氨基酸工藝學第五章

氨基酸工藝學第五章第一節(jié)概述1.1氨基酸發(fā)酵工業(yè)是利用微生物的生長和代謝活動生產(chǎn)各種氨基酸的現(xiàn)代工業(yè)。氨基酸發(fā)酵是典型的代謝控制發(fā)酵。由發(fā)酵所生成的產(chǎn)物——氨基酸，都是微生物的中間代謝產(chǎn)物，它的積累是建立于對微生物正常代謝的抑制。也就是說，氨基酸發(fā)酵的關(guān)鍵，取決于其控制機制是否能被解除，能否打破微生物正常的代謝調(diào)節(jié)，人為的控制微生物的代謝。氨基酸發(fā)酵的成功，把代謝控制發(fā)酵技術(shù)引入微生物工業(yè)，使微生物工業(yè)能在DNA分子水平上改變、控制微生物的代謝，使有用產(chǎn)品大量生成、積累。21.1.1氨基酸生產(chǎn)的歷史1820年水解蛋白質(zhì)開始1850年在實驗室合成了氨基酸1866年（德）H.Ritthausen（立好生）博士利用硫酸水解小麥面筋，分離到一種酸性氨基酸，依據(jù)原料的取材，稱之為谷氨酸。1908年日本制造味之素。1909年用水解法生產(chǎn)谷氨酸。1936年（美）從甜菜廢液（司蒂芬廢液）中提谷氨酸。1954年多田、中山倆博士報告了直接發(fā)酵谷氨酸（L-GA）1957年發(fā)酵法生產(chǎn)味精商業(yè)性生產(chǎn)。

3從20世紀初期，氨基酸實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)以來，氨基酸生產(chǎn)大體有蛋內(nèi)質(zhì)水解法、化學合成法、微生物發(fā)酵法和酶法四種生產(chǎn)方法。蛋白質(zhì)水解法：早期味精生產(chǎn)、復合氨基酸；化學合成法：DL-蛋氨酸、甘氨酸、DL-丙氨酸；酶法：L-丙氨酸、L-色氨酸、L-絲氨酸；微生物發(fā)酵法：生產(chǎn)60%以上的氨基酸，包括直接發(fā)酵法和添加前體發(fā)酵法。前三種方法成本高，工藝復雜，難以達到工業(yè)化生產(chǎn)目的。4發(fā)酵法生產(chǎn)谷氨酸是現(xiàn)代發(fā)酵工業(yè)的重大創(chuàng)舉，也是氨基酸生產(chǎn)的重大革命，同時大大推動了其它氨基酸研究和生產(chǎn)的發(fā)展。逐步形成了用發(fā)酵法制造氨基酸的新型發(fā)酵工業(yè)部門。生產(chǎn)氨基酸的大國為日本和德國。日本的味之素、協(xié)和發(fā)酵及德國的德固沙是世界氨基酸生產(chǎn)的三巨頭。它們能生產(chǎn)高品質(zhì)的氨基酸,可直接用于輸液制劑的生產(chǎn)。日本在美國、法國等建立了合資的氨基酸生產(chǎn)廠家,生產(chǎn)氨基酸和天冬甜精等衍生物。5我國從1958年開始篩選谷氨酸生產(chǎn)菌，同時進行了大量的谷氨酸發(fā)酵的基礎性研究，1964年分離選育出北京棒狀桿菌As1.299和鈍齒桿菌As1.542二株谷氨酸生產(chǎn)菌。后進行其它的基礎性研究，陸續(xù)發(fā)表了賴、纈、亮、異亮、色、天冬的發(fā)酵研究報告，建立了自己的發(fā)酵工業(yè)。6國內(nèi)生產(chǎn)氨基酸的廠家主要是天津氨基酸公司,湖北八峰氨基酸公司,但目前無論生產(chǎn)規(guī)模及產(chǎn)品質(zhì)量還難于與國外抗衡。在80年代中后期,我國從日本的味之素、協(xié)和發(fā)酵以技貿(mào)合作的方式引進輸液制劑的制造技術(shù)和仿造產(chǎn)品,主要廠家有無錫華瑞,北京費森尤斯,昆明康普萊特,但生產(chǎn)原料都依賴進口。2000年,世界氨基酸產(chǎn)值達45億美元,占生物技術(shù)市場的7%,國內(nèi)的氨基酸產(chǎn)值可達40億元,占全國發(fā)酵產(chǎn)業(yè)總產(chǎn)值的12%。71.2氨基酸發(fā)酵生產(chǎn)發(fā)展的歷史回顧所謂氨基酸發(fā)酵,就是以糖類和銨鹽為培養(yǎng)基中的主要原料培養(yǎng)微生物,積累特定的氨基酸。這些方法成立的一個重要原因是使用選育好的氨基酸生物合成高能力的菌株。8菌株的育種

是氨基酸代謝控制發(fā)酵的基本策略之一從自然界中篩選有產(chǎn)酸能力的菌株,并建立其培養(yǎng)條件.在確立突變技術(shù)和闡明氨基酸生物合成系統(tǒng)調(diào)節(jié)機制的基礎上發(fā)展為營養(yǎng)缺陷變異株、抗藥性菌株的育種。隨著重組DNA技術(shù)的發(fā)展,接合、轉(zhuǎn)導、轉(zhuǎn)染、細胞融合等手段首先用于體內(nèi)基因重組,是早期用基因重組方法構(gòu)建生產(chǎn)菌株的嘗試。隨著載體、受體系統(tǒng)的構(gòu)建及體外基因重組技術(shù)的日益完善,氨基酸生物工程菌的構(gòu)建有了長足的發(fā)展。蘇氨酸等的生產(chǎn)菌株被成功地構(gòu)建并應用于工業(yè)化生產(chǎn)。91.2.1用野生株的方法這是從自然界獲得的分離菌株進行發(fā)酵生產(chǎn)的一種方法。典型的例子就是谷氨酸發(fā)酵。改變培養(yǎng)條件的發(fā)酵轉(zhuǎn)換法中,有變化銨離子濃度、磷酸濃度，使谷氨酸轉(zhuǎn)向谷氨酰胺和纈氨酸發(fā)酵101.2.2用營養(yǎng)缺陷變異株的方法這一方法是誘變出菌體內(nèi)氨基酸生物合成某步反應阻遏的營養(yǎng)缺陷型變異體，使生物合成在中途停止，不讓最終產(chǎn)物起控制作用。這種方法中有用高絲氨酸缺陷株的賴氨酸發(fā)酵，有用精氨酸缺陷株的鳥氨酸發(fā)酵，還有用異亮氨酸缺陷株的脯氨酸發(fā)酵。11谷氨酸棒狀桿菌的蘇氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸和賴氨酸的合成是與分枝途徑相聯(lián)系的(圖4-8)，篩選高絲氨酸營養(yǎng)缺陷型后，限量供給蘇氨酸時，就能解除由蘇氨酸和賴氨酸的協(xié)同反饋抑制作用，而獲得賴氨酸的過量生產(chǎn)。這是因為僅有賴氨酸或蘇氨酸存在時，天冬氨酸激酶不被抑制，只有兩者的協(xié)同效應才能造成抑制。在限量供給蘇氨酸的情況下，即使賴氨酸過剩，抑制作用也很難發(fā)生。121.2.3類似物抗性變異株的方法用一種與自己想獲得的氨基酸結(jié)構(gòu)相類似的化合物加入培養(yǎng)基內(nèi)，使其發(fā)生控制作用，從而抑制微生物的生長。這樣，就可以得到在這種培養(yǎng)基中能夠生長的變異株，而這種變異株正是解除了調(diào)控機制的，能夠生成過量的氨基酸。利用此方法發(fā)酵的有:蘇氨酸、賴氨酸、異亮氨酸、組氨酸和精氨酸。13高絲氨酸脫氫酶例如，在黃色短桿菌的賴氨酸、蘇氨酸和異亮氨酸生物合成中（圖5-16所示），選育抗蘇氨酸結(jié)構(gòu)類似物2-氨基-3-羥基戊酸（AHVr）突變株，得到了具有反饋抑制抗性，高絲氨酸脫氫酶活性提高1300倍，能積累14g/L蘇氨酸的突變株。141.2.4體內(nèi)及體外基因重組的方法基因工程包括細胞內(nèi)基因重組方法和試管內(nèi)的體外基因重組方法。體內(nèi)基因重組在應用上又稱為雜交育種，主要方法包括：轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、接合轉(zhuǎn)移、轉(zhuǎn)導和細胞融合等，這都是在細胞內(nèi)暫時地產(chǎn)生染色體的局部二倍體，在兩條DNA鏈之間引起兩次以上的交叉，是遺傳性重組現(xiàn)象。細胞內(nèi)基因重組技術(shù)的缺點是，現(xiàn)在只在同種或有近緣關(guān)系的微生物之間進行并較難成功。15代謝工程在闡明代謝途徑及其調(diào)控規(guī)律的基礎上，應用重組DNA技術(shù)可以改變代謝途徑分支點上的流量或引入新的代謝步驟與構(gòu)建新的代謝網(wǎng)絡。其主要步驟為:鑒定目標代謝途徑涉及的酶(特別是限速酶);取得酶基因，必要時可用蛋白質(zhì)工程技術(shù)，如定點誘變，基因剪接等，使蛋白具有新的特點(增強活性或穩(wěn)定性、解除反饋抑制等);將一種或多種異源的或改造后的酶基因與調(diào)節(jié)元件一起克隆進目標生物;使調(diào)節(jié)元件的作用及培育條件最優(yōu)化。通過基因工程技術(shù)，構(gòu)建理想的工程菌株1.2.5基因工程菌161.2.5.1載體-受體系統(tǒng)及克隆表達的研究1.2.5.1.1受體的獲得目前使用的氨基酸工程菌受體主要是大腸桿菌K-12及棒狀桿菌家族，通常是通過誘變選育出的基礎產(chǎn)率較高的菌株。大腸桿菌遺傳背景研究得清楚，載體系統(tǒng)完善，利于工程菌的構(gòu)建，但它含有內(nèi)毒素且不能將蛋白產(chǎn)物分泌至胞外，為應用帶來困難。棒狀桿菌能克服這兩個缺點，但載體受體系統(tǒng)研究較晚且有限制修飾系統(tǒng)的障礙，所以獲得利于外源基因?qū)爰氨磉_且能穩(wěn)定遺傳的受體菌是尚待解決的問題。171.2.5.1.2載體的構(gòu)建有效的載體需要有在受體菌中可啟動的復制起始位點，這可從棒狀桿菌家族內(nèi)源小質(zhì)粒中獲得;載體所需的篩選標記及外源基因插入的多克隆位點，可從常用的克隆載體中獲得。181.2.5.1.3基因轉(zhuǎn)移手段由于棒狀桿菌是革蘭氏陽性菌，CaCl2轉(zhuǎn)化法對它不適用。通常采用的方法有:原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導，電轉(zhuǎn)化，接合轉(zhuǎn)移。原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法是較早采用的方法，由于受到原生質(zhì)體再生條件的局限，效率不高;電轉(zhuǎn)化方法由于高效，快速被廣泛使用，目前它的轉(zhuǎn)化效率可達到原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法的100～1000倍。接合轉(zhuǎn)移可用于基因在親緣關(guān)系遠的物種之間的轉(zhuǎn)移，并且可將外源基因整合于染色體上，易于穩(wěn)定遺傳。191.3氨基酸發(fā)酵的代謝控制

是氨基酸代謝控制發(fā)酵的基本策略之二

菌種的代謝調(diào)控:控制發(fā)酵的條件控制細胞滲透性控制旁路代謝降低反饋作用物的濃度消除終產(chǎn)物的反饋抑制與阻遏作用促進ATP的積累，以利氨基酸的生物合成201、控制發(fā)酵環(huán)境條件專性需氧菌，控制環(huán)境條件可改變代謝途徑和產(chǎn)物。212、控制細胞滲透性生物素、油酸和表面活性劑，引起細胞膜的脂肪酸成分的改變。細胞內(nèi)生物素水平高，Glu不能通過細胞膜青霉素：抑制細胞壁的合成，由于細胞面內(nèi)外的滲透壓而泄露出來。表面活性劑增加細胞膜通透性氨基酸發(fā)酵必須考慮的重要因素22細胞透性的調(diào)節(jié)細胞透性的調(diào)節(jié)，一般通過向培養(yǎng)基中添加化學成分（如生物素、油酸、甘油、表面活性劑、青霉素等，達到抑制磷脂、細胞膜的形成或阻礙細胞壁的正常生物合成，使谷氨酸生產(chǎn)菌處于異常生理狀態(tài)，解除細胞對谷氨酸向胞外漏出的滲透障礙。生物素：影響磷脂的合成及細胞膜的完整性。油酸：直接影響磷脂的合成及細胞膜甘油：甘油缺陷型菌株喪失α-磷酸甘油脫氫酶，不能合成α-磷酸甘油和磷脂。限量供應，控制了細胞膜中與滲透性直接關(guān)系的磷脂含量，使谷氨酸排出胞外而積累。表面活性劑：對生物素有拮抗作用，拮抗不飽和脂肪酸的合成，導致磷脂合成不足，影響細胞膜的完整性，提供細胞膜對谷氨酸的滲透性。青霉素：抑制細菌細胞壁的后期合成，形成不完整的細胞壁，使細胞膜失去保護，使胞內(nèi)外的滲透壓差導致細胞膜的物理損傷，增大谷氨酸向胞外漏出的滲透性23生物素阻斷脂肪酸的合成影響細胞膜的合成表面活性劑對生物素有拮抗阻斷脂肪酸的合成影響細胞膜的合成在對數(shù)生長期添加青霉素抑制細胞壁合成細胞膜損傷甘油缺陷型磷脂的合成受阻影響細胞膜的合成油酸缺陷型阻斷不飽和脂肪酸的合成影響細胞膜的合成提高細胞膜的谷氨酸通透性控制磷脂的合成使細胞膜受損（如表面活性劑）青霉素損傷細胞壁，間接影響細胞膜控制磷脂含量通過油酸的合成通過甘油合成直接控制磷脂合成243、控制旁路代謝254、降低反饋作用物的濃度利用營養(yǎng)缺陷型突變株進行氨基酸發(fā)酵必須限制所要求的氨基酸的量。限制瓜氨酸的濃度可解除反饋抑制，實現(xiàn)鳥氨酸的生物合成。265、消除終產(chǎn)物的反饋抑制與阻遏作用使用抗氨基酸結(jié)構(gòu)類似物突變株的方法或者通過選育營養(yǎng)缺陷型菌株。6、促進ATP的積累，以利氨基酸的生物合成ATP的積累可促進氨基酸的生物合成27迄今，日已有22種氨基酸可用發(fā)酵法生產(chǎn)。但生產(chǎn)上不一定非用生物合成。根據(jù)經(jīng)濟、資源的合理性，利用不同方法生產(chǎn)氨基酸。如蛋氨酸、鳥氨酸用化學合成法，胱氨酸可用提取法水解。但化學合成為D型，右旋。生物合成為L型，左旋。水解法污染厲害。因而總的來說，氨基酸生產(chǎn)要用生物合成。28今后的發(fā)展是育出從遺傳角度解除了反饋調(diào)節(jié)和遺傳性穩(wěn)定的更理想菌種。提高產(chǎn)酸。采用過程控制，加強種子管理、連續(xù)化、自動化、穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn)、探索新工藝、新設備，以提高產(chǎn)率和收得率、研究微生物生理、生化、遺傳變異和發(fā)酵機制等問題，以便能更好地控制氨基酸這樣微生物中間代謝產(chǎn)物的發(fā)酵。29二、氨基酸的應用（一）醫(yī)藥因為蛋白質(zhì)是由各種氨基酸構(gòu)成的，所以各種氨基酸及其衍生物可治療各種不同的疾病。如消化系統(tǒng)經(jīng)手術(shù)后，或燒傷、創(chuàng)傷病例需大量補充蛋白質(zhì)營養(yǎng)時，可注射各種氨基酸，配比接近雞蛋的配比為佳。八種必須氨基酸（異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸）苯丙氨酸與氮芥子氣合成的苯丙氨酸氮芥子氣對骨髓腫瘤治療有效,且副作用低。30（二）食品1．調(diào)味用的氨基酸①味精（Glu-Na）其與肌苷酸鈉或鳥苷酸鈉同時使用，具協(xié)同作用，可提高鮮味。②天冬氨酸鈉用量僅次于味精的調(diào)味品，具強烈鮮味。③甘氨酸甜味為砂糖的0.8倍。在果汁中加0.02%～0.4%的甘氨酸，可去除糖精的苦味。31④DL-丙氨酸。甜味為砂糖的1.2倍。⑤D-色氨酸。甜味為砂糖的35倍。用于牙膏、糖尿病人及肥胖病人。⑥天冬氨酸-苯丙氨酸甲酯。甜味為砂糖的150倍。但其水溶液不耐熱，70～80℃就分解，加熱至100℃就失去甜味。2．提高食品的營養(yǎng)價值。8種人體必須氨基酸，不能在體內(nèi)合成，而各種食品又缺乏某一特定的必須氨基酸，添加之可提高蛋白質(zhì)的利用率。如。魚缺色氨酸。強化食品(賴氨酸，蘇氨酸，色氨酸于小麥中)32（三）農(nóng)業(yè)1．增加飼料的營養(yǎng)率。如，谷類缺賴氨酸，豆類缺蛋氨酸。甲硫氨酸等必需氨基酸可用于制造動物飼料。2．氨基酸農(nóng)藥如，水稻孕穗期使用氨基酸脂肪酸農(nóng)藥N-月桂酰-L-異戊氨酸能防止稻瘟病，提高水稻蛋白質(zhì)的含量，改進稻米的風味和品質(zhì)。33（四）工業(yè)原料1．人造革D-谷氨酸聚合生成聚合谷氨酸（PLG）2．洗滌劑十二烷酰基谷氨酸（AGS）肥皂以及用月桂酰氨與D/L-GA制成的肥皂，其洗凈力，起泡力，乳化力，分散力均好。3．潤膚劑（焦谷氨酸鈉）脫一分子水形成NPCA-Na。保濕性比甘油好。34請寫出從葡萄糖到谷氨酸的合成途徑，并說明與合成效率有關(guān)的機制35第二節(jié)谷氨酸發(fā)酵機制一、工藝過程谷氨酸發(fā)酵工藝流程

36等電點提取谷氨酸工藝流程37谷氨酸制味精的工藝流程3839國內(nèi)用糖蜜發(fā)酵，要加吐溫（表面活性劑）國外用糖蜜發(fā)酵，日本加青霉素，法國不用青霉素、吐溫、是由其菌特點所決定Glu生長水平好壞有關(guān)因素：菌種、工藝、設備條件協(xié)同配和正常條件下，菌體產(chǎn)生Glu在發(fā)酵液中為1mg/ml(1％)谷氨酸代謝調(diào)節(jié)，細胞膜透性調(diào)節(jié)與環(huán)境條件協(xié)同配和。40第二節(jié)谷氨酸生物和成途徑代謝控制發(fā)酵是用遺傳學或其他生物化學的方法，人為地在分子水平上改變和控制微生物的代謝，打破微生物正常的代謝調(diào)節(jié)，使有用產(chǎn)物大量生成和積累。氨基酸發(fā)酵是典型的代謝控制發(fā)酵，發(fā)酵技術(shù)的關(guān)鍵是打破微生物的正常代謝調(diào)節(jié)，人為控制微生物的代謝。葡萄糖經(jīng)糖酵解(EMP途徑)和己糖磷酸支路(HMP途徑)生成丙酮酸，再氧化成乙酰CoA，然后進入三羧酸循環(huán)，再通過乙醛酸循環(huán)、CO2固定作用，生成α-酮戊二酸，α-酮戊二酸在谷氨酸脫氫酶的催化及有NH4+存在的條件下，生成谷氨酸。41由葡萄糖生物合成谷氨酸42二、氨的導入還原氨基化反應（GDH）轉(zhuǎn)氨反應（AT）谷氨酸合成酶（GS）催化的反應431、谷氨酸生物合成中的幾個途徑（正常途徑）（1）糖酵解途徑（EMP）（2）磷酸已糖途徑（HMP)（3）三羧酸循環(huán)(TCA環(huán))（4）乙醛酸循環(huán)（DCA環(huán)）（5）二氧化碳固定反應

PEP+CO2+GTP草酰乙酸+GDP

丙酮酸+CO2+NADH蘋果酸+NAD草酰乙酸CO2NAD+NADH+H+（6）α-KGA的還原氨基化反應

PEP羧化酶蘋果酸酶蘋果酸脫氫酶C6H12O6+NH3+O2→C5H9O4N+CO2+3H2O在GA產(chǎn)生菌菌體內(nèi)CO2固定反應有以下兩條途徑：44①蘋果酸酶②丙酮酸羧化酶③磷酸烯醇丙酮酸羧化酶CO2固定反應(丙酮酸羧化支路)452、GA生物合成的理想途徑（1）GA產(chǎn)生菌必須具備以下條件（內(nèi)在因素）α-酮戊二酸脫氫酶的活性微弱或缺失TCA環(huán)阻斷，α-酮戊二酸積累琥珀酸輔酶ATCA環(huán)正常

GA產(chǎn)生菌體內(nèi)的NADPH的氧化能力欠缺或喪失積累NADPH，抑制α—KGA的脫羧氧化46

GA產(chǎn)生菌體內(nèi)必須有乙醛酸循環(huán)（DCA）的關(guān)鍵酶——異檸檬酸裂解酶通過該酶酶活性調(diào)節(jié)實現(xiàn)DCA循環(huán)的封閉，GA發(fā)酵積累

菌體有強烈的L—谷氨酸脫氫酶活性α—KGA+NH4++NADPH==GA+NADP提供NADPH,用于還原α-酮戊二酸生成谷氨酸，形成氧化還原共扼體系該反應的關(guān)鍵是與異檸檬酸脫羧氧化相偶聯(lián)

47

3/2GlucoseEMP丙酮酸+丙酮酸+丙酮酸乙酰輔酶A+乙酰輔酶A+乙酰輔酶A檸檬酸

則有：3/2C6H12O6+NH4+==C5H9O4N+4CO2

產(chǎn)率：147/（180*3/2）==54.4%CO2谷氨酸在前述GA合成所必需的條件的基礎上，體系不存在CO2固定反應，則有：體系存在CO2的固定反應結(jié)論通過DCA環(huán)提供C4二羧酸時谷氨酸對糖的轉(zhuǎn)化率僅為54.4%在谷氨酸發(fā)酵中，DCA環(huán)可以作為TCA循環(huán)有缺陷時C4二羧酸的補充48.在前述GA合成所必需的條件的基礎上（封閉乙醛酸循環(huán)）存在CO2固定反應，則有：GlucoseEMP丙酮酸+丙酮酸CO2則有：C6H12O6+NH4+==C5H9O4N

+CO2

（來自何方）產(chǎn)率：147/180==81.7%乙酰輔酶A+C4二羧酸CO2 草酰乙酸（草酰乙酸羧化酶）蘋果酸（蘋果酸激酶）檸檬酸（DCA循環(huán)封閉）谷氨酸49四碳二羧酸的來源Δ在生產(chǎn)菌中檢出CO2固定反應酶活性磷酸烯醇丙酮酸(PEF)羧化酶和蘋果酸酶谷氨酸對糖的轉(zhuǎn)化率達到81.7%C6H12O6+NH3+1.5O2──C5H9O4N+CO2+3H2O需要Mn2+做催化劑，所以，在GA發(fā)酵過程中需要向培養(yǎng)基中補充Mn2+實際上，發(fā)酵過程中不可能控制檸檬酸合成所需的C4二羧酸完全來自于CO2固定反應，體系也不可能完全不存在CO2固定反應，因此，GA發(fā)酵的糖酸轉(zhuǎn)化率應在：54.4%——81.7%。目前，國內(nèi)的GA生產(chǎn)企業(yè)的糖酸轉(zhuǎn)化率通常都在50%以內(nèi)：50

提高GA的潛力是很大的，具體表現(xiàn)在：（1）強化CO2固定反應，具體措施：Mn2+，生物素，（2）控制溶氧濃度是非常重要的低的溶氧濃度，則丙酮酸向乳酸方向轉(zhuǎn)化……高的溶氧濃度，則NADPH有被氧化的可能，……51氨的導入①還原氨基化反應為主導性反應由谷氨酸脫氫酶（GDH）所催化②轉(zhuǎn)氨酶（AT）催化的轉(zhuǎn)氨反應利用已存在的其他氨基酸，經(jīng)過轉(zhuǎn)氨酶的作用，將其它氨基酸與生成L-谷氨酸③谷氨酸合成酶（GS）催化的反應以-酮戊二酸為基質(zhì)不能生成Glu，從此可看出H2來自52氨的導入合成谷氨酸的反應有3種：α-酮戊二酸+天冬氨酸或丙氨酸谷氨酸轉(zhuǎn)氨酶AT谷氨酸α-酮戊二酸+α-酮戊二酸+谷氨酰胺NADPH+2谷氨酸NADP+谷氨酸合成酶GSα-酮戊二酸NH4+NADPH谷氨酸H2ONADP+谷氨酸脫氫酶GHD+++53（2）影響谷氨酸合成的外在因素a、生物素對糖代謝的影響生物素參與糖代謝作用：增加糖代謝的速度(對TCA有促進作用）乳酸積累碳源利用率降低，發(fā)酵液的pH值下降。而丙酮酸氧化脫羧的速度未改變丙酮酸積累A、生物素對GA發(fā)酵的影響主要影響糖降解速度，不影響EMP與HMP途徑的比率。生物素充足的條件下，丙酮酸以后的氧化活性雖然也得到提高，但由于糖降解速度顯著提高，打破了糖降解速度與丙酮酸氧化速度之間的平衡，丙酮酸趨于生成乳酸的反應，引起乳酸的溢出。5455研究表明，異檸檬酸裂解酶活性

為醋酸誘導

受琥珀酸的阻遏，抑制當VH缺乏時：（1）丙酮酸的有氧氧化就會減弱，則：乙酰輔酶A的生成量就會少，醋酸濃度降低，它的誘導作用降低；通過控制生物素亞適量，幾乎看不到異檸檬酸裂解酶的活性（2）VH對TCA循環(huán)的促進作用的降低，使得其中間產(chǎn)物琥珀酸的氧化速度降低，其濃度得到積累，這樣它的阻遏和抑制作用加強；乙醛酸循環(huán)基本上是封閉的，代謝流向異檸檬酸→α-酮戊二酸→谷氨酸的方向高效率地移動兩者綜合的作用使得，異檸檬酸裂解酶的活性喪失，DCA循環(huán)得到封閉。b、控制VH的濃度，以實現(xiàn)對于乙醛酸循環(huán)的封閉56c、生物素對氮代謝的影響VH豐富時，出現(xiàn)“只長菌，不產(chǎn)酸”的現(xiàn)象GA發(fā)酵過程中，前期，菌體的增殖期，一定的量的生物素是菌體增殖所必需的；而在產(chǎn)物合成期，則要限制生物素的濃度，以保證產(chǎn)物的正常合成。結(jié)論氨的導入時生物素缺乏，NH4+影響糖代謝速度：提高糖代謝速度高效合成谷氨酸生物素充足時，NH4+不影響糖代謝速度57關(guān)于氮代謝的調(diào)節(jié)：控制谷氨酸發(fā)酵的關(guān)鍵之一就是降低蛋白質(zhì)的合成能力，使合成的谷氨酸不能轉(zhuǎn)化成其他氨基酸或參與蛋白質(zhì)合成。在生物素亞適量的情況下，幾乎沒有異檸檬酸裂解酶，琥珀酸氧化能力弱，蘋果酸和草酰乙酸脫羧反應停滯，在銨離子適量存在下，生成積累谷氨酸。生成的谷氨酸也不通過轉(zhuǎn)氨作用生成其他氨基酸和合成蛋白質(zhì)。在生物素充足的條件下，異檸檬酸裂解酶活性增強，琥珀酸氧化能力增強，丙酮酸氧化力加強，乙醛酸循環(huán)的比例增加，草酰乙酸、蘋果酸脫羧反應增強，蛋白質(zhì)合成增強，谷氨酸減少，合成的谷氨酸通過轉(zhuǎn)氨作用生成的其他氨基酸量增加。

58d、VH對菌體細胞膜通透性的影響通常谷氨酸發(fā)酵采用的菌種都是VH-，而VH又是菌體細胞膜合成的必須物質(zhì)，因此，可以通過控制VH的濃度（干擾磷脂中的脂肪酸的生物合成）來實現(xiàn)的來實現(xiàn)對菌體細胞膜通透性的調(diào)節(jié)。

葡萄糖丙酮酸+丙酮酸乙酰輔酶A乙酰輔酶Ａ乙酰輔酶A羧化酶（輔酶是VH）CO2丙二酰輔酶A丙二酰輔酶AC4C6CO2培養(yǎng)基中生物素限量時，胞內(nèi)AA92%胞外

培養(yǎng)基中生物素豐富時，胞內(nèi)AA12%胞外

CO259Glu生產(chǎn)菌大多是生物素缺陷型，發(fā)酵時控制生物素亞適量，使細胞變形拉長，改變了細胞膜的通透性引起代謝失調(diào)使Glu得以積累。生物素貧乏時，細胞內(nèi)的Glu含量少而且容易析出，而培養(yǎng)基中積累大量的Glu；生物素豐富時，培養(yǎng)基中幾乎不積累Glu，而細胞內(nèi)卻含有大量的Glu，且不易被析出。這說明生物素對細胞膜通透性有重要影響。

谷氨酸發(fā)酵的關(guān)鍵在于發(fā)酵培養(yǎng)期間谷氨酸生產(chǎn)菌細胞膜結(jié)構(gòu)與功能發(fā)生特異性變化，使細胞膜轉(zhuǎn)變成有利于谷氨酸向膜外滲透的形態(tài)，使終產(chǎn)物不斷排出細胞外，胞內(nèi)谷氨酸不能積累到引起反饋調(diào)節(jié)的濃度，胞內(nèi)谷氨酸源源不斷被優(yōu)先合成，分泌到發(fā)酵培養(yǎng)基中積累。60B、供氧濃度

過量：NADPH的再氧化能力會加強，使α-KGA的還原氨基化受到影響，不利于GA的生成。供氧不足：積累大量的乳酸，使發(fā)酵液的pH值下降，不利于GA的產(chǎn)生，同時，一部分葡萄糖轉(zhuǎn)成了乳酸，影響了糖酸轉(zhuǎn)化率，降低了產(chǎn)物的提出率。C、NH4+濃度（1）影響到發(fā)酵液的pH值（2）與產(chǎn)物的形成有關(guān)：過低，不利于α-KGA的還原氨基化；過高，產(chǎn)生谷氨酰胺。NH4+的供給方式：（1）液氨（2）流加尿素61D、磷酸鹽過量：（1）促進EMP途徑，打破EMP與TCA之間的平衡，積累丙酮酸，產(chǎn)生乳酸等…… （2）產(chǎn)生并積累Val，Glucose丙酮酸丙酮酸+活性乙醛α-乙酰乳酸ValVal（1）可以抑制葡萄糖丙酮酸，使GA的生物合成受到阻止

（2）消耗了丙酮酸，降低了糖酸轉(zhuǎn)化率

（3）發(fā)酵液中的Val存在，嚴重的影響GA的結(jié)晶、提出62研究證明：谷氨酸生產(chǎn)菌種存在EMP途徑的全部酶和HMP途徑的酶有關(guān)TCA循環(huán)中的檸檬酸、順烏頭酸、異檸檬酸能定量地生成谷氨酸，其相應的酶與谷氨酸合成有關(guān)以醋酸和乙醇為原料進行谷氨酸發(fā)酵時，DCA循環(huán)是C4二羧酸的唯一補充來源；但是以葡萄糖為原料時，在谷氨酸生成期此循環(huán)應關(guān)閉谷氨酸菌存在CO2固定生成草酰乙酸的PEP羧化酶和蘋果酸酶，與谷氨酸得率正相關(guān)63一.控制細胞膜透性的方法1.化學控制方法通過控制發(fā)酵培養(yǎng)基中的化學成分,達到控制磷脂,細胞膜的形成或阻礙細胞壁正常的生物合成,使谷氨酸生產(chǎn)菌處于異常的生理狀態(tài),以解除細胞對谷氨酸向胞外漏出的滲透障礙。64①控制磷脂的合成,導致形成磷脂合成不足的不完全的細胞膜(1)生物素缺陷型使用生物素缺陷型菌株進行谷氨酸發(fā)酵時,必須限制發(fā)酵培養(yǎng)基中生物素的濃度.a.作用機制:生物素作為催化脂肪酸生物合成最初反應的關(guān)鍵酶乙酰CoA羧化酶的輔酶,參與了脂肪酸的合成,進而影響磷脂的合成.當磷脂合成減少到正常量的1/2左右時,細胞變形、谷氨酸向膜外漏出,積累于發(fā)酵液中。

65b.控制的關(guān)鍵為了形成有利于谷氨酸向外滲透的磷脂合成不足的細胞膜,必須亞適量控制生物素(5-10ug/l)發(fā)酵初期(0-8h)菌體正常生長,菌體形態(tài)為單個成對八字形棒形橢圓短桿形,當生物素耗盡后,在菌的再次倍增期間,開始出現(xiàn)異常形態(tài)的細胞,菌體伸長,膨大乃至不規(guī)則形,邊緣有折縐,稍模糊電鏡觀察似皰疹樣，完成谷氨酸非積累型細胞向積累型細胞的轉(zhuǎn)變,形成磷脂合成不足的不完全的細胞膜.谷氨酸高產(chǎn)。若生物素過剩,就會只長菌不產(chǎn)酸或長菌好產(chǎn)酸低。66(2)添加表面活性劑(如吐溫60)或是飽和脂肪酸(C16-18)使用生物素過量的糖蜜原料發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酸時通過添加表面活性劑(吐溫60)或高級飽和脂肪酸(C16-18)及其親水聚酸脂類,同樣能清除滲透障礙物，積累谷氨酸a.作用機制表面活性劑、高級飽和脂肪酸的作用,并不在于它的表面效果,而是在不飽和脂肪酸的合成過程中,作為抗代謝物具有抑制作用,對生物素有拮抗作用,通過拮抗脂肪酸的生物合成導致磷脂合成不足,結(jié)果形成磷脂不足的細胞膜,提高了細胞膜對谷氨酸的滲透性67b.影響產(chǎn)酸的關(guān)鍵,必須控制好添加表面活性劑.飽和脂肪酸的時間與濃度,必須在藥劑添加后.在這些藥劑存在下,再次進行細菌的分裂繁殖.形成處于異常生理狀態(tài)的產(chǎn)酸型細胞,即完成谷氨酸非積累型細胞向谷氨酸積累型細胞的轉(zhuǎn)變.例如,以甜菜糖蜜為原料,采用高生物素高吐溫工藝。一般于發(fā)酵對數(shù)生長期的早期(4-6h),添加0.2％吐溫60，之后OD值與菌體重約凈種增一倍,剩余生長太多,意味著谷氨酸生產(chǎn)菌細胞不能完成有效的生理學變化，剩余生長不足,意味著谷氨酸生產(chǎn)菌沒有機會完成這種轉(zhuǎn)變.68(3)油酸缺陷使用油酸缺陷型菌株進行谷氨酸發(fā)酵時,必須限制發(fā)酵培養(yǎng)基中油酸的濃度，由于油酸缺陷型突變株切斷了油酸的后期合成,喪失了自身合成油酸的能力69(4)甘油缺陷型使用甘油缺陷型菌株進行谷氨酸發(fā)酵時,必須限制發(fā)酵培養(yǎng)基中甘油的濃度②阻礙谷氨酸生產(chǎn)菌細胞壁的合成作用機制:添加青霉素是抑制谷氨酸生產(chǎn)菌細胞壁的后期合成，進而導致形成不完全的細胞膜。影響產(chǎn)酸關(guān)鍵：702、物理控制方法：利用溫度敏感突變株突變位置：發(fā)生在決定與谷氨酸分泌有密切關(guān)系的細胞膜結(jié)構(gòu)的基因上，發(fā)生堿基的轉(zhuǎn)換或顛換，一個堿基為另一個堿基所置換，這樣為基因所指導譯出的酶，在高溫時失活，導致細胞膜某些結(jié)構(gòu)的改變。影響產(chǎn)酸關(guān)鍵：控制溫度轉(zhuǎn)換的時間（30℃提高到40℃的時間），并要在溫度轉(zhuǎn)換之后進行適度的剩余生長。71第四節(jié)GA生產(chǎn)菌的特征育種及擴大培養(yǎng)一、谷氨酸生產(chǎn)菌的主要特征與菌學性質(zhì)1.現(xiàn)有谷氨酸生產(chǎn)主要是四個屬短桿菌科短桿菌屬(Brevibacteriaceea)(Brevibacterium)1.棒狀桿菌屬(Corgnebacferium)棒桿菌科2.小桿菌屬(Microbacterium)(Corgnebacteriaceae)3.節(jié)桿菌(Arthrobacter)722.現(xiàn)有谷氨酸生產(chǎn)菌的主要特征這些菌曾分屬四個屬,但它們在形態(tài)及生理方面仍有許多共同的特征（1）細胞形態(tài)為球形、棒形以至短桿形（2）G+無芽孢，無鞭毛,不能運動（3）都是需氧型微生物（4）都是生物素缺陷型（5）脲酶強陽性（6）不分解淀粉、纖維素、油脂、酪蛋白及明膠等73（7）發(fā)酵中菌體發(fā)生明顯的形態(tài)變化,同時發(fā)生細胞膜滲透性的變化（8）CO2固定酶系活力強（9）異檸檬酸裂解酶活力欠缺或微弱,乙醛酸循環(huán)弱（10）氧化能力缺失或微弱（11）還原性輔酶Ⅱ進入呼吸鏈能力弱（12）檸檬酸合成酶、烏頭酸酶、異檸檬酸脫氫酶以及谷氨酸脫氫酶活力強（13）能利用醋酸,不能利用石蠟（14）具有向環(huán)境中泄漏谷氨酸的能力（15）不分解利用谷氨酸,并能耐高濃度的谷氨酸,產(chǎn)生谷氨酸5％以上74二.國內(nèi)谷氨酸生產(chǎn)菌及其比較國內(nèi)谷氨酸發(fā)酵已有40年歷史.目前使用的菌株主要有:北京棒桿菌(AS.1299)7338S-941WTH-1鈍齒棒桿菌(AS1.542)、HU7251、B9B9-17-36F-263天津短桿菌(T6-13)FM-8207FM-415U-9CMTC6282TG-3TG-866D85等菌株多數(shù)廠家常用:B9T6-137338等75（一）、北京棒桿菌（7338）與鈍齒棒桿菌（B9）的比較在實際生產(chǎn)中，7338菌株與B9菌株的主要區(qū)別如下：①細胞大小與細胞形態(tài)B9的細胞明顯大于7338菌∴在發(fā)酵液提取GA上容易與菌分離，提取容易，發(fā)酵穩(wěn)定。而7338因菌體細胞小，相對受噬菌體污染稍輕。B9菌在發(fā)酵過程中有明顯的菌體形態(tài)變化，菌體發(fā)生伸長膨大，而7338菌在發(fā)酵過程中的形態(tài)變化，相對不夠明顯。76②菌體本身的等電點不同7388在PH4.2-3.0。特別3.5-3.0菌大量沉降，同GA等電點∴菌分離困難，而B9不在此范圍，易分離③菌落顏色7338乳白色B9為草黃色發(fā)酵過程分泌色素少77④脲酶7388B9活力低∴耐受力強活力高耐受低初尿可達1.8-2.0％初尿0.8流尿2-3次流尿4-6次⑤生物素用量要求范圍狹窄4-5ug/l較粗放5-8ug/l（由初糖定）⑥生長因子都以生物素為必需生長因子，7388還需要硫胺素78⑦發(fā)酵周期7388后勁足，而前期卻不明顯，∴周期稍長⑧噬菌體類型不同，不交叉感染，可相調(diào)換⑨酯酶譜帶蛋白酶譜帶，代謝產(chǎn)物都不盡相同。79㈡天津短桿菌（T6-13）與純齒棒桿菌（B9）的比較①細胞大?。盒∏叶?，泡沫稍大提取比B9困難②菌體形態(tài)斜面淡白色草黃色發(fā)酵中形態(tài)變化比B9大前期細胞比較短，圓滾滾，16h后拉長3倍以上③發(fā)酵溫度前32-34℃前30-32℃`中后36-38℃中后34-35℃（有利于夏天降溫條件差的工廠）80④脲酶活力更強初尿0.5-0.6％宜少量多次⑤生物素用量比B9低20％左右⑥糖酸轉(zhuǎn)化率不同45%以上40-45%⑦噬菌體類型相同⑧膠體量分泌膠體較多會干擾等電點GA結(jié)晶和菌體分離⑨菌體本身等電點接近谷氨酸等電點提取收率較高為4.2-3.0之間81三、谷氨酸生產(chǎn)菌在發(fā)酵過程中的形態(tài)變化在生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)GA生產(chǎn)菌發(fā)酵過程中會發(fā)現(xiàn)明顯的菌體形態(tài)的變化。在發(fā)酵過程中發(fā)現(xiàn)菌體形態(tài)有明顯的變化時，正是產(chǎn)GA的激增時間。但在發(fā)酵培養(yǎng)基含有過剩生物素的培養(yǎng)條件下，菌體形態(tài)則沒有明顯變化，卻呈現(xiàn)耗糖長菌不產(chǎn)谷氨酸的異常發(fā)酵。82㈠種子的菌體形態(tài)將斜面和一、二級種子培養(yǎng)的菌體，用結(jié)晶紫染色，經(jīng)顯微觀察，發(fā)現(xiàn)B9菌，在一、二級種子和斜面種子培養(yǎng)的不同培養(yǎng)條件下，細胞形態(tài)基本形似，稍有差異。斜面菌稍小，一、二級種子菌體大而粗壯，革蘭氏染色深。0.7-0.9×1.0～3.4um折斷分裂成V字形，為谷氨酸非積累型細胞。83㈡谷氨酸發(fā)酵不同階段的菌體形態(tài)生物素為VB的一種，也叫做或輔酶R，參與脂肪酸生物合成限速反應的關(guān)鍵酶，乙酰CoA羧化酶的輔酶，參與脂肪酸合成。通過控制生物素亞適量，使發(fā)酵7-10h后，生物素處于貧乏狀態(tài)。16-20h后，生物素消耗完，完成谷氨酸非積累型細胞向積累型細胞轉(zhuǎn)化，表現(xiàn)為OD值穩(wěn)定，GA產(chǎn)量直線上升，直至發(fā)酵結(jié)束。84從GA發(fā)酵中菌形態(tài)變化來看，可分為三個時期：以發(fā)酵30-36h的正常GA發(fā)酵為例：發(fā)酵0-8h或0-10h為長菌型細胞，形態(tài)與二級種子相似短桿至棒狀菌呈單個、成對或“V”字型發(fā)酵8-18h或10-20h為轉(zhuǎn)移期細胞，此階段細胞形態(tài)急劇變化。細胞開始伸長、膨大。從GA非積累型細胞向GA積累型細胞（產(chǎn)酸型細胞）轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)移期有長菌型細胞，也有產(chǎn)酸型細胞，產(chǎn)酸速度逐漸加快。85發(fā)酵16-20h后為產(chǎn)酸型細胞，細胞為含磷脂不足的異常形態(tài)，呈現(xiàn)伸長、膨大、不規(guī)則，缺乏“V”字型排列，有的呈彎曲形，邊緣顏色淺，稍模糊，有的邊緣折縐及至殘缺不齊，但菌體形態(tài)基本清楚。在發(fā)酵后期，細胞較長，多呈現(xiàn)有明顯的橫隔（1-3個或更多）的多節(jié)細胞，類似花生狀，產(chǎn)酸高，在糖酸轉(zhuǎn)化率高時尤甚。86㈢GA發(fā)酵感染噬菌體后的形態(tài)感染噬菌體形態(tài)也會發(fā)生改變。感染噬菌體時期不同改變也不同1.前期染噬菌體鏡檢可見細胞明顯減少，細胞不規(guī)則、發(fā)圓、發(fā)胖、缺乏“V”字形排列視野中有明顯的細胞碎片，嚴重時出現(xiàn)蛛絲、拉網(wǎng)，互相堆在一起。幾乎找不到完整的菌體細胞，類似蛛網(wǎng)或魚鱗狀，生產(chǎn)上表現(xiàn)為排氣口CO2迅速下降，相繼出現(xiàn)OD值下跌PH上升或不上升，耗糖緩慢等異常發(fā)酵，應立即停止發(fā)酵進行救治。872、發(fā)酵中、后期感染噬菌體的菌體形態(tài)菌體細胞形態(tài)不規(guī)則，邊緣不整齊有的邊緣似乎有許多毛刺狀的東西。有細胞碎片，不同于正常發(fā)酵的產(chǎn)酸細胞。一般說在生產(chǎn)上中、后期感染噬菌體，OD值雖下降，也常伴有泡沫多、黏度大、耗糖緩慢等異?，F(xiàn)象，但及時補加適量營養(yǎng)物，一般仍可完成發(fā)酵，產(chǎn)酸在4％左右，但需注意，由于噬菌體侵染細胞后會使細胞內(nèi)GA溢出，有時產(chǎn)酸會反而偏高，會使噬菌體忽視，這很危險。仍需注意采取措施加以防治。88四．谷氨酸發(fā)酵的代謝控制育種1.日常菌種工作①定期分純②小劑量誘變刺激：可淘汰生長微弱的菌株。③高產(chǎn)菌制做安培瓶。2.選育耐高滲透壓菌株①耐高糖選育在20-30％葡萄糖的平板上生長好的突變株。②耐高谷氨酸選育在15-20％味精的平板上生長好的突變株。③耐高糖、高谷氨酸選育在20％葡萄糖，加15％味精的平板上生長好的突變株。893.選育不分解利用谷氨酸的突變株使用不分解利用GA，切斷繼續(xù)向下氧化的反應，即選育以谷氨酸為唯一碳源，菌體不長或生長微弱的突變株。平板法：選育不長或生長微弱的菌。搖瓶法：選育OD值凈增極少的菌。904.選育細胞膜滲透性好的突變株①抗VP類衍生物②選育溶菌酶敏感性突變株③選育二氨基庚二酸缺陷型突變株二氨基庚二酸為細胞壁的組成成分④選育溫度敏感突變株915.選育強化CO2固定反應的突變株①選育以琥珀酸為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長快、大的菌株②選育氟丙酮酸敏感性突變株氟丙酮酸是丙酮酸脫氫酶的抑制劑，菌種對氟丙酮酸越敏感，說明菌種丙酮酸向乙酰CoA的轉(zhuǎn)化反應越弱，相對地固定反應占的比例也就越大。926．選育減弱乙醛酸循環(huán)的突變株四碳二羧酸是由CO2固定反應和乙醛酸循環(huán)所提供的，減弱乙醛酸循環(huán)，固定反應所占的比例就會增大，谷氨酸的產(chǎn)率就高①選育琥珀酸敏感型突變型琥珀酸是乙醛酸循環(huán)關(guān)鍵酶異檸檬酸裂解酶的阻遏物，菌體對琥珀酸越敏感，異檸檬酸裂解酶的合成能力就越弱，乙醛酸循環(huán)就越弱。②選育不利用醋酸的突變株。937.選育強化TCA中從檸檬酸到代謝的突變株①選育檸檬酸合成酶強的突變株檸檬酸合成酶是三羧酸循環(huán)的關(guān)鍵酶，強化該酶能加強GA的生物合成。②選育抗氟乙酸、氟化鈉、氮雜絲氨酸、氟檸檬酸等突變株這些物質(zhì)都是烏頭酸酶的抑制劑，抗這些物質(zhì)的突變株，可強化烏頭酸酶的活力948.選育解除谷氨酸對谷氨酸脫氫酶反饋調(diào)節(jié)的突變株谷氨酸比天冬氨酸優(yōu)先合成①選育酮基丙二酸抗性突變株②選育耐高谷氨酸突變株③選育抗谷氨酸結(jié)構(gòu)類似物突變株④選育抗谷氨酰胺的突變株959.選育強化能量代謝的突變株GA高產(chǎn)菌的兩個顯著的特點是繼續(xù)向下氧化的能力缺陷和乙醛酸循環(huán)微弱，使得GA菌能量代謝受阻，TCA前一段的代謝（檸檬酸合成到生成）減慢，強化能量代謝可補救上述兩個特點造成的不足，使TCA前一段的代謝加強，GA合成的速度加強。①抗呼吸鏈抑制劑突變株如抗丙二酸，氧化丙二酸，氰化鉀等的突變株②抗ADP磷酸化抑制劑突變株，如抗2.4-二硝基酚、羥胺、砷、胍等的突變株③抗抑制能量代謝抗生素的突變株，如抗纈氨霉素、寡霉素等突變株9610.選育減弱HMP途徑后段酶活性的突變株∵通過HMP途徑也可生成核糖、核苷酸、莽草酸、芳香族氨基酸、輔酶Q、葉酸等物質(zhì)。這些物質(zhì)生成消耗了葡萄糖，使谷氨酸的產(chǎn)率降低。如果削弱或切斷這些物質(zhì)的合成，就會使Glu的產(chǎn)率增加①選育莽草酸缺陷型或添加芳香族AA能促進生長的突變株②選育抗嘌呤、嘧啶類似物突變株③選育抗核苷酸類抗生素突變株，如抗德夸菌素、狹霉素C等突變株。97五．菌種的擴大培養(yǎng)和種子質(zhì)量要求斜面菌株→一級種子培養(yǎng)→二級種子培養(yǎng)→發(fā)酵罐㈠菌種的擴大培養(yǎng)斜面菌種的培養(yǎng)有利于菌種生長而不長酸，并要求斜面菌種絕對純，不得有雜菌、噬菌體，培養(yǎng)基以多含有機氮而不含或少糖為原則。①斜面培養(yǎng)基葡萄糖0.1％蛋白胨1.0％牛肉膏1.0％氯化鈉0.5％瓊脂2.0-2.5％PH7.0-7.2％②培養(yǎng)條件7338、B930-32℃T6-1333-34℃培養(yǎng)18-21h要求菌苔顏色、邊緣正常，斜面只移接三代不宜多次移種。982.一級種子培養(yǎng)目的：培養(yǎng)大量繁殖活力強的菌體①培養(yǎng)基組分：少含糖分，多含有機氮以有利長菌考慮葡萄糖2.5％尿素0.5%硫酸鎂0.04%磷酸氫二鉀0.1%玉米漿2.5-3.5%（按質(zhì)增減）FeSO42ppmMnSO42ppmPH7.099②培養(yǎng)條件1000ml三角瓶裝200ml,滅菌后置于沖程7.6cm頻率96次/min往復式搖床上振蕩培養(yǎng)12h7338B930-32℃T6-1333-34℃③一級種子質(zhì)量要求：種齡12hPH值6.4±0.1光密度凈增OD值0.5以上殘?zhí)?.5%以下無菌檢查㈠噬菌體檢查：無鏡檢：菌體生長均勻、粗壯、排列整齊。100

3.二級種子培養(yǎng)種子罐容積大小取決于發(fā)酵罐大小和接種量比例①培養(yǎng)基組成在實際生產(chǎn)中應根據(jù)菌體生長情況酌情增減生物素等用量，隨時調(diào)整培養(yǎng)基組成。②培養(yǎng)條件接種量0.8-1.0%培養(yǎng)溫度32℃（T6-13菌為33-34℃）培養(yǎng)時間7-8h）101通風量：50l種子罐1：0.5攪拌轉(zhuǎn)速340r/min250l種子罐1：0.3攪拌轉(zhuǎn)速300r/min500l種子罐1：0.25攪拌轉(zhuǎn)速230r/min（通風量：空氣體積/單位體積發(fā)酵液·單位時間m3/m3.min)③二級種子質(zhì)量要求種齡7-8hPH7.2左右OD值凈增0.5左右（OD是opticaldensity(光密度)）（DO是dissolvedoxygen;DO（溶解氧））

無菌檢查㈠噬菌體檢查（無）殘?zhí)?.1%左右鏡檢：生長旺盛排列整齊102㈡影響種子質(zhì)量的主要因素①培養(yǎng)基構(gòu)成種子培養(yǎng)基要求含有豐富的N源，足夠的生物素少量C源，以利于菌體生長，如糖太多，菌代謝活動旺盛，產(chǎn)生有機酸，使PH降低菌易衰老。②溫度：幼齡菌對溫度變化敏感，應避免溫度過高和波動過大。③PH值：零小時時PH值不宜過高，培養(yǎng)結(jié)束時PH值不宜過低，PH上升后有所下降時，培養(yǎng)時間已接近結(jié)束。④溶解氧：長菌階段對氧要求比發(fā)酵時低，溶氧水平過高，抑制長菌。⑤接種量：以1%為宜。⑥培養(yǎng)時間：7~8h。103第五節(jié)淀粉水解糖制備一、意義及要求：1、意義：碳源是構(gòu)成谷氨酸的碳架（主要作用），同時產(chǎn)生能量。可用于谷氨酸發(fā)酵是淀粉糖、糖蜜，還有醋酸，這些原料一般要預處理;因為谷氨酸產(chǎn)生菌不能直接利用淀粉，因而必水解之。糖蜜的預處理:目的是降低生物素的含量，因為含有過量的生物素會影響谷氨酸的積累。處理方法有：活性炭處理、水解活性炭處理、樹脂處理。104磷酸鹽、玉米漿、鎂鹽等分過濾器發(fā)酵灌調(diào)和配料預處理（水解）發(fā)酵培養(yǎng)基調(diào)pH連消菌種罐等電沉淀粗谷氨酸中和搖瓶菌種原料種子培養(yǎng)基空氣斜面尿素貯罐空氣凈化系統(tǒng)脫色結(jié)晶濃縮成品味精

谷氨酸發(fā)酵工藝流程105淀粉葡萄糖糖蜜稀釋蜜配料種子罐玉米漿糖蜜磷酸二氫鉀硫酸鎂無菌空氣Fe2+、Mn2+NH3菌種發(fā)酵罐106等電提取中和除鐵脫色濃縮、結(jié)晶離心干燥味精發(fā)酵罐Na2CO31072、淀粉水解糖液必須具備要求：滿足以下條件：①含糖量﹥16%②糖液清凈③糖液不含糊精④糖液不變質(zhì)⑤透光率：90%以上

⑥轉(zhuǎn)化率：90%左右水解糖液數(shù)量（升）

含糖量（%）

100%轉(zhuǎn)化率=投入淀粉量（公斤）

原料淀粉中含純淀粉%

1.11DE值即葡萄糖值。用以表示淀粉水解程度及糖化程度，指的是葡萄糖（所有測定的還原糖權(quán)當作葡萄糖來計算）占干物資的百分率。即：DE值=×100%

還原糖用斐林氏法或碘量法測定，干物質(zhì)用阿貝折光儀測定。在此值得注意的是，阿貝折光儀所測出的濃度是指100g糖液中所含有的干物質(zhì)的克數(shù)；而還原糖含量是指100ml糖液中所含有的還原糖的克數(shù)。因此，DE值實際還應除以糖液的相對密度。108DX值：糖化液中的葡萄糖含量占干物質(zhì)的百分率稱為DX值。DX值=葡萄糖含量（%）/干物質(zhì)含量（%）×糖液相對密度×100%DE值與DX值的區(qū)別：葡萄糖的實際含量稍低于葡萄糖值，因為還有少量的還原性低聚糖存在。隨著糖化程度的增高，兩者的差別減少。109二、淀粉水解糖的制備方法1、酸解法：原理：以無機酸或有機酸為催化劑，在高溫高壓下將淀粉轉(zhuǎn)化為葡萄糖的方法。特點：生產(chǎn)方便，設備簡單，水解時間短，設備生產(chǎn)能力大。要求設備耐腐蝕、耐高溫、耐高壓，對原料要求嚴格、易發(fā)生付反應、淀粉轉(zhuǎn)化率低。110

淀粉的水解反應淀粉水解總的趨勢是大分子向小分子轉(zhuǎn)化，隨著淀粉水解程度的增加，糖化液的還原性不斷增加。淀粉(amylum)糊精(dextrin)低聚糖(oligosaccharides)葡萄糖(glucose)淀粉水解的化學反應可簡單表示如下：（C6H10O5)n+nH2On(C6H12O6)由于有水參與，反應結(jié)果有化學增重。理論上，淀粉轉(zhuǎn)化為葡萄糖的轉(zhuǎn)化率為180.16/162.14100%=111.1%實際轉(zhuǎn)化率只有90%。當葡萄糖值超過60時，由于葡萄糖復合分解反應產(chǎn)生其他有味物質(zhì)（龍膽二糖有苦味）及有色物質(zhì)。

111淀粉水解的副反應

葡萄糖的復合反應水解熱、酸-1，6鍵聚合成異麥芽糖淀粉葡萄糖糖苷鍵聚合

-1，6鍵聚合成龍膽二糖復合反應有害，降低葡萄糖收率。多數(shù)復合糖不能被微生物利用。殘?zhí)嵌啵a(chǎn)物提取精制困難。112

葡萄糖的分解反應水解熱、酸淀粉葡萄糖分解5-羥甲基糠醛甲酸、乙酰丙酸、有色物質(zhì)。

在淀粉的酸水解過程中，葡萄糖因分解損失的量在1%，但5-羥甲基糠醛是產(chǎn)生色素的根源，增加精制的困難。5-羥甲基糠醛的含量高，則色素的形成量增多。反應中形成的氨基糖，也對發(fā)酵有影響。

1132、酶解法（酶酸法）：原理：先將淀粉乳用α-淀粉酶液化，然后用酸將其水解成葡萄糖。適用性：適于大米或粗淀粉原料，可省去其精制過程，避免淀粉在加工過程中的流失。特點：條件溫和，副產(chǎn)物少，原料要求粗放，對微生物生產(chǎn)菌生長有利，糖液質(zhì)量高。但時間長，過濾困難，設備多。1143、雙酶法：原理：先用淀粉酶將原料水解成糊精或低聚糖，再用糖化酶將后者水解成葡萄糖。特點：水解條件溫和，不要求設備耐腐蝕、耐高溫、耐高壓，對原料要求粗放，但生產(chǎn)周期長。1154、酸酶法

原理：先將淀粉水解成糊精或低聚糖，再用糖化酶將其水解成葡萄糖。適用性：淀粉顆粒較堅硬，用酶水解需較長時間的原料。如玉米、小麥等谷物淀粉。特點：酸液化速度快，產(chǎn)品顏色淺、糖液質(zhì)量高，但水解時間較長。116

三、酸解法制糖工藝

1.酸解法制糖原理以酸為催化劑，在高溫條件下，淀粉發(fā)生水解反應，-1，4糖苷鍵和-1，6糖苷鍵被切斷，淀粉鏈逐漸變短，淀粉先變?yōu)楹⒌途厶?、麥芽糖，最后生成葡萄糖。在整個水解過程中，由于受酸和熱的作用，一部分葡萄糖發(fā)生復合反應和分解反應，如下所示：復合反應分解反應復合低聚糖葡萄糖有機酸、有色物↑淀粉1172.淀粉酸水解工藝

⑴工藝流程原料（淀粉、水、酸）→調(diào)漿→糖化→冷卻→中和、脫色→濾除雜→糖液⑵水解條件在淀粉酸解過程中，必須先將淀粉原料調(diào)成粉漿，保持一定的濃度和酸度，然后將料液泵入糖化鍋，在一定條件下進行水解糖化。118①淀粉乳濃度的選擇淀粉水解時，淀粉乳的濃度越低，水解液的葡萄糖值越高，糖液色澤越淺。淀粉乳的濃度高，易發(fā)生復合分解反應，故一般控制在10~11

Be’。②酸的種類和影響常用的酸：鹽酸、硫酸和草酸。催化效率：鹽酸最強，其次是硫酸、草酸。119催化能力強，但中和后產(chǎn)生氯化物，增加糖液灰分，影響結(jié)晶、分離和收率。顏色淺。催化能力較強，但用硫酸鈣中和時,生成的硫酸鈣在蒸發(fā)時易生成結(jié)垢，影響傳熱。催化能力較低，用碳酸鈣中和時，生成的草酸可基本除去，糖液純度高，顏色淺。鹽酸硫酸草酸120酸的添加方法添加方法不同，對水解有很大影響。一般是先將1/3左右的酸用水稀釋后放入鍋內(nèi)，其余酸放入粉漿中，再泵入糖化鍋進行糖化。

酸的添加量和添加法加酸量——以淀粉乳的pH值為指標，當采用10~11

Be’的淀粉乳時，加鹽酸0.5-0.8％，控制pH值在1.5左右。121③壓力和時間的選擇糖化壓力與水解反應速度成正比，壓力升高，水解反應速度加快，反應時間短；反之，壓力降低，反應時間加長。高溫短時間是最佳的水解方法，蒸汽壓力一般為245~392KPa。④糖化設備的選擇糖化鍋的結(jié)構(gòu)對糖液質(zhì)量有直接的影響。若糖化鍋的體積太大，進出料的時間長，使淀粉水解時間差別大，部分先水解的生成的葡萄糖易發(fā)生復合分解反應。因此，一般味精廠采用的糖化鍋徑高比為1：1.5~2.5。122⑶水解糖液的中和、脫色和除雜在淀粉水解的同時，淀粉原料中的其它物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、脂肪、纖維素、無機鹽等也發(fā)生變化，所生成的物質(zhì)影響糖液的純度。如氨基酸能與葡萄糖的分解產(chǎn)物反應，形成色素，使糖液色澤加深。故水解糖液必須加以中和、脫色和除雜。①中和淀粉水解糖化后，糖化液溫度很高（140~150℃），經(jīng)冷卻后才能中和。中和的目的是降低糖化液酸度，調(diào)節(jié)pH值。生產(chǎn)中常用的中和劑有純堿、氫氧化鈉溶液，中和溫度控制在80℃，終點pH控制在4.0~5.0。123②脫色和除雜水解糖液中的雜質(zhì)不僅對谷氨酸發(fā)酵不利，而且影響谷氨酸的提純。糖液脫色方法活性炭吸附法離子交換樹脂脫色法。活性炭的用量為0.2%~0.8%，脫色溫度為70~80℃。在脫色過程中要保證一定時間的攪拌，使活性炭充分起作用。124三、雙酶法制糖工藝雙酶法制糖工藝主要包括淀粉的液化和糖化兩個步驟。1.淀粉的液化在-淀粉酶的作用將淀粉水解生成糊精和低聚糖。⑴升溫液化法將淀粉乳（30%~40%）調(diào)整pH為6.0~6.5，加入CaCl2，使Ca2+達到0.01mol/l，加入定量的液化酶，在保持劇烈的攪拌下，加熱到80~90℃，保持30min左右，達到所需的液化程度，然后升溫至100℃，滅酶10min。淀粉液化的方法升溫液化法、高溫液化法、噴射液化法和分段液化法。1252.糖化⑵高溫液化法將淀粉調(diào)整好pH和Ca2+濃度，加入所需的液化酶，用泵將其打入液化桶（桶內(nèi)有90℃的熱水），淀粉受熱糊化、液化。由桶底流入保溫桶，90℃保溫40min,達到所需的液化程度。糖化溫度和pH取決于所用糖化劑的性質(zhì)，若用曲霉糖化劑，溫度控制60℃，pH為4.0~4.5；若用根霉糖化劑，溫度控制在55℃，pH為5.0以下。在實際生產(chǎn)中，根據(jù)酶的特性，盡量選用較高的糖化溫度，這樣可以加快糖化速度，減少雜菌污染的機會。126第六節(jié)谷氨酸發(fā)酵控制谷氨酸產(chǎn)生菌能在體外大量累積GA。首先是菌的代謝調(diào)節(jié)異?；?，即具有一定生理特性的菌種是產(chǎn)生谷氨酸的內(nèi)因和根據(jù)。這種異?；x的菌種對環(huán)境條件是敏感的。生產(chǎn)菌合成GA比生物合成Pr、核酸等菌體成分需要更多的能量。127在最適宜的培養(yǎng)條件下GA產(chǎn)生菌可把60%以上的葡萄糖轉(zhuǎn)化為GA，而只有極少量的副產(chǎn)物。與之相反，如果培養(yǎng)條件不適宜，幾乎不產(chǎn)生GA，而得到大量菌體或由谷氨酸發(fā)酵轉(zhuǎn)換為累積乳酸、琥珀酸、α-酮戊二酸、纈氨酸、谷氨酰胺、N-乙酰谷酰胺等。這些現(xiàn)象稱為：發(fā)酵轉(zhuǎn)換。菌種性能越高，使其表達接近它應有的生產(chǎn)潛力所必須的條件越難滿足，對環(huán)境波動更為敏感，可見環(huán)境條件的控制對GA發(fā)酵成敗的重要性。128谷氨酸產(chǎn)生菌因環(huán)境條件的發(fā)酵轉(zhuǎn)換控制因子發(fā)酵轉(zhuǎn)換氧乳酸或琥珀酸谷氨酸α-酮戊二酸（供氧不足）（供氧充足）（氧過量）生物素乳酸或琥珀酸谷氨酸（充足）（限量）NH4+α-酮戊二酸谷氨酸谷酰胺（不足）（適量）（過量）PHN-乙酰谷酰胺谷氨酸（酸性）（中性或微堿性）磷纈氨酸谷氨酸（高濃度）（適量）129130一．發(fā)酵培養(yǎng)基不同于種子培養(yǎng)基，其需大量C、N源，以供合成GA，但生物素卻需控制用量。發(fā)酵工業(yè)原料主要指發(fā)酵培養(yǎng)基中較大宗成分，其選擇要考慮到菌體生長繁殖需要，更要注意到有利于大量積累GA。還要注意原料來源豐富、價格便宜、發(fā)酵周期短、對產(chǎn)物提取無妨礙。131㈠碳源1、作用：菌體和GA的碳架和能量的來源2、種類：糖類、脂肪、某些有機酸、某些酸類和烴類。生產(chǎn)上以淀粉水解糖為碳源的發(fā)酵。1323、要求：①糖濃度一定范圍下GA產(chǎn)量隨糖濃度增加而增加，但糖濃度過高，工藝條件不配合，谷氨酸對糖的轉(zhuǎn)化率低，同時氧溶解的阻力大影響供氧效率。國內(nèi)125-150g/l(12.5-15%)糖，產(chǎn)酸55-70g/l(5.5-7.0%).一次高糖發(fā)酵工藝糖170-190g/l(17-19%)，產(chǎn)酸可達80g/l但周期長，采用低糖流加。②淀粉水解糖質(zhì)量對谷氨酸發(fā)酵影響很大。（1）淀粉水解不足（糊精存在）——則浪費，再會使使泡沫過多，影響發(fā)酵。（2）淀粉水解過分葡萄糖復合生成龍膽二糖、異麥芽糖等非發(fā)酵生糖或葡萄糖發(fā)生分解反應。133㈡氮源1．作用：合成菌體蛋白質(zhì)、核酸等含氮物質(zhì)和合成GA的氨基的來源，同時在發(fā)酵過程中一部分用于調(diào)節(jié)PH。所以需要的N源比一般工業(yè)高。一般發(fā)酵工業(yè)C/N為100：0.2-2.0。谷氨酸C/N為100：15-30。當C/N比在100：11以上才開始積累GA。C/N比對發(fā)酵影響很大。134在GA發(fā)酵中合成菌體的N占總耗用氮3-8%，而30-80%用于合成谷氨酸。

長菌：NH4+過量會抑制菌生長。產(chǎn)酸：NH4+不足不能形成GA而積累α-酮戊二酸。135①無機氮：尿素、液氨、碳酸氫銨、硫酸銨、氯化銨和硝酸銨等菌利用無機氮比有機氮快，銨鹽、尿素、氨水等比硝基氮快常用無機氮有以下幾種：㈠尿素但滅菌溫度過高，時間過長，產(chǎn)生縮脲反應生成雙縮脲和氨。高濃度尿素溶液具抑制菌作用，尿素滅菌溫度不宜高。工廠尿素配成40%，100℃滅菌。136尿素在GA發(fā)酵中作用：⑴組成菌體含氮物質(zhì)⑵組成GA的氨基⑶調(diào)節(jié)PH值形成谷氨酰胺?？煞峙骷印０彼胮H自動控制連續(xù)流加。137例：發(fā)酵初糖140g/l總尿為38.5g/l谷氨酸產(chǎn)量為68g/l用于形成谷氨酸銨的尿素占總尿的百分比為式中60、147分別為尿素和谷氨酸的分子量138當發(fā)酵液中干菌體含量為10g/l干菌體合氮量為16%。用于合成菌體所消耗的尿素為∴上述情況下形成谷氨酸氨僅占總尿36%，調(diào)節(jié)PH也占36%，合成菌體的僅5.56%。139⑵液氨含氨量99-99.8%也可用氨水含氨量20-25%⑶NH4HCO3含氮17.6%②有機氮主要為蛋白質(zhì)、胨、氨基酸等，谷氨酸發(fā)酵的有機氮源常用玉米漿、麩皮水解液、米糠水解液、豆餅水解液和糖蜜。有機氮利于長菌，GA發(fā)酵對有機氮需要量不多。140㈢無機鹽1．磷是某些Pr和核酸的組成成分。常用和也可用磷酸。磷過高菌體代謝轉(zhuǎn)向合成纈氨酸磷過低，菌生長、糖代謝不好2．Mg是糖磷酸化酶、檸檬酸脫氫酶和羧化酶的激活劑，要求最低為25ppm。硫是構(gòu)成一些酶的活性基。存在于細胞蛋白質(zhì)中，培養(yǎng)基中S已在MgSO4中供給，不必另加。1413．鉀鹽K是許多酶的激活劑，可促進糖代謝，菌生長需鉀約為0.1g/l（以K2SO4計，下同）GA生成需0.2-1.0g/l。鉀少長菌體，鉀多產(chǎn)GA（培養(yǎng)基配1g/lK2HPO4鉀濃度約為0.38g/l，鈉在培養(yǎng)基中起調(diào)節(jié)滲透作用，一般在調(diào)節(jié)pH時已加入足夠量，不必另外加）1424．微量元素微生物需要量十分微小，但又不可完全沒有的物質(zhì)。Fe2+是細胞色素、細胞色素氧化酶和過氧化氫酶的活性基的組成成分，F(xiàn)e2+2ppmMn2+是某些酶的激活劑，羧化反應需錳。草酰琥珀酸脫羧生成α-酮戊二酸是在Mn2+存在下完成的MnSO4·4H2O2ppm5．有害元素Hg、Cu2+SO4對氨基酸發(fā)酵有明顯毒害作用。143㈣生長因子廣義來講，凡是微生物生長不可缺少的微量的有機物。如：AA、嘌呤、維生素等都可稱為生長因子。生長因子不是所有微生物都必需的，只是某些自己不能合成的才是必需的。目前以糖質(zhì)原料為C源的谷氨酸生產(chǎn)菌均為生物素缺陷型，以生物素為生長因子，有些菌株還以硫胺素為生長因子，有些變異株油酸缺陷型還以油酸為生長因子。1441．生物素作用：影響GA產(chǎn)生菌細胞膜透性及代謝途徑。菌體從培養(yǎng)液中吸取生物素的速度是很快的，遠遠超過菌體繁殖所消耗的生物素量生物素為VB的一種叫VH或輔酶R1452．維生素B1（硫胺素）對某些GA菌種發(fā)酵有促進（如7338）3．提供生長因子的農(nóng)副產(chǎn)品原料①玉米漿：亞硫酸浸泡玉米而得的浸泡水濃縮物，一般用量0.4-0.8%，含豐富生物素等。②麩皮水解液：可代替玉米漿，但Pr、AA等營養(yǎng)成分比玉米漿少，用量1%左右。③糖蜜：可代替玉米漿但AA、有機氮低、甘蔗糖蜜用量0.1-0.4%④酵母：酵母膏酵母浸出粉146二．pH值對GA發(fā)酵的影響pH值常以以下幾方面影響微生物的生長和代謝產(chǎn)物形成⑴影響酶活性⑵影響微生物細胞膜所帶電荷⑶影響培養(yǎng)基某些營養(yǎng)物中間代謝產(chǎn)物的離解，影響微生物對這些物質(zhì)的利用⑷PH值的變化往往引起代謝途徑的改變147國內(nèi)味精廠采用尿素流加法來控制PH值優(yōu)點：由于尿素的分解、利用及PH值變化有一定規(guī)律性容易控制流加量和次數(shù)根據(jù)：1。PH值的變化2。菌生長耗糖，發(fā)酵的不同階段來決定菌生長緩慢、耗糖慢，應少量多次，pH值稍低以利長菌，尿酶活力較弱，耐尿力強，可初尿多，流加量多，次數(shù)少。前期PH7.5（控制雜菌）中期7.2后期7.0放罐