。

方法：取3%過氧化氫0.5ml,滴加到不含血液的被檢細菌瓊脂培養(yǎng)物上，或滴加到不含血液

的肉湯培養(yǎng)物中，觀察結果。

結果：培養(yǎng)物出現(xiàn)氣泡者為陽性。

說明：過氧化氫濃度過高（30%）會產生氣泡出現(xiàn)假陽性；血液中含有觸能，容易出現(xiàn)假陽

性。

5.4.3硝酸鹽還原試驗

原理：某些細菌能將培養(yǎng)基中的硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，亞硝酸鹽與醋酸作用生成亞硝酸,

亞硝酸與試劑中的對氨基苯磺酸作用生成重氮苯磺酸，再與a-蔡胺結合，生成N-a一蔡胺偶

氮苯磺酸（紅色）。

方法：將被檢細菌接種于硝酸鹽培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)1~4天，每天吸取培養(yǎng)物2ml,加甲液

（對氨基苯磺酸0.8g,5mol/L醋酸100ml）和乙液（a-蔡胺0.5g,5mol/L醋酸100ml）各

數(shù)滴，同時以為接種細菌的培養(yǎng)基作對照，觀察結果。

結果：出現(xiàn)紅色為陽性。

說明：亞硝酸鹽在自然界分布很廣，容易污染試劑，硝酸鹽不純或保管不妥也可能含有亞硝

酸鹽，因此必須做空白對照；繁殖迅速而還原硝酸鹽能力強的細菌如果培養(yǎng)時間過久，可能

將亞硝酸鹽全部分解為氨和氮，出現(xiàn)假陰性反應，故需每天試驗，空白對照。

5.5毒性酶類試驗

5.5.1溶血試驗

原理：某些細菌在代謝過程中，產生溶血素，能使人或動物的紅細胞發(fā)生溶解。

方法：

1）平板法：將被檢細菌接種到血液瓊脂平板培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24h。

2）試管法：取被檢細菌16-18h肉湯培養(yǎng)物若干，加等量經生理鹽水洗滌三次的2%羊紅細

胞懸液，置于37℃水浴箱中，30min后觀察結果。

結果：

1）平板法：若菌落周圍出現(xiàn)透明的溶血環(huán)，為完全溶血（B溶血），菌落周圍出現(xiàn)綠色溶血

環(huán)，為不完全溶血（a溶血），無溶血環(huán)為不溶血（Y溶血）。

2）試管法：液體澄清透明為溶血，陽性。

5.5.2鏈激酶試驗

原理：A群鏈球菌在代謝過程中，產生鏈激酶，能激活血液中的纖維蛋白酶原為溶纖維蛋白

酶，促使纖維蛋白凝塊溶解。

方法：取血漿0.2ml,放入滅菌小試管中，加無菌生理鹽水0.8ml,再加被檢細菌18-24h肉

湯培養(yǎng)物0.5ml,充分混勻后，再加入0.25%氯化鈣水溶液0.25ml,置于37C水浴中，觀察

結果。

結果：lOmin內血漿先凝固，而后又開始溶解，溶解時間與鏈激能含量成正比。鏈激醐含量

多時:20min內凝固的血漿完全溶解。如無變化，應在水浴中持續(xù)2h、24h,分別觀察結果。

血漿凝塊完全溶解者為陽性，時間越短表明毒性越強。24h血凝塊仍不溶解者為陰性。

5.5.3血漿凝固酶試驗

原理：某些細菌能產生血漿凝固酶，分兩種，?種結合在細菌細胞壁上，遇到血漿直接作用

于血漿的纖維蛋白，使細菌凝成顆粒狀，使用玻片法；另種分泌到細菌細胞外，稱為游離

血漿凝固酶，能使血漿中的纖維蛋白原變?yōu)槔w維蛋白，使用試管法試驗。

方法：

1）玻片法：取生理鹽水2滴，分別滴于載玻片上，以接種環(huán)挑取被檢細菌菌落，放在2滴

生理鹽水中，研磨成濃菌懸液。在1滴懸液中加1滴未稀釋的血漿，另一滴加入1滴生理鹽

水作為對照，迅速搖動，觀察結果。

2）試管法：取3支小試管，每支加1:4稀釋的新鮮血漿0.5ml,其中1支加被檢細菌生理鹽

水懸液或肉湯培養(yǎng)物0.5ml,另??支加陽性菌株生理鹽水懸液或肉湯培養(yǎng)物0.5ml作陽性對

照，再一支加生理鹽水或肉湯培養(yǎng)液0.5ml作陰性對照。3支試管置于37℃水浴箱中，每隔

30min觀察一次結果。

結果：

1）玻片法：若在加血漿的1滴中迅速出現(xiàn)凝固顆粒，在加生理鹽水對照的1滴中未出現(xiàn)凝

固顆粒，為陽性；若超過2min才開始出現(xiàn)凝固顆粒者不作陽性（多為非致病性）。

2）試管法：6h內，若試驗管和陽性對照管出現(xiàn)凝固，陰性對照管不出現(xiàn)凝固，為陽性；多

數(shù)陽性細菌在0.5-lh內發(fā)生凝固。

5.6嗜鹽試驗

原理：在高于3%的氯化鈉培養(yǎng)基上不生長或生長不好，但能在無言培養(yǎng)基上生長的，稱為

非嗜鹽菌，如腸桿菌科。能在3%-6%氯化鈉培養(yǎng)基上生長，但在無鹽培養(yǎng)基上不生長，稱為

嗜鹽菌，如副溶血性弧菌。在無鹽和高鹽培養(yǎng)基上均能生長，但長得不茂盛，稱為耐鹽菌,

如葡萄球菌、銅綠假單細胞菌。

方法:取被檢細菌分別接種到1支無鹽葡萄糖蛋白陳水和一支5%-6%氯化鈉葡萄糖蛋白陳水

中，37℃培養(yǎng)6-24h,觀察生長情況。

結果：培養(yǎng)物出現(xiàn)渾濁生長為陽性。

6、菌種保存

6.1普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基保存法

將細菌的普通瓊脂斜面培養(yǎng)物放于4℃冰箱或室溫10-16℃冷暗處保存。

用這種方法只可保存數(shù)天，只作暫時保存用。

6.2半固體培養(yǎng)基穿刺保存法

用穿刺接種法將細菌培養(yǎng)物接種于半固體培養(yǎng)基內，37℃培養(yǎng)18-24h后，加一層厚度約為

1cm的無菌液體石蠟，置于室溫中保存。腸道桿菌及葡萄球菌等用這種方法一般可保存3-6

個月。傳代移種時，將半固體菌種管傾斜，使液體石蠟流至一邊，再取少量菌苔移種于新的

培養(yǎng)基（液體培養(yǎng)基復蘇能力比固體強）。將蘸有少量液體石蠟的接種環(huán)浸于95%酒精中片

刻，再燒灼滅菌，以免直接在酒精燈下燒灼時，液體石蠟四濺，引起污染。

6.3冷凍干燥保存法

即將要保存的微生物樣品先經過低溫預凍，然后在低溫狀態(tài)下進行減壓干燥（升華干燥）。

此法保存菌種時間長，如沙門氏菌等腸桿菌科菌種能保存20年之久。

沙門氏菌

本帖最后由渾身是血于2011-4-1811:32編輯

1、簡介：

通過人或動物的消化道傳播，

在各類食物中毒案例中排前兩位，

主要并發(fā)癥為腸胃炎、敗血癥，

常見的被污染食品為：

肉制品：美國約20%,日本約10.3%,英國約9.9%

蛋制品：3.9%~43.7%,取決于蛋殼污染程度

蔬菜：歐美生食較多

污染的原因：

生前帶菌交叉污染

帶菌者污染

患病者污染

水源污染

2、生物學特性：

腸桿菌科，沙門氏菌屬，6個亞屬l~VI,亞屬川稱為亞利桑那菌。

沙門氏菌為革蘭氏陰性菌，短桿菌，無芽抱，無莢膜，周生鞭毛，有動力（也有無動力的變

種），

需氧兼性厭氧，35℃~37℃為最適生長溫度，pH6.8~7.8為最適，

能在營養(yǎng)瓊脂上生長，菌落直徑2~3mm,圓形或卵形，無色半透明，液體培養(yǎng)基中混合均

勻生長。

不發(fā)酵乳糖、蔗糖，不液化明膠，不能分解蛋白質，也不產生靛基質，不分解尿素，有規(guī)律

的發(fā)酵葡萄糖并產生氣體。

與埃希氏菌屬的主要區(qū)別在硫化氫反應和乳糖反應。

對熱及外界環(huán)境抵抗力中等，60℃20-30min即被殺死，普通水中不易繁殖但可存活2~3周，

自然環(huán)境糞便中生存1~2月，干燥墊草中生存8~20周，冰箱中生存3-4月，-5℃存活10月；

對化學藥品抵抗力較弱，對氯霉素敏感，5%苯酚5min即可殺死，膽鹽、煌綠及孔雀綠抑制

作用大但對腸桿菌抑制作用弱，可用以制備選擇性培養(yǎng)基。

3、抗原構造和分類：

菌體抗原，記為O抗原，多糖-類脂-蛋白質復合物，加熱至100℃2.5h不能被破壞，也不能

被乙醇和0.1%石碳酸破壞，多糖決定O抗原特異性，用于分群。

鞭毛抗原，記為H抗原，蛋白質，不耐熱，60℃15min或乙醇處理后被破壞，沙門H抗原

有兩種，第一相特異相，第二相非特異相，用于分型。

表面抗原，要求掌握Vi抗原，糖脂，60℃30min或100℃5min即可破壞，可阻止O抗原與

0抗體的特異性凝集反應，但Vi抗原被破壞后O抗體仍可和相應的?？乖?。

4、變異性

4.1S-R初次分離菌株一般是光滑型，經長期人工傳代培養(yǎng)，菌體特意多糖抗原喪失，在鹽水

中自凝。

4.2H-0有鞭毛的細菌失去鞭毛的變異。

4.3位相變異雙相H抗原的沙門氏菌變成只有其中某一相H抗原的單相菌。

沙門氏菌血清學分型時，如遇到單相菌，特別是只有第二相時，需反復分離和誘導出第相

方可鑒定。

4.4V-W失去Vi抗原

5、檢驗原理

食品中沙門氏菌含量較少，且常由于食品加工過程使其受到損傷而處于瀕死狀態(tài)，所以對某

些加工食品（哪些不要？-一般生鮮蛋或肉類）必須經過前增菌處理，即無選擇性的培養(yǎng)基

使其恢復活力，再進行選擇性增菌，是沙門增殖，其他大多數(shù)細菌收到抑制。

利用沙門的生化特征，借助于三糖鐵、靛基質、尿素、KCN、賴氨酸等試驗可與腸道其他菌

屬相鑒別。

通過菌種特殊的抗原結構（O抗原為主），可以把他們分辨出來。

復活（前增菌）一培養(yǎng)（選擇性增菌）一分離（平板劃線分離培養(yǎng)）一鑒定（生化鑒定/血

清鑒定）

6、操作步驟

6.1前增菌

25g（ml）檢樣放入225ml緩沖蛋白陳水BPW（BufferedPeptoneWater）均質（上課時強調

了拍打式均質器的優(yōu)越性），36c±1℃培養(yǎng)8~18h（時間按照什么來定？-一般?天不到18

小時）。

酸性或堿性樣品需用lmol/ml無菌氫氧化鈉或鹽酸調節(jié)pH至6.8+0.2,用試紙測量。

6.2增菌

搖動增菌培養(yǎng)物，移1ml轉種于10ml四硫磺酸鈉煌綠TTB增菌液中,42℃±培養(yǎng)18~24h。

適合除傷寒副傷寒沙門氏菌培養(yǎng)。淺黃色。

同時，移1ml轉種于10ml亞硒酸鹽胱氨酸SC增菌液中，36℃±1℃培養(yǎng)18~24h。適合傷寒

副傷寒沙門氏菌培養(yǎng)。

亞硒酸氫鈉對革蘭氏陰性菌G-有毒，磷酸鹽中和毒性，促沙抑大，亞硒酸鹽還原時.，pH±

升，乳糖分解產酸，磷酸鹽緩沖，維持培養(yǎng)基中性。煮沸，流動蒸汽滅菌，不能高壓滅菌。

淺棕色？待查。

6.3分離

6.3.1亞硫酸鈕（BS）瓊脂平板：強選擇性，強烈抑制大腸類，略抑制沙門，需延長培養(yǎng)時

間，無乳糖指示系統(tǒng)，有硫化氫指示系統(tǒng)。還原亞硫酸銹為硫化鈍，產物為黑色或褐色，亞

屬川有金屬光澤。滅菌方式為煮沸3次。本身為綠色。

用接種環(huán)取增菌液1環(huán)，劃線接種，36℃±1℃培養(yǎng)40~48h。

典型菌落為黑色或褐色，亞利桑那菌為黑色有金屬光澤。

6.3.2三種平板任選其一，用接種環(huán)取增菌液1環(huán)，劃線接種，36℃±1℃培養(yǎng)18~24h。

木糖賴氨酸脫氧膽鹽XLD：分解乳糖粉紅色？待確認。產生硫化氫，黑色中心周邊無色。

HE瓊脂：分解乳糖為黃色，不分解乳糖為藍綠色或藍色。

科瑪嘉沙門氏菌顯色平板：沙門氏為紫紅色，埃希氏菌為藍色。

6.4生化試驗及初步血清學鑒定

6.4.1初步鑒定

平板上挑取2~5個典型或可疑菌落，分別接種三糖鐵TSI（表面劃s,內部穿刺）和賴氨酸

脫竣酶（和營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基？偶上課的時候沒聽到--b-營養(yǎng)瓊脂要同時做），36℃±1℃培養(yǎng)

18~24h,必要時延長到48小時（按照什么延長？）。

三糖鐵陰性為絳紅色，陽性為黃色，

大腸發(fā)酵乳糖，令三糖鐵斜面和底層變?yōu)辄S色。

大腸？具有某種氨基酸的脫竣酶，可使氨基酸脫去竣基產生氮和二氧化碳，氨使pH>7,此

時指示劑浪麝香草酚藍顯藍色（偏紫色），酸性為黃色。

因此可排除三糖鐵瓊脂內斜面產酸（陽性）、底層產酸（陽性）、賴氨酸脫竣酶試驗陰性（藍

色？）的菌株。

其他反應結果均有沙門氏菌屬的可能，也均有不是的可能。

三糖鐵反映結果中+（-）和+/-的表達意義有什么區(qū)別？-+（-）表示有可能陽性也有可能陰性,+/-

為大多數(shù)陽性小部分陰性

6.4.2生化試驗

初步鑒定的同一批菌落，接種尿素瓊脂PH7.2和胰蛋白豚水（靛基質）、氟化鉀培養(yǎng)基，36℃

±1℃培養(yǎng)18~24h,必要時延長到48小時。

靛基質試驗（口引跺）：

埃希氏菌能分解蛋白陳中的色氨酸，產生的靛基質與對二甲氨基苯甲醛結合，形成紅色化合

物。

將被檢細菌接種到胰蛋白陳水培養(yǎng)基中，培養(yǎng)后滴加數(shù)滴試劑（啥試劑？）于培養(yǎng)基液面，

輕輕搖動，觀察結果。

出現(xiàn)紅色為陽性，出現(xiàn)黃色為陰性。陽性對照是埃希氏菌，陰性對照是產氣腸桿菌。

尿素酶試驗：

某些細菌具有尿素酶，如變形桿菌，在含有尿素的培養(yǎng)基中，能分解尿素，產生氨，使培養(yǎng)

基呈堿性，此時培養(yǎng)基中酚紅指示劑顯糾色。

把被檢細菌接種到尿素固體斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)4h檢查一次，再每天檢查??次，培養(yǎng)5天，

觀察結果。

出現(xiàn)紅色為陽性，陽性對照菌是變形桿菌，陰性對照菌是大腸埃希氏菌。

氟化鉀試驗：沒說，偶確定沒說。。。

反應序號A1：硫化氫陽性，靛基質陰性，尿素瓊脂陰性，氟化鉀陰性，賴氨酸脫竣酶陽性

為典型反應，判定為沙門氏菌屬。尿素、氟化鉀、賴氨酸脫竣基三項中有兩項異常，為非沙

門氏菌。

反應序號A2：硫化氫陽性，靛基質陽性，尿素瓊脂陰性，氟化鉀陰性，賴氨酸脫竣酶陽性，

需補做甘露醉和山梨酥試驗。沙門氏菌靛基質陽性變體兩項都是陽性，但需要結合血清學鑒

定結果進行判定。

方法不知道。

反應序號A3：硫化氫陰性，靛基質陰性，尿素瓊脂陰性，氟化鉀陰性，賴城酸脫竣酶多數(shù)

陽性，少數(shù)陰性，補做ONPG,陰性為沙門氏菌，賴氨酸脫竣醐基本陽性，只有甲型副傷寒

沙門陰性。

ONPG即O-nitrophenyl-B-D-galactopyranside鄰硝基酚-B-D-半乳糖甘。發(fā)酵乳糖的細菌有兩

類酶，滲透酶和B-半乳糖甘酶，滲透酶將乳糖分子帶入菌細胞內，B-半乳糖甘酶可將乳糖

的B-半乳糖甘鏈切斷，產生葡萄糖和半乳糖。遲緩發(fā)酵乳糖的細菌缺乏滲透酶，ONPG滲入

細胞內，被B-半乳糖甘酶分解產生鄰位硝基苯酚，顯黃色。將被檢細菌接種到1%的乳糖肉

湯瓊脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)過夜，取菌苔接種于0.25ml生理鹽水中做成懸液，加入1滴甲

苯，并充分震搖，使酶釋放。在懸液中再加入ONPG液0.25ml,混勻，置于37℃培養(yǎng)箱或

水浴箱中，分別在20min和3h后觀察培養(yǎng)液反映結果。呈黃色為陽性，一般在20~30min

即顯黃色，不出現(xiàn)黃色為陰性。陽性對照菌為枸緣酸鹽桿菌、亞利桑那菌，陰性對照菌是沙

門氏菌。

6.4.3自動鑒定方法

根據初步鑒定結果，從營養(yǎng)瓊脂平板上挑取可疑菌落，用生理鹽水制備成濃度適當?shù)木鷳乙?/p>

（多少濃度適當？），使用API20E生化鑒定試劑盒或VITEK全自動微生物鑒定系統(tǒng)進行鑒定。

6.5A-F多價診斷血清凝集試驗

當圖片染色和生化反應都疑為沙門氏時，應用沙門氏屬A-F群多價0診斷血清進行凝集試驗，

同時用生理鹽水作對照。

6.5.1抗原準備

1.2%~1.5%瓊脂培養(yǎng)物作為玻片凝集試驗的抗原。

0血清不凝集時，將菌株接種在2%~3%瓊脂培養(yǎng)基上再檢查，挑取菌苔于1ml生理鹽水中

做成濃菌液，酒精燈火焰上煮沸后在檢查。檢查是否Vi抗原作用。

H抗原發(fā)育不良時，將菌株接種在0.55%~0.65%半固體瓊脂平板中央，菌落蔓延生長時，在

其邊緣部分取菌檢查，或將菌株通過裝有0.3%~0.4%半固體瓊脂的小玻管1~2次，自遠端取

菌培養(yǎng)后在檢查。（如何通過小玻管？-穿刺）

6.5.2多價菌體抗原。鑒定

在玻片上劃出兩個約lcmX2cm區(qū)域，挑取1環(huán)待測菌，各放（需確定標準動作）1/2環(huán)于

玻片上的每一個區(qū)域上部，在其中一個區(qū)域下部加入一滴生理鹽水，作為對照。再用無菌接

種環(huán)或針分別將兩個區(qū)域菌落研成乳狀液。將玻片傾斜，搖動混合1分鐘，并對著黑暗背景

觀察，任何程度的凝集現(xiàn)象皆為陽性反應。

6.5.3多價鞭毛抗原H鑒定

與菌體抗原類同。

7、檢查結果

綜合生化試驗和A-F多價診斷血清凝集結果，報告：25g（ml）樣品檢出或未檢出沙門氏菌，

必要時將菌株送至專業(yè)檢驗檢疫部門進一步血清學鑒定。

志賀氏菌

本帖最后由渾身是血于2010-12-1317:39編輯

1、生物學特性

革蘭氏陰性短桿菌，長2~3um,寬0.5~0.7um,無芽泡，無莢膜，無鞭毛，不運動，鞭毛

是與沙門氏菌的顯著不同點。

兼性厭氧，營養(yǎng)要求不高，營養(yǎng)瓊脂上生長良好，培養(yǎng)18~24h,圓形菌落，微凸，光滑，

濕潤，無色半透明，邊緣整齊，直徑約2mm（宋內氏扁平粗糙）。最適溫度37℃,最適pH

值7.2~7.4,肉湯培養(yǎng)基中均勻渾濁生長，不形成沉淀。

不發(fā)酵乳糖（宋內氏遲緩發(fā)酵），發(fā)酵葡萄糖一般不產氣（福氏6型微量產氣），不產生硫化

氫。

主要鑒別特征為不運動，對各種糖的利用力較差，并且在含糖培養(yǎng)基內不形成氣體。

1.1抗原構造與分型

0抗原和K抗原，無H抗原。?？乖欠诸愐罁腥禾禺愋院托吞禺愋詢煞N。根據生化反

應和0抗原不同，將志賀氏菌分為4個血清群和40+血清型。?？乖?00℃60min不受破壞。

K抗原能阻斷0抗原與相應抗血清的凝集作用。加熱至100℃保持60min可消除K抗原的阻

礙作用。

1.2抵抗力

對理化因素抵抗力弱，外界環(huán)境中宋氏最強，福氏次之，痢疾最弱。潮濕土壤中存活34天，

37℃水中20天，冰中3個月，20℃糞便11天，日光直射30min可殺死，56~60℃19min即

可殺死，1%酒碳酸中浸泡15-30min可殺死，高濃度膽汁可抑制生長，對磺胺、鏈霉素、氯

霉素敏感，但易產生耐藥性。

2、實驗原理

樣品在GN增菌液中增菌6~8h后，HE或SS及麥康凱或EMB選擇性平板進行分離，三糖鐵

初步生化試驗，半固體培養(yǎng)基動力試驗，如三糖鐵上：斜面陰性，底層陽性，不產氣，硫化

氫陰性，無動力，可疑為志賀氏菌。

3、操作步驟

3.1增菌

25g檢樣加入裝有225mlGN增菌液的500ml廣口瓶內（必要性確認），打碎研碎乳化，于

36℃培養(yǎng)6~8h,當培養(yǎng)液出現(xiàn)輕微渾濁時終止培養(yǎng)。

志賀氏菌在常溫存活期較短，24h內檢驗，保存在冰箱，更長時間應放低溫冰箱。GN抑菌

效果差，時間過長易使雜菌繁殖。

3.2分離培養(yǎng)

取增菌液1環(huán)，HE或SS平板，麥康凱或EMB平板，各劃一個平板，36℃±1℃培養(yǎng)18~24h,

志賀氏菌在這些培養(yǎng)基上生成無色透明不發(fā)酵乳糖的較小菌落。

3.3初步生化試驗

挑取平板上可疑菌落，接種三糖鐵瓊脂和葡萄糖半固體各一管。2~5個菌落。36℃±1℃培

養(yǎng)18~24h,分別觀察結果。

棄去：

三糖鐵瓊脂斜面上蔓延生長的培養(yǎng)物；

18~24h內發(fā)酵乳糖、蔗糖的培養(yǎng)物；

不分解葡萄糖和只生長在半固體表面的培養(yǎng)物；

產氣的培養(yǎng)物；

有動力的培養(yǎng)物；（怎么算有動力？這我沒聽到-出現(xiàn)放射性生長為有動力）

產生硫化氫的培養(yǎng)物。

其他的做血清學分型和進一步生化試驗。

3.4血清學分型

挑取三糖鐵培養(yǎng)物，做玻片凝集試驗。

4種志賀氏菌多價血清檢查，不凝集一煮沸后再檢查；凝集一用Al、A2、B群多價、D群血

清分別試驗。（?）

B群福氏一群和型因子血清分別檢查。（??）

福氏先用群因子血清檢查，再根據群因子血清出現(xiàn)凝集的結果，依次選用型因子血清檢查。

（???）

4種多價血清不凝集的菌株，用鮑氏多價1,2,3,分別檢查，并進一步用1~15各型因子血清檢

查。

鮑氏不凝集，用痢疾志賀氏菌3-12型多價血清及各型因子血清檢查。

3.5進一步生化試驗

血清學分型的同時，做葡糖糖鏤、西蒙氏檸檬酸鹽和賴氨酸、鳥樹酸脫竣酶、PH7.2尿素、

氟化鉀生長，水楊甘和七葉背的分解。

志賀氏菌的培養(yǎng)物均為陰性結果（宋內氏、鮑氏13型鳥氨酸陽性），氧化酶陰性，革蘭氏陰

性。

已判定為志賀氏菌屬的培養(yǎng)物，進一步做50g/L乳糖、甘露糖、棉籽糖、甘油發(fā)酵、靛基質

試驗。

金黃色葡萄球菌

本帖最后由渾身是血于2010-12-1415:03編輯

葡萄球菌的菌落顏色?般分為三種：金黃色、白色、檸檬色。

《伯杰氏鑒定細菌學手冊》（第8版）按照生理化學組成將其分為：金黃色葡萄球菌、表皮

葡萄球菌、腐生葡萄球菌。

腐生一般為非致病菌，表皮偶爾致病，金葡是引起人類疾病的主要葡萄球菌。

金葡菌除了可引起皮膚組織炎癥外，還可以產生腸毒素，

腸毒素是一種外毒素，有耐熱性，加熱至100℃30min不被破壞，要使其完全破壞需煮沸2h。

引起人類食物中毒，毒素型食物中毒（還有其他哪些類別的食物中毒？）。

金葡菌對人的健康是一種潛在危險，所以檢查食品中的金黃色葡萄球菌及數(shù)量具有重要的實

際意義。

1、生物學特性

球形，直徑為0.4~1.2um,致病性葡萄球菌般較非致病性菌小，且各個菌體大小及排列

也較整齊。

多個平面不規(guī)則分裂，堆積成為葡萄串裝排列，

液體培養(yǎng)基中生長，常呈雙球或短鏈裝排列。

無鞭毛無芽抱，一般不形成莢膜，易被堿性染料著色，革蘭氏陽性，

衰老、死亡、或被白細胞吞噬后轉為革蘭氏陰性G-,對青霉素有抗藥性的菌株也為G-。

營養(yǎng)要求不高，普通培養(yǎng)基上生長良好，

需氧兼性厭氧，最適生長溫度37℃,最適pH值7.4。

耐鹽性強，10~15%氯化鈉培養(yǎng)基中能生長，

20~30%的二氧化碳環(huán)境中培養(yǎng)，可產生大量毒素。

肉湯培養(yǎng)基中生長迅速，37℃培養(yǎng)24h,呈均勻渾濁生長，延長培養(yǎng)時間，管底出現(xiàn)少量沉

淀，搖動時易消散。

營養(yǎng)瓊脂上培養(yǎng)24~48h后，形成的菌落圓形凸起，邊緣整齊，表面光滑濕潤有光澤，不透

明，菌落直徑2mm,也有部分4~5mm,

可產生脂溶性色素，不溶于水，故只限于培養(yǎng)物，不外滲至培養(yǎng)基中。

22c或含糖類、牛乳及血清的培養(yǎng)基中色素形成最好。

在血瓊脂平板上形成的菌落較大，多數(shù)致病性菌株可產生溶血毒素，使菌落周圍產生透明溶

血圈（B溶血）。

觸媒反應（需具體了解）陽性，厭氧條件下能分解甘露醇，甲基紅試驗陽性。

葡萄球菌抵抗力較強，是不形成芽抱的細菌中的最強者，

干燥膿汁或血液中可存活數(shù)月，

80℃30min才能殺死，煮沸可迅速殺死,5%石碳酸lg/L汞（紫藥水兒?）中10~15min死亡。

對某些染料較敏感，1：100000~1：200000稀釋的龍膽紫溶液能抑制其生長。

對磺胺類藥物敏感較低。

對青霉素、紅霉素、慶大霉素高度敏感，很多菌株對青霉素有耐藥性。

△葡萄球菌的致病力取決于細菌產生的毒素和酶的能力，主要有：

1）溶血毒素

多數(shù)致病菌能產生，根據其對動物細胞的溶血范圍、抗原性、溶血時所需溫度的不同，可

分為a、B、Y、6四種。

以a溶血素為主（先前說多數(shù)致病菌產生透明溶血圈B溶血，有何關聯(lián)？）。

2）殺白細胞素

可溶性物質，有抗原性，能破壞白細胞和巨噬細胞。

致病和非致病性葡萄球菌均能被吞噬細胞吞噬，致病性葡萄球菌產生殺白細胞素，不僅不

被破壞，反能在吞噬細胞內生長繁殖。

3）腸毒素

能引起人、貓、猴的急性腸胃炎，分6型，具有不同的血清學特性，A型引起的食物中毒

最多，B型、C型次之。

是一種可溶性蛋白質，耐熱，100C30min不被破壞，不受胰蛋白酶影響。

4）血漿凝固酶

令含有枸緣酸鈉或肝素抗凝劑的兔血漿或人血漿發(fā)生凝固的酶。

大多數(shù)致病性產生，非致病性一般不產生。因此血漿凝固酶是鑒別葡萄球菌有無致病性的

重要指標。

較耐熱，100°C30min或高壓消毒后仍保存部分活性，但易被蛋白分解酶破壞。

5）溶纖維蛋白酶

一種激酶（百度說“一般指從一個三磷酸核甘轉移磷酸基至受體分子的酶，受體分子通過

這個磷酸基的轉移獲得能量而被激活（變得更不穩(wěn)定），所以很多的激酶需要從NTP轉移磷

酸基”），可激活血漿蛋白原為血漿蛋白酶，是人、犬、豚鼠、家兔餓已經凝固的纖維蛋白溶

解。

初次培養(yǎng)后，聚落周圍若出現(xiàn)一個不透明圈，表示產生凝固酶，繼續(xù)培養(yǎng)，不透明圈消失，

這是溶纖維蛋白酶作用的結果。

6）透明質酸酶

透明質酸有高度黏稠性，是機體結締組織中基質的主要成分。

透明質酸酶水解透明質酸后，結締組織細胞間失去黏性，呈疏松狀態(tài)，有利于細菌和毒素

在機體內擴散，因此又稱擴散因子。

7）脫氧核糖核酸酶

組織細胞及白血球崩解時，釋放出核酸，能增加組織滲出物的黏性，而該的能迅速分解之，

有利于細菌在組織中的擴散。

脫氧核糖核酸酚是鑒定葡萄球菌毒力的又?指標。

2、檢驗原理

金葡耐鹽性強適宜生長鹽濃度為5%~7.5%,10%~15%能生長,可利用其選擇增菌,抑制雜菌。

金葡可產生溶血素，血平板上生長菌落周圍有溶血環(huán)。

可產生卵磷脂酶，分解卵磷脂，產生甘油酯和可溶性磷酸膽鹽，所以在BP平板上生長菌落

為黑色，周圍有渾濁帶，外層有一透明圈。

金葡菌可產生血漿凝固酶，可令血漿中的血漿蛋白酶原（酶原還是原？）變成血漿蛋白酶,

使血漿凝固，這是鑒定致病性金葡的重要指標。

3、操作步驟（今年考2008版，10版只要求了解）

3.1取25g/ml樣品加入225ml磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質杯內，8000~10000r/min

均質lmin-2min（或用拍打器）,制成1:10樣品勻液。

3.2取5ml勻液，接種于50ml7.5%氯化鈉肉湯（呈渾濁生長）或10%氯化鈉胰酪陳大豆肉

湯培養(yǎng)基（有時液體澄清，菌量多時渾濁生長）內，36℃±1℃培養(yǎng)18~24h。

3.3取一環(huán)分別接種baird-parker平板（36℃±1℃培養(yǎng)18~24h）和血平板（36℃±1℃培養(yǎng)

18~24h或45~48h）。

3.4取可疑菌落做涂片染色、觀察溶血、血漿凝固酶試驗

3.4.1BP瓊脂上菌落直徑為2~3mm,顏色呈灰色到黑色，邊緣淡色，周圍為一渾濁帶，外層

有一透明圈。血平板上菌落較大，圓形、光滑凸起、濕潤、白色或金黃色，周圍有完全透明

溶血圈。革蘭氏陽性球菌，排列成葡萄球狀，無芽抱、無莢膜，直