無菌檢查操作規(guī)程

無菌檢查操作規(guī)程

1.目的

建立無菌檢查原則操作規(guī)程，保證檢查成果精確、可靠。

2.使用范圍

我司無菌產(chǎn)品的無菌檢查

3.職責

質量部QC

4.根據(jù)

2023版《中國藥典》通則1101

GB/T19973.2-2023（ISO11737-2:1998）

《療器械的滅菌微生物學措施第2部分：確認滅菌過程的無菌試驗》

GB/T14233.2-2023

《醫(yī)用輸液、輸血、注射器具檢查措施第2部分：生物學試驗措施》

5.內容

5.1.無菌檢查環(huán)境保障

5.1.1.無菌檢查甲、J所有操作均需在嚴格控制微生物污染的環(huán)境下進行，即無菌檢

查應在環(huán)境潔凈度10000級下H勺局部潔凈度100級的單向流空氣區(qū)域內或

隔離系統(tǒng)中進行。

5.1.2.操作環(huán)境的無菌保障程度將直接影響無菌檢查成果，為了保證無菌檢查用

潔凈室（區(qū)）環(huán)境的穩(wěn)定性，保證檢查成果的可靠性，對潔凈室（區(qū)）的

環(huán)境定期監(jiān)測并采用合理H勺措施保證潔凈環(huán)境符合規(guī)定。

5.1.3.無菌檢查全過程必須嚴格遵守無菌操作，防止微生物污染。

5.1.4.潔凈區(qū)的溫度、濕度等參數(shù)必須符合對應潔凈級別的規(guī)定。

5.1.5.無菌檢杳操作還需要對檢查環(huán)境進行監(jiān)控，

5.2.培養(yǎng)基、稀釋液、緩沖液

5.2.1.硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基，市售培養(yǎng)基干粉。除另有規(guī)定，接種后應置

3()~35c培養(yǎng)。

5.2.2.胰酪大豆陳液體培養(yǎng)基，市售培養(yǎng)基干粉。接種后應置20~35℃培養(yǎng)。

5.2.3.中和或滅活用培養(yǎng)基，按上述硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基或胰酪大豆陳液體培

養(yǎng)基的處方及制法，在培養(yǎng)基火菌或使用前加入合適H勺中和劑、滅活劑或

表面活性劑，其用量同措施合用性試驗。

524.胰酪大豆陳瓊脂培養(yǎng)基，市售培養(yǎng)基干粉。

525.沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基，市售培養(yǎng)基干粉。

5.2.6.沙式葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，市售培養(yǎng)基干粉。

5.2.7.PH7.0氯化鈉蛋白陳緩沖液，市售培養(yǎng)基干粉。

5.2.8.0.9%無菌氯化鈉溶液。

5.2.9.培養(yǎng)基使用性檢查

無菌檢查川口勺硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和胰酪大豆陳液體培養(yǎng)基等應符培

養(yǎng)基的無菌性檢查及敏捷度檢查的規(guī)定。本檢查可在供我品H勺無菌檢查或與供試

品的無菌檢查同步進行。

5.2.9.1.無菌性檢查：每批培養(yǎng)基隨機取5支(瓶)，按各培養(yǎng)基規(guī)定的溫度下

培養(yǎng)14天，應無菌生長。

5.2.9.2,敏捷度檢查

529.2.1.菌種：培養(yǎng)基敏速度檢查所用的菌株傳代數(shù)不得超過5代(從菌種存中

心獲得的干菌種第0代)，并采用合適的菌種保藏技術進行保留，以

證試驗菌株的生物學特性。

金黃色葡萄球菌［CMCC(B)26003］

銅綠假單胞菌［CMCC(B)10104］

枯草芽抱桿菌［CMCC(B)63501］

生泡梭菌［CMCC(B)64941］

白色念珠菌［CMCC(F)98001］

黑曲霉［CMCC(F)98003J

52922.菌液制備：接種金色葡萄球菌、銅綠假胞菌、枯草芽抱桿菌的培養(yǎng)物

至胰酪大豆陳液體培養(yǎng)基中或胰酪大豆膿瓊脂培養(yǎng)基上，接種生泡梭

菌的培養(yǎng)物至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，30s35tle培養(yǎng)18s24小時；

接種白色念珠菌日勺培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中或沙氏葡萄糖瓊

脂培養(yǎng)基上，20625c培養(yǎng)24s48小時，上述培養(yǎng)后H勺新鮮培養(yǎng)物用

PH7.0無菌化鈉-蛋白陳緩沖液或().9%無菌化鈉溶液制成每1ml菌數(shù)不

不小于lOOefu(菌落形成)H勺菌懸液。接種黑曲霉H勺培養(yǎng)物至沙氏葡萄

糖瓊脂面培養(yǎng)基上，20?25c培養(yǎng)5?7天，加人3?5ml0.05%(ml/ml)

聚山梨酯80H勺pH7.0無菌化鈉-蛋白陳緩沖液或0.9%無菌氯化鈉溶液,

將抱子洗脫。然后，采用合適的措施吸出抱子懸液至無菌試管內，用

0.05%(ml/ml)聚山梨醋80的pH7.0無菌化鈉-蛋臼陳緩沖液或0.9%無

菌氯化鈉溶液制成每1ml抱了數(shù)量不不小于lOOcfuH勺抱「懸液。菌懸

液若在室溫下放置，應在2小時內使用；若保留在2?在24h內使

用。黑曲霉抱子懸液存在2s8℃,在驗證過的貯存期內用。

529.2.3.培養(yǎng)基接種：取每管裝量為12ml日勺硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基7支，分別

接種不不小于ICOcfuH勺色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、生抱梭菌各2支,

另I支不接種作為空白對照，培養(yǎng)3天；取每管裝量為9ml口勺胰酪大

豆麻液體培養(yǎng)基7支，分別接種不不小于lOOcfuH勺草芽胞桿菌、白色

念珠菌、黑曲霉各2支，另1支不接種作為空白對照，培養(yǎng)5天。逐

日觀測結。

52924.成果鑒定：空白管應無菌生長，加菌II勺管生長良好，闡明該培養(yǎng)基敏

捷度符合規(guī)定。

5.3.措施試用性試驗

進行產(chǎn)品無菌檢查時，應進行措施合用性試驗，以確認所采用日勺措施適

合于產(chǎn)品的無菌檢查。若檢查程序或產(chǎn)品發(fā)生化也許影響檢查成果時，應重

新進行措施合用性試驗。措施合用性試驗按“5.4供試品的無菌檢查”的規(guī)

定及下列規(guī)定進行操作。對每一試驗菌應逐一進行措施。

5.3.1.菌種及菌液的制備：大腸埃希菌［CMCC(B)44102］外，金黃色葡萄球菌、

枯草芽抱桿菌、生泡梭菌、白色念珠菌、黑曲毒的菌株及菌液制同“培養(yǎng)

基敏捷度檢查”。大腸埃希菌口勺菌液制同金黃色葡萄球菌。

5.3.2.薄膜過濾法：每種培養(yǎng)基規(guī)定接種H勺供試品總量按薄膜過濾法過濾，沖洗,

在最終一次的沖洗液中加入不不小于lOOcfu試臉菌，過濾。加硫乙酸

鹽流體培養(yǎng)基或胰酪大豆陳液體培養(yǎng)基至濾筒內。另取一裝有同體積培養(yǎng)

基的容器，加入等量試驗菌，作為對照。置規(guī)定溫度下培養(yǎng)，培養(yǎng)時間不

得超過5天，各試驗菌同法作。

5.3.3.直接接種法：取符直接接種法培養(yǎng)基用量規(guī)定日勺硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基6

管，分別接入不不小于lOOcfu的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、生抱梭

菌各2管,取符直接接種法培養(yǎng)基用量規(guī)定的胰酪大豆月東液體培養(yǎng)基6管,

分別接入不不小于lOOcfu口勺枯草芽泡桿菌、白色念珠菌、黑曲霉各2管。

其中1管接入每支培養(yǎng)基規(guī)定的供試品接種量，另1管作對照，置規(guī)定的

溫度培養(yǎng)，培養(yǎng)時間不得超過5天。

534.成果判斷：與對照管比較，如供試品各容器中的試驗菌均生長良好，則闡

明供試品的檢查量在檢查條件下無抑菌作用或其抑菌作用可以忽視不計，

照此檢查措施和檢查條件進行供試品的J無菌檢查。如供試品日勺任一容器中

的試驗菌生長微弱、緩慢或不生長，則闡明供試品H勺檢查量在檢查條件下

有抑菌作用，應采用增長沖洗量、增長培養(yǎng)基的I用量、用中和劑或滅活劑、

更換濾膜品種等措施，消除供試品的抑菌作用，并重新進行措施合用性試

驗。

措施合用性試驗與供試品的無菌檢杳同步進行。

5.4.供試品無菌檢查

無菌檢杳法括薄膜過濾法和直接接種法。只要供試品性質容許，應采用

薄膜過濾法。供試品無菌檢查所采用的檢杳措施和檢查條件應與措施合用性

試驗確認的措施相似。

無菌試驗過程中，若需用面活性劑、滅活劑、中和劑等試劑，應證明其

有效性，且對微生物無毒性。

5.4.1.檢杳數(shù)量：除另有規(guī)定外，按表1規(guī)定。

5.4.2.檢查量：即接種量，除另有規(guī)定外，按表2規(guī)定。

5.4.3.陽性對照：應根據(jù)供試品特性選擇陽性對照菌：無抑菌作用及抗革蘭氏陽

性菌為主的供試品，以金色葡萄球菌為對照菌；抗革蘭氏陰性菌為主的供

試品，以大腸埃希南為對照菌；抗厭氧菌的供試品，以生胞梭菌為對照菌；

抗真菌的供試品，以白色珠菌為對照菌。陽性對照試驗的菌液制同“529.2

培養(yǎng)基敏捷度檢查”，加菌量不不小于lOOcfu,供試品用量同供試品無菌

檢杳時每份培養(yǎng)基接種H勺樣品量。陽性對照管培養(yǎng)72小時內應生長良好。

5.44陰性對照：供試品無菌檢查時，應取對應溶劑和稀釋液、沖洗液同法操作，

作為陰性對照。陰性對照不得有菌生長。

5.45供試品的處理及接種培養(yǎng)基

操作時，用合適的消毒液對供試品容器面進行徹消毒，如供試品容器內

有一定的真空度，可用合適的無菌器材（如帶有除菌過濾的針頭向容器內導

入無菌空氣，再按無菌操作啟開容器取出內物。

5.4.5.1.薄膜過濾法：薄膜過濾法一般應采用封閉式薄膜過濾。無菌檢查用的濾

膜孔徑應不不小于0.45um,直徑約50mm。根據(jù)供試品及其溶劑R勺特性

選擇濾膜材質。使用時，應保證濾膜在過濾前后H勺完整性。

5.4.5.1.1.水溶性供試品：水溶性供試液過濾前應先將少許的沖洗液過濾，以潤

濕濾膜。取規(guī)定量，直接過濾，或混至含不少于100ml合適的稀釋液

時無菌容器中，混勻，立即過濾。如供試品有抑菌作用，須用沖洗液

沖洗濾膜，沖洗數(shù)一般不少于3次(每濾膜每次沖洗量一般為100ml,

且沖洗量不得超過l()()()ml,以防止濾膜上的微生物受損傷)，所用的

沖洗量、沖洗措施同措施合用性試驗中確定向。除生物制品外，一般

樣品沖洗后，1份濾器中加人100ml硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基，1份濾器

中加入100ml胰酪大豆膝液體培養(yǎng)基。

5.4.5.1.2.非水溶性供試品：取規(guī)定量，直接過濾；或混合溶于適量含聚山梨酯

80或其他合適乳化劑的稀釋液中，充足混合，立即過濾。用含(11%-

1%聚山梨酯80的沖洗液沖洗濾膜至少3次。加入含或不含聚山梨酯

80日勺培養(yǎng)基。接種培養(yǎng)基照水溶液供試品項下日勺措施作。

5.451.3.具有導管的醫(yī)療器具(輸血、輸液袋等)供試品：取規(guī)定量，每個最

小裝用50-100ml沖洗液分別沖洗內壁，搜集沖洗液于無菌容器中，

然后照水溶液供試品項下措施作。同步應采用直接接種法進行裝中所

配帶的針頭、針管的無菌檢查。

5.452.直接接種法：直接接種法合用于無法用薄膜過濾法進行無菌檢查的供試

品，即取規(guī)定量供試品分別等量接種至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和胰酪大

豆陳液體培養(yǎng)基中。除牛?物制品外，一般樣品無菌檢查時兩種培養(yǎng)基接

種H勺瓶或支數(shù)相似。除另有規(guī)定外，每個容器中培養(yǎng)基的用量不得不小

于接種到該容器中的供試品體積的10倍，同步，硫乙醇酸流體培養(yǎng)基每

管裝量不少于15mL胰大豆陳液體培養(yǎng)基每管裝量不少于10ml。供試

品檢查時，培養(yǎng)基的用量和高度同措施合用性試驗中確定的。

545.2.1.滅菌醫(yī)用器具供試品：取規(guī)定量，必要時應將其拆散或切成小碎段，

等量接種于各管以浸沒供試品口勺適量培養(yǎng)基中。

5.4.6.培養(yǎng)及觀測：將上述接種供試品后的培養(yǎng)基容器分別按各培養(yǎng)基規(guī)定的I溫

度培養(yǎng)14天；培養(yǎng)期間應逐日觀測并記錄是有菌生長。如在加入供試品

后或在培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基出現(xiàn)渾濁，培養(yǎng)14天后，不能從外觀上判斷

有無微生物生長，可取該培養(yǎng)液適量轉種至同種新鮮培養(yǎng)基中，培養(yǎng)3天,

觀測接種時同種新鮮培養(yǎng)基與否再出現(xiàn)渾濁；或取培養(yǎng)液涂片，染色，鏡

檢，判斷與否有菌c

5.4.7.成果判斷

5.4.7.1.陽性對照管應生長良好，陰性對照管無菌生長，供試品管都無菌生長，

則供試品符合規(guī)定。

5.4.72陽性對照管應生長良好，陰性對照管無菌生長，供試品管中有任意一管

有菌生長，則供試品不符合規(guī)定。

5.473.陽性對照管應生長良好，陰性對照管無菌生長，供試品管渾濁，經(jīng)確鑿

無菌生長，則供試品符合規(guī)定；經(jīng)確證有菌生長，則供試品不符合規(guī)定。

5.4.7.4,有如下狀況的，判試驗無效。

5.4.7.4J.無菌檢查試驗所用的設備及環(huán)境的微生物監(jiān)控成果不符合無菌檢查法

的J規(guī)定。

5.474.2.回憶無菌試驗過程，發(fā)既有也許引起微生物污染的I原因，并且己經(jīng)確

證。

547.4.3.供試品管中生長H勺微生物經(jīng)鑒定后，確證是因無菌試驗中所用的物品

和（或）無菌操作技術不妥引起口勺。

5.4.75試驗若經(jīng)確認無效，則應重試。重試時，重新取同量供試品，依法檢查,

若無菌生長，判供試品符規(guī)定；若有菌生長，判供試品不符規(guī)定。

6.有關文獻

《潔凈區(qū)塵埃粒門￡測操作規(guī)程》

《潔凈區(qū)沉降菌監(jiān)測操作規(guī)程》

《試驗室潔凈區(qū)清潔、消毒操作規(guī)程》

《潔凈區(qū)環(huán)境監(jiān)測管理規(guī)程》

《ZW型集菌儀使用、維護操作規(guī)程》

《SPX-150型生化培養(yǎng)箱使用、維護操作規(guī)程》

《MJK-150型霉菌培養(yǎng)箱便用、維護操作規(guī)程》

《SW-CJ系列潔凈工作臺使用、維護規(guī)程》

《陽性菌種管理規(guī)程》

7.記錄

《無菌檢查原始記錄》

附表：

表1:批出廠產(chǎn)品的I至少檢查數(shù)量

接種每種培養(yǎng)基的至少檢

供試品批產(chǎn)量

查數(shù)量

W10010%或4件（取較多者）

醫(yī)療器具1OO<N^5OO10件

>5002%或20件（取較少者）

注：表中至少檢查數(shù)量不包括陽性對照用的供試品數(shù)量

表2：供試品的至少檢查量

每支供試品接入每種培養(yǎng)

供試品供試品裝量

基的至少許

外科用敷料棉花及紗布取100mg或1x3cm

縫合線、一次性醫(yī)用材料整個材料,注）

醫(yī)療器具帶導管口勺一次醫(yī)療器具二分之一內表面積

整個器具⑺（切碎或拆散

其他醫(yī)療器具

開）

注：假如醫(yī)療器械體積過大，培養(yǎng)基用量可再2023ml以上，耨其整個完全浸沒。

無菌檢查原始記錄(薄膜過濾法)

檢查編號:

產(chǎn)品名稱型號規(guī)格產(chǎn)品數(shù)量

產(chǎn)品批號滅菌批號滅菌有效期

來源檢品數(shù)量檢查日期年月日

完畢日期年月日檢查根據(jù)《無菌檢查原則操作規(guī)程》

檢查成果

培養(yǎng)基：硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基配制批號：_______________________

胰酪大豆陳液體培養(yǎng)基配制批號：_______________________

稀釋液、沖洗液：口0.1%蛋白陳水溶液口PH7.0氯化鈉-蛋白腺緩沖液

口0.9%無菌氯化鈉溶液口其他_________________配制批號：_______________________

陽性對照菌菌液：取對照菌新鮮培養(yǎng)物，接種至適量的0.9%無菌氯化鈉溶液中，取1ml

進行10倍系列稀釋，取稀釋液作為對照菌液。

對照菌名稱：____________________代數(shù)：____________計數(shù)成果：__________cfu/ml

儀器設備：EIZW-8()8A型集菌儀儀器編號：_______________________

口MJX-150霉菌培養(yǎng)箱(20-25℃)儀器編號：_______________________

□SPX-150生化培養(yǎng)箱(30~35℃)儀器編號：_______________________

無菌集菌器：批號：______________________生產(chǎn)廠家：______________________

凈化工作臺環(huán)境監(jiān)測溫度：℃濕度：%沉降菌原則(培養(yǎng)溫度：30?35℃)：<lcfu/niL

碟號

培養(yǎng)時間、123成果判斷

培養(yǎng)48h菌落數(shù)

1234567891011121314

培養(yǎng)基

樣品

成乙醇酸鹽

流體培養(yǎng)基陽性

(30-35,0

陰性

㈱酪大豆陳樣品

液體培養(yǎng)基

(2O~25C)陰性

注：逐日觀測,集菌器中有菌生長則填“+”，無菌生長則填

成果鑒定：本品按《無菌檢查原則操作規(guī)程》依法檢查，成果

松杳人/口期:復核人/口期:

無菌檢查原始記錄（直接接種法）

檢查編號:

產(chǎn)品名稱型號規(guī)格產(chǎn)品數(shù)量

產(chǎn)品批號滅菌批號滅菌有效期

來源檢品數(shù)量檢查日期年月日

完畢日期年月日檢查根據(jù)《無菌檢查原則操作規(guī)程》

檢查成果（第一頁）

培養(yǎng)基：硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基配制批號：_______________________

胰酪大豆陳液體培養(yǎng)基配制批號：_______________________

稀釋液、沖洗液：口0.1%蛋白月東水溶液口PH7.0氯化鈉-蛋白陳緩沖液

口0.9%無菌氯化鈉溶液口其他_________________配制批號：_______________________

陽性對照菌菌液：取對照菌新鮮培養(yǎng)物，接種至適量的0.9%無菌氯化鈉溶液中，取1ml

進行10倍系列稀釋，取稀釋液作為對照菌液。

對照菌名稱：____________________代數(shù)：____________計數(shù)成果：__________cfu/ml

儀器設備：口1\4以-150霉菌培養(yǎng)箱（20?25C）儀器編號：______________________

□SPX-150生化培養(yǎng)箱（30~35℃）儀器編號：______________________

凈化工作臺環(huán)境監(jiān)測溫度：℃濕度：%沉降菌原則（培養(yǎng)溫度：30~35C）：<lcfu/ni

碟號

培養(yǎng)時間、12