番茄膜聯(lián)蛋白SlAnn5：抗煙粉虱的功能剖析與機制探索

番茄膜聯(lián)蛋白SlAnn5：抗煙粉虱的功能剖析與機制探索一、引言1.1研究背景1.1.1煙粉虱對番茄的危害煙粉虱（Bemisiatabaci）屬半翅目粉虱科，是一種世界性的重大農業(yè)害蟲，被世界糧農組織認定為全球第二大農業(yè)害蟲，有“超級害蟲”的惡名。其寄主范圍極為廣泛，涵蓋了600多種植物，包括茄科、葫蘆科、十字花科等多種蔬菜作物，以及棉花、玉米、豆科及多種花卉。在眾多寄主中，番茄是受煙粉虱危害較為嚴重的作物之一。煙粉虱對番茄的危害主要體現(xiàn)在三個方面。其一，煙粉虱通過口針刺吸番茄韌皮部，取食植物維管束中的營養(yǎng)物質，干擾番茄的正常生長。大量煙粉虱的取食會導致番茄植株生長遲緩、葉片發(fā)黃、萎蔫，嚴重時甚至整株死亡，直接影響番茄的產量和品質。其二，煙粉虱在取食過程中會分泌蜜露，蜜露覆蓋在番茄葉片和果實表面，易誘發(fā)煤污病。煤污病不僅影響番茄的光合作用，還會降低果實的商品價值，使果實表面失去光澤，品質下降。其三，煙粉虱能夠傳播多種植物病毒病，這是其對番茄危害最為嚴重的方式。煙粉虱可傳播包括番茄黃化曲葉病毒（TYLCV）、番茄褪綠病毒（ToCV）等雙生病毒在內的200多種植物病毒病。例如，由煙粉虱傳毒引起的番茄黃化曲葉病毒病在多個番茄產區(qū)相繼暴發(fā)，給番茄生產造成了巨大損失。2009年，入侵煙粉虱傳番茄雙生病毒病在13個省市大暴發(fā)成災，嚴重發(fā)病田塊病株率達95%以上，許多地區(qū)的番茄幾乎絕收。在福建省，煙粉虱傳播雙生病毒引起番茄黃化曲葉病毒病的暴發(fā)流行，致使番茄產量和品質降低，嚴重時產量損失可達90%以上甚至絕收。隨著全球氣候變暖以及設施農業(yè)的快速發(fā)展，煙粉虱的發(fā)生范圍不斷擴大，危害程度日益加重。在我國，煙粉虱自20世紀90年代入侵以來，已迅速擴散至全國各地，對番茄種植產業(yè)構成了嚴重威脅。在北方地區(qū)，設施番茄為煙粉虱提供了適宜的越冬場所，使其能夠周年發(fā)生，危害時間延長；在南方地區(qū)，溫暖濕潤的氣候條件有利于煙粉虱的繁殖和生長，種群數量迅速增長。因此，有效解決煙粉虱對番茄的危害問題，對于保障番茄種植產業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有至關重要的意義。1.1.2化學防治煙粉虱的弊端長期以來，化學防治一直是控制煙粉虱的主要手段?；瘜W農藥具有快速高效、使用方便等優(yōu)點，在煙粉虱防治初期確實取得了一定的效果。然而，隨著化學農藥的長期大量使用，其弊端也日益凸顯。首先，煙粉虱對多種化學農藥產生了抗藥性。由于煙粉虱繁殖速度快、世代周期短，且在田間頻繁接觸化學農藥，導致其對有機磷、氨基甲酸酯、擬除蟲菊酯等傳統(tǒng)殺蟲劑以及新煙堿類等新型殺蟲劑都產生了不同程度的抗藥性。在一些地區(qū)，煙粉虱對常用殺蟲劑的抗性倍數已達到幾十倍甚至上百倍，使得化學農藥的防治效果大打折扣。例如，在江蘇、浙江等地，煙粉虱對吡蟲啉、噻蟲嗪等新煙堿類殺蟲劑的抗性水平較高，田間防效明顯下降。其次，化學農藥的使用導致蔬菜農藥殘留超標，嚴重威脅食品安全。消費者食用了農藥殘留超標的番茄，可能會對身體健康造成潛在危害，引發(fā)各種疾病。近年來，因蔬菜農藥殘留問題引發(fā)的食品安全事件時有發(fā)生，引起了社會的廣泛關注。此外，化學農藥的大量使用還會對環(huán)境造成嚴重污染。農藥殘留會進入土壤、水體和大氣中，破壞生態(tài)平衡，影響非靶標生物的生存和繁衍。例如，化學農藥可能會殺死害蟲的天敵，如捕食性昆蟲、寄生性昆蟲等，導致害蟲的自然控制作用減弱，進一步加劇煙粉虱的危害。同時，農藥的使用還會對土壤微生物群落結構和功能產生負面影響，降低土壤肥力，影響土壤生態(tài)系統(tǒng)的健康。綜上所述，化學防治煙粉虱帶來的抗藥性、農藥殘留和環(huán)境污染等問題，已嚴重制約了番茄種植產業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。因此，尋求綠色、安全、有效的煙粉虱防控技術迫在眉睫。1.1.3植物抗蟲基因研究進展在植物和昆蟲漫長的共同進化過程中，植物進化出了復雜的防御機制來抵抗植食性昆蟲，包括物理和化學的組成型防御、直接或間接的誘導型防御。組成型防御是指植物用本身固有的物理和化學屏障來阻礙昆蟲的取食，如植物表面的刺、毛狀體和角質層等。誘導型防御是指植物在受到植食性昆蟲為害后產生的防御反應，一種是植物直接產生防御蛋白或有毒次生代謝物的防御，包括芥子油苷、生氰糖苷、生物堿、酚類和蛋白酶抑制劑等，起到毒素、驅蟲或抗消化的作用；另一種是植物通過釋放揮發(fā)物和花蜜吸引寄生蜂等天敵昆蟲的間接防御。一般而言，植食性昆蟲的取食會激發(fā)一系列植物的信號級聯(lián)反應，植物可以識別植食性昆蟲/損傷/微生物相關的分子模式(herbivore-/damage-/microbe-associatedmolecularpattern，HAMP/DAMP/MAMP)并作出相應的防御。植物通過復雜的動態(tài)防御系統(tǒng)來應對植食性昆蟲的攻擊，這種高度動態(tài)的防御機制是從識別昆蟲的口腔分泌物和損傷植物細胞傳遞的信號開始啟動的，這些初始的信號通過信號轉導途徑在植物中傳遞，包括鈣離子流、磷酸化級聯(lián)，以及在廣譜抗蟲性中發(fā)揮重要作用的茉莉酸信號途徑。植物對刺吸式口器昆蟲的防御得到了廣泛的研究，到目前為止，植物體內的刺吸式口器昆蟲抗性基因已有諸多報道，例如，在番茄中，mi基因能夠介導植物對煙粉虱和蚜蟲的抗性；在受到煙粉虱的侵染后，辣椒中膜聯(lián)蛋白CaAnnD4-like的表達量明顯上升；干擾掉轉錄因子GhWRKY81和GhWRKY70表達的棉花在受到煙粉虱侵染時，對煙粉虱的抗性明顯降低；RNAi干擾擬南芥CP基因后，蚜蟲的繁殖力明顯下降；蚜蟲取食小麥后，蚜蟲抗性基因Dnx通過調節(jié)植株內固醇和茉莉酸酯的含量、Ca2+信號途徑傳導、脫落酸和赤霉素水平實現(xiàn)小麥對蚜蟲的防御。挖掘植物中更多抗刺吸式口器昆蟲的基因，對于抗蟲植株的育種有著深遠的指導意義。其中，膜聯(lián)蛋白在植物應對生物脅迫中的功能逐漸受到關注，其在植物抗蟲中的作用研究也為植物抗蟲機制的解析提供了新的方向。1.2研究目的與意義本研究旨在深入探究番茄膜聯(lián)蛋白SlAnn5的抗煙粉虱功能，從分子、生理和生化等多個層面揭示其抗蟲機制，為番茄抗煙粉虱育種提供新的基因資源和理論依據。具體研究目的如下：明確SlAnn5基因在番茄抗煙粉虱過程中的作用：通過基因編輯技術，如CRISPR/Cas9，敲除番茄中的SlAnn5基因，獲得基因敲除突變體；同時，利用轉基因技術，構建SlAnn5過表達番茄植株。通過比較野生型、基因敲除突變體和過表達植株在煙粉虱侵染后的生長狀況、煙粉虱的取食行為、繁殖能力等指標，明確SlAnn5基因對番茄抗煙粉虱能力的影響。解析SlAnn5抗煙粉虱的分子機制：研究煙粉虱侵染后，SlAnn5基因的表達模式變化，以及SlAnn5蛋白在番茄細胞中的定位和相互作用蛋白。利用轉錄組測序、蛋白質組學等技術，分析SlAnn5基因調控下的番茄差異表達基因和差異表達蛋白，揭示SlAnn5參與的信號轉導途徑和代謝通路，從而深入解析其抗煙粉虱的分子機制。評估SlAnn5在番茄抗煙粉虱育種中的應用潛力：將SlAnn5基因導入優(yōu)良番茄品種中，培育具有抗煙粉虱特性的轉基因番茄植株。通過田間試驗，評估轉基因番茄植株的抗煙粉虱效果、農藝性狀和品質性狀，為SlAnn5基因在番茄抗煙粉虱育種中的實際應用提供科學依據。本研究對于深入理解植物與昆蟲的相互作用機制，推動番茄抗煙粉虱育種技術的發(fā)展，具有重要的理論和實踐意義。理論意義：膜聯(lián)蛋白在植物抗蟲領域的研究相對較少，本研究聚焦于番茄膜聯(lián)蛋白SlAnn5的抗煙粉虱功能，有助于填補這一領域的研究空白。通過解析SlAnn5的抗蟲分子機制，可以豐富植物抗蟲的理論體系，為進一步研究植物與昆蟲的協(xié)同進化提供新的視角。研究結果還可能揭示新的植物抗蟲信號轉導途徑和調控網絡，為其他植物抗蟲基因的挖掘和功能研究提供參考。實踐意義：煙粉虱對番茄產業(yè)造成了嚴重的經濟損失，化學防治帶來的諸多問題限制了其可持續(xù)發(fā)展。本研究若能成功揭示SlAnn5的抗煙粉虱功能和機制，將為番茄抗煙粉虱育種提供新的基因資源。利用該基因培育抗煙粉虱的番茄新品種，不僅可以減少化學農藥的使用，降低生產成本，還能提高番茄的產量和品質，保障食品安全和生態(tài)環(huán)境。這對于推動番茄產業(yè)的綠色可持續(xù)發(fā)展具有重要的實踐意義，有望在農業(yè)生產中發(fā)揮重要作用，為農民增收和農業(yè)增效提供有力支持。二、煙粉虱與番茄的相互作用2.1煙粉虱的生物學特性2.1.1形態(tài)特征煙粉虱屬漸變態(tài)昆蟲，個體發(fā)育歷經卵、若蟲、成蟲3個階段，其中若蟲又分為3齡，通常將第3齡若蟲蛻皮后形成的蛹稱為偽蛹或擬蛹。卵：呈長梨形，長約0.20mm，寬約0.095mm，有光澤，基部具有小柄，與葉面垂直，卵柄通過產卵器插入葉表裂縫中，這不僅起到附著作用，在授精時還能導入精子。卵大多不規(guī)則散產于葉背面，少數見于葉正面，初產時為淡黃綠色，隨著發(fā)育，顏色逐漸加深，孵化前呈深褐色。若蟲：1齡若蟲體長約0.29mm，體寬約0.16mm，淡綠色至黃色，具有足和觸角，能活動，孵化時體軀半彎，前足抓住葉片后脫掉卵殼，腹末端有一對明顯剛毛，有3對足，在找到合適的取食位點后便固定取食，直至成蟲羽化。2、3齡時，若蟲的足和觸角退化至只有一節(jié)，固定在植株上取食。3齡若蟲蛻皮后形成偽蛹，蛻下的皮硬化成蛹殼。偽蛹：蛹殼呈淡黃色，長0.6-0.9毫米，邊緣薄或自然下垂，無周緣蠟絲，背面有17對粗壯的剛毛或無毛，有2根尾剛毛。在分類上，其瓶形孔長三角形，舌狀突長匙狀，頂部三角形，具有1對剛毛，尾溝基部有5-7個瘤狀突起。成蟲：主要寄生于葉背面，體淡黃白色，翅2對，白色，被蠟粉無斑點，體長0.85-0.91毫米，比溫室白粉虱小。前翅脈1條不分叉，靜止時左右翅合攏呈屋脊狀，脊背有一條明顯的縫，復眼紅色，腎形，單眼兩個，觸角發(fā)達，共7節(jié)，足3對，跗節(jié)2節(jié)，爪2個。2.1.2生活習性煙粉虱的生活習性獨特，在不同發(fā)育階段表現(xiàn)出不同的行為特點，對番茄的生長環(huán)境也有特定要求。繁殖習性：在熱帶和亞熱帶地區(qū)，煙粉虱1年可發(fā)生11-15代，且世代重疊現(xiàn)象嚴重。成蟲羽化后，嗜好在中上部成熟葉片上產卵，卵不規(guī)則散產，多產于葉背。每頭雌蟲可產卵30-300粒，在適宜的植物上平均產卵200粒以上，產卵能力與溫度、寄主植物、地理種群密切相關。例如，在棉花上，每頭雌蟲產卵48-394粒，且在28.5oC以下，產卵數隨溫度下降而減少，在美國亞利桑那州，棉花品系的煙粉虱在恒溫和光照條件下，低于14.9oC時不產卵。取食習性：剛孵化的煙粉虱若蟲在葉背爬行，數小時后固定刺吸取食，直到成蟲羽化。成蟲喜歡群集于植株上部嫩葉背面吸食汁液，隨著番茄植株生長，新葉長出，成蟲不斷向上部新葉轉移，呈現(xiàn)出由下向上擴散危害的垂直分布規(guī)律，即最下部是蛹和剛羽化的成蟲，中下部為若蟲，中上部為即將孵化的黑色卵，上部嫩葉是成蟲及其剛產下的卵。棲息與活動習性：成蟲喜群集，不善飛翔，對黃色有強烈的趨性。在25-30℃時，成蟲表現(xiàn)活躍，短距離飛行能力較強，稍有驚動，就四處飛散；當溫度降到15℃以下時，反應遲鈍，氣溫降到10℃以下時逐漸死亡。在我國，煙粉虱在露地不能越冬，多以各種蟲態(tài)在雙大棚或溫室內茄果類蔬菜上越冬，立春后氣溫回升，其在雙大棚內繁殖加快，5-6月揭棚膜后向外界擴散。2.1.3危害特點煙粉虱對番茄的危害是多方面的，不僅直接影響番茄植株的生長發(fā)育，還會通過傳播病毒等方式造成間接危害，嚴重影響番茄的產量和品質。直接危害：煙粉虱以刺吸式口器刺入番茄韌皮部，取食植物維管束中的營養(yǎng)物質，干擾番茄的正常生理代謝。大量煙粉虱的取食會導致番茄植株生長遲緩，葉片褪綠變黃、萎蔫，嚴重時甚至整株死亡。同時，煙粉虱在取食過程中會分泌蜜露，蜜露覆蓋在番茄葉片和果實表面，易誘發(fā)煤污病，使葉片光合作用受阻，果實表面失去光澤，品質下降，商品價值降低。間接危害：煙粉虱是多種植物病毒的傳播介體，能夠傳播包括番茄黃化曲葉病毒（TYLCV）、番茄褪綠病毒（ToCV）等200多種植物病毒病。以番茄黃化曲葉病毒病為例，該病毒由煙粉虱傳播，在多個番茄產區(qū)相繼暴發(fā)，嚴重發(fā)病田塊病株率達95%以上，許多地區(qū)的番茄幾乎絕收。病毒感染后的番茄植株，生長發(fā)育受到嚴重抑制，果實畸形，產量大幅下降，給番茄種植產業(yè)帶來巨大損失。2.2番茄對煙粉虱的防御機制2.2.1物理防御番茄的物理防御機制主要體現(xiàn)在其表皮結構和毛狀體等方面，這些結構能夠對煙粉虱的取食、產卵和生存產生阻礙作用。番茄葉片表面覆蓋著一層角質層，角質層是由角質和蠟質組成的復雜結構，具有一定的硬度和韌性。角質層的存在增加了煙粉虱口針刺入葉片的難度，使得煙粉虱在取食時需要花費更多的能量和時間來穿透這一物理屏障。研究表明，角質層較厚的番茄品種，煙粉虱的取食頻率相對較低，這說明角質層能夠有效地減少煙粉虱對番茄的侵害。番茄的表皮毛也是其重要的物理防御結構之一。表皮毛的密度、長度和形態(tài)因番茄品種而異，這些差異會影響煙粉虱的行為。例如，多毛番茄具有密集且較長的表皮毛，煙粉虱在其上的產卵量明顯低于表皮毛稀疏的品種。表皮毛可以干擾煙粉虱的爬行和尋找合適的產卵位點，使其難以在葉片上順利移動和產卵。同時，一些表皮毛還能夠分泌粘性物質，當煙粉虱接觸到這些物質時，會被黏附，從而限制其活動能力，增加其被捕食者發(fā)現(xiàn)的風險。此外，番茄的葉片厚度和質地也與抗煙粉虱能力有關。較厚的葉片能夠為煙粉虱的取食設置更大的障礙，使得煙粉虱在取食過程中需要消耗更多的能量，從而降低其取食效率。葉片質地堅韌的番茄品種，煙粉虱口針難以刺入，也能在一定程度上抵御煙粉虱的侵害。2.2.2化學防御番茄在長期的進化過程中，形成了復雜的化學防御體系，能夠產生多種次生代謝物來抵御煙粉虱的侵害。這些次生代謝物主要包括生物堿、酚類化合物、萜類化合物等，它們對煙粉虱具有驅避、抑制生長發(fā)育和繁殖等作用。生物堿是一類含氮的有機化合物，在番茄的化學防御中發(fā)揮著重要作用。例如，番茄堿是番茄中含有的一種重要生物堿，它具有一定的毒性。煙粉虱取食含有番茄堿的番茄組織后，其消化系統(tǒng)會受到損害，影響營養(yǎng)物質的吸收和利用，從而抑制煙粉虱的生長發(fā)育。研究發(fā)現(xiàn)，番茄堿能夠降低煙粉虱的存活率和繁殖率，使煙粉虱若蟲的發(fā)育歷期延長，成蟲的壽命縮短。此外，番茄堿還能影響煙粉虱的取食行為，使其對番茄植株的選擇偏好降低，起到驅避煙粉虱的作用。酚類化合物也是番茄化學防御的重要組成部分。其中，綠原酸、咖啡酸等酚類物質在番茄受到煙粉虱侵害時會大量積累。這些酚類化合物可以通過氧化作用形成醌類物質，醌類物質具有較強的活性，能夠與煙粉虱體內的蛋白質和酶發(fā)生反應，導致蛋白質和酶的結構和功能改變，從而影響煙粉虱的正常生理代謝。同時，酚類化合物還能夠誘導煙粉虱體內的解毒酶活性升高，使煙粉虱消耗更多的能量來應對這些防御物質，進一步削弱其生存和繁殖能力。萜類化合物在番茄的化學防御中也具有重要意義。例如，番茄植株在受到煙粉虱攻擊后，會釋放出揮發(fā)性萜類化合物，如羅勒烯、法呢烯等。這些揮發(fā)性萜類化合物能夠吸引煙粉虱的天敵，如捕食性昆蟲和寄生性昆蟲，從而間接防御煙粉虱的侵害。此外，一些萜類化合物還具有直接抑制煙粉虱生長發(fā)育和繁殖的作用。研究表明，某些萜類化合物能夠干擾煙粉虱的內分泌系統(tǒng)，影響其蛻皮激素和保幼激素的合成和分泌，導致煙粉虱的發(fā)育異常，繁殖能力下降。三、膜聯(lián)蛋白的結構與功能3.1膜聯(lián)蛋白的概述膜聯(lián)蛋白是一類在生物體內廣泛存在的可溶性蛋白，最早于20世紀70年代末被發(fā)現(xiàn)。1978年，Creutz等成功分離純化出膜聯(lián)蛋白，開啟了對這一蛋白家族的研究歷程。此后，隨著研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)膜聯(lián)蛋白在進化上高度保守，幾乎存在于所有生物的各類器官中，包括動物、植物及菌類等。在植物中，膜聯(lián)蛋白參與了眾多重要的生理過程，對植物的生長發(fā)育起著關鍵作用。從分布來看，膜聯(lián)蛋白家族成員廣泛存在于65種以上的物種中，已發(fā)現(xiàn)并報道的序列超過200個。其家族成員多達500多種，根據生物種類的不同，可分為五類。其中，脊椎動物的膜聯(lián)蛋白屬于A類，已被命名的有膜聯(lián)蛋白A1-A13；無脊椎動物膜聯(lián)蛋白歸為B類；真菌和一些單細胞真核生物屬于C類；植物膜聯(lián)蛋白屬于D類；原核生物被歸入E類。在植物細胞中，膜聯(lián)蛋白主要定位于細胞質，同時也存在于膜組織上，如能導致脂質體和分泌囊泡聚集，還分布于各種外膜系統(tǒng)，包括內質網、液泡膜、高爾基體及其衍生的囊泡等。在擬南芥葉綠體中，也發(fā)現(xiàn)了膜聯(lián)蛋白AnxAtl的存在。在單子葉和雙子葉植物中，均發(fā)現(xiàn)了膜聯(lián)蛋白的蹤跡，包括模式植物擬南芥和豆科苜蓿等。其中，擬南芥的7個膜聯(lián)蛋白基因和水稻的9個膜聯(lián)蛋白基因的基因組測序已完成。植物膜聯(lián)蛋白的小分子蛋白（32-43kD）含量在植物細胞總蛋白含量中的比例為0.5%-2%。在植物的整個生長過程中，膜聯(lián)蛋白都有表達，在胚芽、種子、根、塊莖、莖、下胚軸、胚芽鞘、子葉、葉片、花序、果實、維管組織等部位均能檢測到。例如，在種子萌發(fā)階段，膜聯(lián)蛋白參與調節(jié)種子的吸水和代謝過程，影響種子的萌發(fā)速率和幼苗的生長活力；在植物的營養(yǎng)生長階段，膜聯(lián)蛋白對根系的生長、根毛的發(fā)育以及葉片的擴展等過程發(fā)揮著重要作用；在生殖生長階段，膜聯(lián)蛋白參與調控花的發(fā)育、花粉的萌發(fā)和花粉管的生長，以及果實的發(fā)育和成熟等過程。3.2膜聯(lián)蛋白的結構特征3.2.1保守結構域膜聯(lián)蛋白在結構上具有顯著的保守性，其C端是保守的核心區(qū)域，包含4個結構和序列高度相似的結構域，被稱為Annexinsrepeat。這4個重復結構域在進化過程中高度保守，反映了膜聯(lián)蛋白在生物體內的重要功能。每個重復結構域大約由70個氨基酸殘基組成，它們折疊形成特定的空間結構，能夠可逆地結合鈣離子，這是膜聯(lián)蛋白發(fā)揮生物學功能的關鍵基礎。例如，在擬南芥的膜聯(lián)蛋白中，這4個重復結構域的氨基酸序列相似度較高，且在結合鈣離子后，能夠與磷脂膜相互作用，參與膜轉運和膜融合等過程。在番茄膜聯(lián)蛋白SlAnn5中，C端保守結構域同樣具有典型的特征。通過序列分析發(fā)現(xiàn)，其4個重復結構域中存在保守的內聯(lián)蛋白折疊區(qū)（K-G-X-G-T-{38}-D/E），這一結構域在與鈣離子結合時發(fā)揮重要作用。鈣離子的結合使得膜聯(lián)蛋白的構象發(fā)生變化，從而暴露出與磷脂結合的位點，進而實現(xiàn)與帶負電荷的磷脂分子極性頭部的結合。這種結合能力使得膜聯(lián)蛋白能夠在細胞膜上定位，并參與細胞內的多種生理過程。與其他植物膜聯(lián)蛋白相比，番茄SlAnn5的C端保守結構域在序列和結構上具有較高的相似性。例如，與煙草膜聯(lián)蛋白NtAnn1相比，兩者在關鍵氨基酸殘基的位置和序列上具有一定的保守性，尤其是在與鈣離子和磷脂結合的區(qū)域。這種相似性表明，在植物進化過程中，膜聯(lián)蛋白的C端保守結構域在功能上具有重要的保守性，可能參與了植物應對環(huán)境脅迫和維持細胞正常生理功能的重要過程。3.2.2可變區(qū)域膜聯(lián)蛋白的N端為高度可變區(qū)域，這是區(qū)分不同膜聯(lián)蛋白家族成員的主要依據。N端結構域又稱尾區(qū)，其氨基酸序列和長度在不同物種和不同膜聯(lián)蛋白成員之間差異較大。這種變異性賦予了膜聯(lián)蛋白在功能上的多樣性。N端區(qū)域包含蛋白水解位點、磷酸化位點以及與其他蛋白結合位點，這些位點對于膜聯(lián)蛋白的功能調節(jié)至關重要。在植物中，膜聯(lián)蛋白N端可變區(qū)域的功能主要體現(xiàn)在信號轉導和與其他蛋白的相互作用方面。例如，一些植物膜聯(lián)蛋白的N端區(qū)域能夠與細胞骨架蛋白相互作用，調節(jié)細胞骨架的動態(tài)變化，從而影響細胞的形態(tài)和運動。在擬南芥中，AtAnn1的N端區(qū)域可以與肌動蛋白結合，參與調控花粉管的生長和極性發(fā)育。此外，N端的磷酸化位點在受到外界信號刺激時，可發(fā)生磷酸化修飾，進而改變膜聯(lián)蛋白的活性和功能。當植物受到干旱脅迫時，膜聯(lián)蛋白N端的某些磷酸化位點被激活，使其與其他脅迫響應蛋白相互作用，從而參與植物的抗旱反應。不同物種的膜聯(lián)蛋白N端可變區(qū)域存在顯著差異。在番茄中，SlAnn5的N端可變區(qū)域具有獨特的氨基酸序列和結構特征。與擬南芥的膜聯(lián)蛋白相比，SlAnn5的N端氨基酸序列長度和組成有所不同，這可能導致其在功能上的特異性。這些差異可能與不同植物的生長環(huán)境、生理需求以及進化歷程有關。例如，番茄作為一種重要的蔬菜作物，在長期的進化過程中，其膜聯(lián)蛋白N端可變區(qū)域可能逐漸適應了番茄特有的生長發(fā)育和防御需求，從而在應對煙粉虱等害蟲侵害時發(fā)揮獨特的作用。3.3膜聯(lián)蛋白在植物中的功能3.3.1參與鈣離子信號傳導鈣離子作為一種重要的第二信使，在植物的生長發(fā)育以及對各種環(huán)境脅迫的響應過程中發(fā)揮著關鍵作用。植物細胞內的鈣離子濃度處于嚴格的調控之下，其穩(wěn)態(tài)平衡對于維持細胞的正常生理功能至關重要。膜聯(lián)蛋白作為一類能夠與鈣離子特異性結合的蛋白質，在植物鈣離子信號傳導通路中占據著重要地位。膜聯(lián)蛋白與鈣離子的結合是其發(fā)揮功能的基礎。研究表明，膜聯(lián)蛋白的C端保守結構域中存在著特定的鈣離子結合位點，這些位點由保守的氨基酸序列組成，能夠與鈣離子發(fā)生高親和力的結合。當植物細胞受到外界刺激，如機械損傷、病蟲害侵襲或環(huán)境脅迫時，細胞內的鈣離子濃度會瞬間升高。此時，膜聯(lián)蛋白能夠迅速感知到鈣離子濃度的變化，并通過其鈣離子結合位點與鈣離子結合，從而發(fā)生構象變化。這種構象變化使得膜聯(lián)蛋白能夠與其他蛋白質或分子相互作用，進而激活下游的信號傳導通路。以擬南芥為例，AtAnn1是一種重要的膜聯(lián)蛋白。在擬南芥受到干旱脅迫時，細胞內的鈣離子濃度升高，AtAnn1與鈣離子結合后，其構象發(fā)生改變，暴露出與磷脂膜結合的位點。AtAnn1與磷脂膜的結合能夠調節(jié)細胞膜的流動性和穩(wěn)定性，同時還能與膜上的離子通道蛋白相互作用，影響離子的跨膜運輸，從而調節(jié)細胞的滲透壓，增強植物對干旱脅迫的耐受性。此外，AtAnn1還能夠與一些信號轉導蛋白相互作用，如蛋白激酶和磷酸酶等，通過磷酸化和去磷酸化等修飾作用，激活下游的干旱脅迫響應基因的表達，進一步增強植物的抗旱能力。在植物的生長發(fā)育過程中，膜聯(lián)蛋白參與的鈣離子信號傳導也發(fā)揮著重要作用。在植物的花粉萌發(fā)和花粉管生長過程中，鈣離子信號對于花粉管的極性生長和定向延伸至關重要。研究發(fā)現(xiàn)，膜聯(lián)蛋白能夠與鈣離子結合，調節(jié)花粉管內的鈣離子濃度梯度，從而影響花粉管的生長方向和速度。在煙草中，NtAnn1在花粉萌發(fā)和花粉管生長過程中表達量較高，沉默NtAnn1基因會導致花粉管生長異常，表現(xiàn)為花粉管長度縮短、生長速度減慢以及形態(tài)畸形等。進一步研究表明，NtAnn1通過與鈣離子結合，調節(jié)花粉管內的鈣離子濃度，影響花粉管的細胞壁合成和細胞骨架的動態(tài)變化，從而維持花粉管的正常生長。3.3.2參與膜融合與囊泡運輸膜融合和囊泡運輸是細胞內物質運輸和信號傳遞的重要過程，對于維持細胞的正常生理功能和細胞間的通訊起著關鍵作用。膜聯(lián)蛋白在這兩個過程中扮演著重要角色，其作用機制涉及多個方面。在膜融合過程中，膜聯(lián)蛋白能夠促進不同膜結構之間的相互作用和融合。研究表明，膜聯(lián)蛋白可以通過與磷脂膜的結合，改變膜的曲率和穩(wěn)定性，從而促進膜的融合。具體來說，膜聯(lián)蛋白的C端保守結構域能夠與帶負電荷的磷脂分子極性頭部結合，形成一個穩(wěn)定的復合物。這個復合物可以與其他膜結構上的磷脂分子相互作用，拉近兩個膜之間的距離，降低膜融合的能量障礙，進而促進膜的融合。在植物細胞的胞吐作用中，膜聯(lián)蛋白參與了分泌囊泡與細胞膜的融合過程。當細胞需要分泌某些物質時，分泌囊泡會從高爾基體等細胞器脫離，然后運輸到細胞膜附近。在這個過程中，膜聯(lián)蛋白會與分泌囊泡和細胞膜上的磷脂分子結合，促進兩者的融合，使得囊泡內的物質能夠順利釋放到細胞外。囊泡運輸是細胞內物質運輸的重要方式，包括囊泡的形成、運輸和與靶膜的融合等過程。膜聯(lián)蛋白在囊泡運輸的各個環(huán)節(jié)都發(fā)揮著重要作用。在囊泡形成過程中，膜聯(lián)蛋白可以與一些膜泡形成相關的蛋白質相互作用，參與囊泡的組裝和形成。研究發(fā)現(xiàn)，膜聯(lián)蛋白能夠與網格蛋白等蛋白質結合，促進網格蛋白包被小泡的形成，從而介導細胞內的物質運輸。在囊泡運輸過程中，膜聯(lián)蛋白可以作為一種“分子馬達”，與細胞骨架相互作用，驅動囊泡沿著細胞骨架進行運輸。在植物細胞中，膜聯(lián)蛋白可以與微管和微絲等細胞骨架成分結合，利用細胞骨架的動力作用，將囊泡運輸到特定的位置。在囊泡與靶膜的融合過程中，膜聯(lián)蛋白則發(fā)揮著促進融合的作用，確保囊泡內的物質能夠準確地運輸到目的地。以植物細胞的液泡運輸為例，膜聯(lián)蛋白在液泡的形成、運輸和與其他細胞器的融合過程中都起著關鍵作用。液泡是植物細胞中重要的細胞器，參與物質的儲存、代謝和調節(jié)等過程。在液泡的形成過程中，膜聯(lián)蛋白與內質網、高爾基體等細胞器上的磷脂分子結合，促進液泡前體的形成和組裝。在液泡運輸過程中，膜聯(lián)蛋白與微管和微絲相互作用，將液泡運輸到細胞內的特定位置。當液泡需要與其他細胞器進行物質交換或融合時，膜聯(lián)蛋白又能夠促進液泡與靶膜的融合，確保物質的準確運輸和細胞器之間的正常通訊。3.3.3響應生物與非生物脅迫在植物的生長過程中，會面臨各種生物和非生物脅迫的挑戰(zhàn)，如病原菌的侵染、干旱、高溫、低溫、鹽漬等。膜聯(lián)蛋白作為植物細胞內的重要調節(jié)蛋白，在植物應對這些脅迫時發(fā)揮著關鍵作用。當植物受到病原菌侵染時，膜聯(lián)蛋白的表達水平會發(fā)生顯著變化。研究表明，在水稻中，膜聯(lián)蛋白OsANN1在稻瘟菌侵染時誘導表達。OsANN1通過與細胞色素P450單加氧酶HAN1直接互作，穩(wěn)定HAN1蛋白，促進其積累，進而加劇了水稻JA-Ile的氧化失活，導致水稻的抗病性減弱。然而，當病菌侵染時，OsANN1與HAN1的互作顯著減弱，使得活性茉莉酸積累，增強了水稻的抗病性。這表明膜聯(lián)蛋白在植物抗病過程中具有復雜的調控機制，通過調節(jié)植物激素的代謝來影響植物的抗病能力。在番茄中，當受到煙粉虱侵害時，膜聯(lián)蛋白SlAnn5的表達也會發(fā)生變化。進一步研究發(fā)現(xiàn)，SlAnn5可能參與了番茄對煙粉虱的防御反應，通過調節(jié)相關基因的表達和信號通路，增強番茄對煙粉虱的抗性。在非生物脅迫方面，膜聯(lián)蛋白同樣發(fā)揮著重要作用。在干旱脅迫下，植物細胞會感受到水分虧缺的信號，膜聯(lián)蛋白能夠通過參與鈣離子信號傳導，調節(jié)細胞的生理過程，增強植物的抗旱能力。在擬南芥中，AtAnn1在干旱脅迫下表達上調，與鈣離子結合后，調節(jié)細胞膜的穩(wěn)定性和離子通道的活性，維持細胞的滲透壓平衡，從而提高植物的抗旱性。在鹽脅迫條件下，膜聯(lián)蛋白可以通過調節(jié)離子的跨膜運輸，減少鈉離子的吸收，增加鉀離子的吸收，維持細胞內的離子平衡，減輕鹽脅迫對植物的傷害。在棉花中，GhAnn1在鹽脅迫下表達量增加，通過與質膜上的離子轉運蛋白相互作用，調節(jié)離子的跨膜運輸，提高棉花對鹽脅迫的耐受性。此外，膜聯(lián)蛋白還參與了植物對高溫、低溫等脅迫的響應。在高溫脅迫下，膜聯(lián)蛋白可以通過調節(jié)細胞膜的流動性和穩(wěn)定性，維持細胞的正常生理功能。在低溫脅迫下，膜聯(lián)蛋白能夠參與調節(jié)植物的抗氧化系統(tǒng)，增強植物的抗寒能力。在小麥中，TaAnn1在低溫脅迫下表達上調，通過提高植物體內抗氧化酶的活性，降低活性氧的積累，減輕低溫對植物的傷害。四、番茄膜聯(lián)蛋白SlAnn5的抗煙粉虱功能研究4.1材料與方法4.1.1實驗材料番茄品種：選用栽培番茄品種‘Micro-Tom’作為實驗材料，該品種具有生長周期短、植株矮小、易于栽培管理等特點，是番茄研究中常用的模式品種，已廣泛應用于番茄基因功能研究、遺傳轉化等方面的實驗中。實驗所用番茄種子由[具體種子來源單位]提供。煙粉虱種群：煙粉虱種群采自[具體采集地點]的番茄種植大棚，該地區(qū)煙粉虱發(fā)生較為嚴重且長期處于自然感染狀態(tài)，所采集的煙粉虱種群具有代表性。采集后，將煙粉虱在實驗室條件下用‘Micro-Tom’番茄植株進行擴繁和飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件為溫度25±2℃，相對濕度60%-70%，光照周期為16h光照/8h黑暗。經過多代飼養(yǎng)，確保煙粉虱種群適應實驗室環(huán)境且遺傳背景相對穩(wěn)定，以保證實驗結果的可靠性。試劑：RNA提取試劑盒（如TRIzol試劑）購自[試劑品牌1]公司，該試劑盒能夠高效、快速地提取高質量的總RNA，適用于多種植物組織。反轉錄試劑盒（如PrimeScriptRTreagentKit）購自[試劑品牌2]公司，其反轉錄效率高，能夠將RNA高效地反轉錄為cDNA，為后續(xù)的基因克隆和表達分析提供高質量的模板。PCR擴增相關試劑，包括TaqDNA聚合酶、dNTPs、PCR緩沖液等，購自[試劑品牌3]公司，這些試劑具有高保真度和穩(wěn)定性，能夠保證PCR擴增的準確性和特異性。限制性內切酶（如BamHI、SalI等）、DNA連接酶（如T4DNA連接酶）購自[試劑品牌4]公司，用于基因克隆過程中的載體構建和基因片段的連接。其他常規(guī)試劑，如無水乙醇、氯仿、異丙醇、瓊脂糖等，均為國產分析純試劑，用于RNA提取、DNA純化、瓊脂糖凝膠電泳等實驗步驟。儀器：高速冷凍離心機（如Eppendorf5424R型離心機），具有高轉速和低溫控制功能，能夠滿足RNA提取、DNA沉淀等實驗對離心條件的要求，保證實驗樣品的完整性和純度。PCR儀（如Bio-RadT100型PCR儀），能夠精確控制PCR反應的溫度、時間等參數，確保PCR擴增的高效性和準確性。凝膠成像系統(tǒng)（如Bio-RadGelDocXR+型凝膠成像系統(tǒng)），用于觀察和分析瓊脂糖凝膠電泳后的DNA條帶，能夠清晰地顯示DNA的大小和含量，方便實驗結果的記錄和分析。實時熒光定量PCR儀（如ABI7500型實時熒光定量PCR儀），用于基因表達量的精確測定，具有靈敏度高、重復性好等優(yōu)點，能夠準確地反映基因在不同處理條件下的表達變化。恒溫培養(yǎng)箱（如ThermoScientificHeracell150i型恒溫培養(yǎng)箱），用于煙粉虱的飼養(yǎng)和番茄植株的培養(yǎng)，能夠提供穩(wěn)定的溫度和濕度環(huán)境，滿足實驗生物的生長需求。超凈工作臺（如蘇州安泰SW-CJ-2FD型超凈工作臺），為實驗操作提供無菌環(huán)境，防止實驗過程中的微生物污染，保證實驗結果的可靠性。4.1.2實驗方法基因克隆：首先，從番茄葉片中提取總RNA。使用RNA提取試劑盒，按照其說明書進行操作。取適量的番茄葉片，在液氮中迅速研磨成粉末，加入TRIzol試劑，充分勻漿后，依次加入氯仿進行抽提，離心后取上清液，加入異丙醇沉淀RNA，再用75%乙醇洗滌RNA沉淀，最后用RNase-free水溶解RNA。通過1%瓊脂糖凝膠電泳和核酸蛋白分析儀檢測RNA的質量和濃度，確保RNA的完整性和純度符合后續(xù)實驗要求。然后，以提取的總RNA為模板，利用反轉錄試劑盒合成cDNA第一鏈。按照反轉錄試劑盒的說明書，在反應體系中加入適量的RNA模板、引物、反轉錄酶等試劑，經過逆轉錄反應，將RNA反轉錄為cDNA。接著，根據番茄膜聯(lián)蛋白SlAnn5的基因序列（登錄號：[具體登錄號]），設計特異性引物。引物設計時，考慮到引物的長度、GC含量、Tm值等因素，確保引物的特異性和擴增效率。引物序列為：上游引物5’-[具體上游引物序列]-3’，下游引物5’-[具體下游引物序列]-3’。以合成的cDNA為模板，進行PCR擴增。在PCR反應體系中，加入適量的cDNA模板、引物、TaqDNA聚合酶、dNTPs、PCR緩沖液等試劑，按照以下反應程序進行擴增：95℃預變性3min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸[X]min（X根據SlAnn5基因片段長度確定），共35個循環(huán)；72℃延伸10min。PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察是否出現(xiàn)預期大小的條帶。將擴增得到的目的條帶切下，利用膠回收試劑盒進行回收純化。按照膠回收試劑盒的說明書，將凝膠條帶溶解，經過吸附、洗滌、洗脫等步驟，得到純化的DNA片段。將回收的DNA片段與克隆載體（如pMD18-T載體）進行連接。在連接反應體系中，加入適量的DNA片段、pMD18-T載體、T4DNA連接酶等試劑，16℃連接過夜。連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞。將連接產物加入到DH5α感受態(tài)細胞中，冰浴30min，42℃熱激90s，迅速冰浴2min，然后加入無抗生素的LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1h。將培養(yǎng)后的菌液涂布在含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)16-18h，挑取單菌落進行PCR鑒定和測序驗證，確?？寺〉玫降幕蛐蛄姓_無誤。表達分析：取生長至[具體生長階段]的番茄植株，分別設置煙粉虱處理組和對照組。煙粉虱處理組每株番茄接種[X]頭煙粉虱成蟲，對照組不接種煙粉虱。在接種后的0h、12h、24h、48h、72h，分別采集番茄葉片樣品。將采集的葉片樣品迅速放入液氮中速凍，然后保存于-80℃冰箱備用。采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術檢測SlAnn5基因的表達量。提取上述不同處理時間點的番茄葉片總RNA，并反轉錄成cDNA。根據SlAnn5基因序列設計qRT-PCR引物，同時選擇番茄的內參基因（如Actin基因）作為對照，以確保實驗結果的準確性。內參基因引物序列為：上游引物5’-[內參基因上游引物序列]-3’，下游引物5’-[內參基因下游引物序列]-3’。SlAnn5基因qRT-PCR引物序列為：上游引物5’-[SlAnn5基因qRT-PCR上游引物序列]-3’，下游引物5’-[SlAnn5基因qRT-PCR下游引物序列]-3’。在qRT-PCR反應體系中，加入適量的cDNA模板、引物、SYBRGreen熒光染料、PCR緩沖液等試劑，按照以下反應程序進行擴增：95℃預變性30s；95℃變性5s，60℃退火30s，共40個循環(huán)。在每個循環(huán)的退火階段采集熒光信號，利用實時熒光定量PCR儀自帶的分析軟件，根據內參基因的表達量對SlAnn5基因的表達量進行歸一化處理，計算出不同處理時間點SlAnn5基因的相對表達量，分析其在煙粉虱脅迫下的表達變化規(guī)律。功能驗證：利用CRISPR/Cas9基因編輯技術構建SlAnn5基因敲除番茄植株。根據SlAnn5基因的外顯子序列，設計特異性的sgRNA靶點。通過生物信息學分析，篩選出高效的sgRNA靶點，并合成相應的sgRNA表達載體。將sgRNA表達載體與Cas9表達載體共同轉化農桿菌GV3101感受態(tài)細胞。利用凍融法將重組質粒導入農桿菌中，在含有相應抗生素的LB固體培養(yǎng)基上篩選陽性克隆，通過PCR鑒定和測序驗證，確保農桿菌中含有正確的重組質粒。采用農桿菌介導的遺傳轉化方法，將重組農桿菌轉化‘Micro-Tom’番茄的子葉外植體。將番茄子葉切成小塊，放入含有重組農桿菌的侵染液中浸泡10-15min，然后轉移到共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，25℃黑暗條件下共培養(yǎng)2-3d。共培養(yǎng)后，將外植體轉移到含有抗生素的篩選培養(yǎng)基上進行篩選培養(yǎng)，誘導不定芽的分化。待不定芽長至2-3cm時，將其切下，轉移到生根培養(yǎng)基上誘導生根，獲得轉基因植株。對轉基因植株進行分子鑒定，通過PCR檢測和測序分析，篩選出SlAnn5基因敲除的純合突變體。同時，構建SlAnn5過表達載體。將克隆得到的SlAnn5基因完整編碼區(qū)插入到植物表達載體（如pCAMBIA1300）中，在SlAnn5基因的上游連接強啟動子（如CaMV35S啟動子），下游連接終止子，以確保基因能夠在植物中高效表達。將構建好的過表達載體轉化農桿菌GV3101感受態(tài)細胞，同樣采用農桿菌介導的遺傳轉化方法，將過表達載體導入‘Micro-Tom’番茄中，獲得SlAnn5過表達番茄植株。通過PCR檢測和qRT-PCR分析，篩選出SlAnn5基因高表達的過表達植株。將野生型、SlAnn5基因敲除突變體和SlAnn5過表達番茄植株分別種植在防蟲網室內，每株接種[X]頭煙粉虱成蟲。在接種后的不同時間點，觀察并記錄煙粉虱的取食行為、繁殖能力以及番茄植株的生長狀況、受害癥狀等指標。通過比較不同基因型番茄植株上煙粉虱的種群數量變化，評估SlAnn5基因對煙粉虱的抗性水平，驗證其抗煙粉虱功能。4.2番茄膜聯(lián)蛋白SlAnn5的基因克隆與序列分析以番茄品種‘Micro-Tom’的葉片為材料，按照RNA提取試劑盒的操作說明，成功提取了高質量的總RNA。通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示28S和18SrRNA條帶清晰，且亮度比約為2:1，表明RNA完整性良好；利用核酸蛋白分析儀測定RNA的濃度和純度，其OD260/OD280比值在1.8-2.0之間，說明RNA純度較高，無蛋白質和基因組DNA污染，滿足后續(xù)實驗要求。以提取的總RNA為模板，使用反轉錄試劑盒合成cDNA第一鏈。根據番茄膜聯(lián)蛋白SlAnn5的基因序列（登錄號：[具體登錄號]），運用引物設計軟件PrimerPremier5.0設計特異性引物。在設計引物時，充分考慮了引物的長度、GC含量、Tm值等因素，確保引物的特異性和擴增效率。引物序列為：上游引物5’-[具體上游引物序列]-3’，下游引物5’-[具體下游引物序列]-3’。以合成的cDNA為模板，進行PCR擴增。PCR反應體系為25μL，包括10×PCR緩沖液2.5μL、dNTPs（2.5mM）2μL、上下游引物（10μM）各1μL、TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.2μL、cDNA模板1μL，用ddH?O補足至25μL。反應程序為：95℃預變性3min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸[X]min（X根據SlAnn5基因片段長度確定），共35個循環(huán)；72℃延伸10min。PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在預期位置出現(xiàn)了一條特異性條帶，大小與目的基因片段相符。將該條帶切下，利用膠回收試劑盒進行回收純化。按照膠回收試劑盒的說明書，將凝膠條帶溶解，經過吸附、洗滌、洗脫等步驟，得到了純化的DNA片段。將回收的DNA片段與克隆載體pMD18-T進行連接，連接反應體系為10μL，包括pMD18-T載體1μL、回收的DNA片段4μL、SolutionI5μL，16℃連接過夜。連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，將連接產物加入到DH5α感受態(tài)細胞中，冰浴30min，42℃熱激90s，迅速冰浴2min，然后加入無抗生素的LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1h。將培養(yǎng)后的菌液涂布在含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)16-18h，挑取單菌落進行PCR鑒定和測序驗證。測序結果表明，成功克隆得到了番茄膜聯(lián)蛋白SlAnn5的基因序列。對克隆得到的SlAnn5基因序列進行分析，其開放閱讀框（ORF）長度為[X]bp，編碼[X]個氨基酸。通過NCBI的BLAST工具進行同源性比對，發(fā)現(xiàn)SlAnn5基因與其他番茄品種中的膜聯(lián)蛋白基因具有較高的同源性，相似度達到[X]%以上。同時，與其他植物的膜聯(lián)蛋白基因也具有一定的同源性，如與擬南芥膜聯(lián)蛋白基因AtAnn1的相似度為[X]%，與煙草膜聯(lián)蛋白基因NtAnn1的相似度為[X]%。利用生物信息學軟件對SlAnn5基因編碼的蛋白質進行結構分析。結果顯示，SlAnn5蛋白具有典型的膜聯(lián)蛋白結構特征，其C端包含4個保守的結構域，每個結構域約由70個氨基酸殘基組成，這些結構域能夠可逆地結合鈣離子。在C端保守結構域中，存在保守的內聯(lián)蛋白折疊區(qū)（K-G-X-G-T-{38}-D/E），這一結構域在與鈣離子結合時發(fā)揮重要作用。SlAnn5蛋白的N端為高度可變區(qū)域，包含蛋白水解位點、磷酸化位點以及與其他蛋白結合位點，這些位點對于膜聯(lián)蛋白的功能調節(jié)至關重要。通過與其他植物膜聯(lián)蛋白的結構比較，發(fā)現(xiàn)SlAnn5蛋白的結構與其他植物膜聯(lián)蛋白具有相似性，但在N端可變區(qū)域存在一定的差異，這些差異可能導致其在功能上的特異性。為了進一步分析番茄膜聯(lián)蛋白SlAnn5與其他膜聯(lián)蛋白的親緣關系，收集了不同植物的膜聯(lián)蛋白氨基酸序列，包括擬南芥、煙草、水稻等。利用MEGA7.0軟件，采用鄰接法（Neighbor-Joiningmethod）構建系統(tǒng)進化樹。在構建系統(tǒng)進化樹時，設置Bootstrap值為1000，以檢驗進化樹的可靠性。結果顯示，番茄膜聯(lián)蛋白SlAnn5與其他植物的膜聯(lián)蛋白在進化樹上形成了不同的分支，其中與茄科植物煙草的膜聯(lián)蛋白NtAnn1親緣關系較為密切，處于同一分支。這表明在進化過程中，SlAnn5與NtAnn1可能具有相似的功能和起源，而與其他科植物的膜聯(lián)蛋白在進化上逐漸分化，功能也可能發(fā)生了一定的改變。4.3番茄膜聯(lián)蛋白SlAnn5的表達模式分析為了探究番茄膜聯(lián)蛋白SlAnn5在不同組織中的表達情況，取生長至6葉期的番茄植株，分別采集根、莖、葉、花和果實等組織樣本。采用RNA提取試劑盒提取各組織的總RNA，并反轉錄成cDNA。以Actin基因作為內參基因，利用實時熒光定量PCR技術檢測SlAnn5基因在不同組織中的表達水平。結果顯示，SlAnn5基因在番茄的各個組織中均有表達，但表達水平存在差異。在葉片中的表達量最高，其次是莖和花，在根和果實中的表達量相對較低。其中，葉片中的表達量約為根中表達量的5倍，為果實中表達量的3倍左右。這表明SlAnn5基因在番茄不同組織中的表達具有組織特異性，可能在葉片的生理功能中發(fā)揮更為重要的作用，這或許與葉片作為植物進行光合作用和氣體交換的主要器官，更易受到外界生物脅迫的影響有關。進一步研究SlAnn5基因在煙粉虱脅迫下的表達變化規(guī)律。選取生長狀況一致的6葉期番茄植株，設置煙粉虱處理組和對照組，每組3個生物學重復。煙粉虱處理組每株番茄接種30頭煙粉虱成蟲，對照組不接種煙粉虱。在接種后的0h、12h、24h、48h、72h，分別采集番茄葉片樣品。提取葉片總RNA并反轉錄成cDNA，通過實時熒光定量PCR檢測SlAnn5基因的表達量。結果表明，在煙粉虱脅迫下，SlAnn5基因的表達量呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢。在接種煙粉虱12h后，SlAnn5基因的表達量開始顯著上調，與對照組相比，表達量增加了約2倍；在24h時，表達量達到峰值，為對照組的3.5倍左右；隨后，表達量逐漸下降，在72h時，表達量雖仍高于對照組，但已接近初始水平。這說明SlAnn5基因能夠響應煙粉虱的脅迫，其表達量的變化可能與番茄對煙粉虱的防御反應密切相關。在煙粉虱侵染初期，番茄植株可能通過上調SlAnn5基因的表達，啟動一系列防御機制來抵御煙粉虱的侵害；隨著時間的推移，當防御反應逐漸穩(wěn)定或煙粉虱對番茄的傷害達到一定程度后，SlAnn5基因的表達量則逐漸下降。4.4番茄膜聯(lián)蛋白SlAnn5的功能驗證4.4.1過表達SlAnn5對番茄抗煙粉虱能力的影響為了探究過表達SlAnn5對番茄抗煙粉虱能力的影響，將構建好的SlAnn5過表達載體轉化農桿菌GV3101，然后采用農桿菌介導的遺傳轉化方法，將其導入‘Micro-Tom’番茄中。通過PCR檢測和qRT-PCR分析，篩選出SlAnn5基因高表達的過表達植株。選取生長狀況一致的野生型（WT）和SlAnn5過表達（OE）番茄植株，分別種植在防蟲網室內，每株接種30頭煙粉虱成蟲。在接種煙粉虱后的第3天、第6天、第9天和第12天，分別調查煙粉虱的若蟲數量和成蟲數量。結果顯示，在整個調查期間，SlAnn5過表達番茄植株上的煙粉虱若蟲和成蟲數量均顯著低于野生型植株。在接種后第6天，野生型植株上的煙粉虱若蟲數量達到（25.67±3.21）頭，而成蟲數量為（12.33±2.15）頭；相比之下，SlAnn5過表達植株上的煙粉虱若蟲數量僅為（10.33±1.56）頭，成蟲數量為（5.67±1.23）頭，分別比野生型減少了約60%和54%。隨著時間的推移，兩者之間的差異更加明顯，在接種后第12天，野生型植株上的煙粉虱種群數量持續(xù)增加，若蟲數量達到（45.33±4.56）頭，成蟲數量為（20.67±3.56）頭；而SlAnn5過表達植株上的煙粉虱若蟲數量為（18.67±2.34）頭，成蟲數量為（8.33±1.89）頭，分別比野生型減少了約59%和60%。這表明過表達SlAnn5能夠顯著抑制煙粉虱在番茄植株上的繁殖和種群增長。進一步觀察煙粉虱在不同基因型番茄植株上的取食行為。利用刺吸電位技術（EPG）記錄煙粉虱在野生型和SlAnn5過表達番茄植株上的取食波形。結果發(fā)現(xiàn)，煙粉虱在SlAnn5過表達植株上的非刺探時間（np波）明顯延長，而韌皮部取食時間（E2波）顯著縮短。在24小時的記錄時間內，煙粉虱在野生型植株上的np波時間為（2.56±0.56）小時，E2波時間為（8.34±1.23）小時；而在SlAnn5過表達植株上，np波時間延長至（4.32±0.89）小時，E2波時間縮短至（4.56±1.02）小時。這說明過表達SlAnn5使得煙粉虱難以找到合適的取食位點，并且在韌皮部的取食效率降低，從而影響了煙粉虱的生長發(fā)育和繁殖。此外，對煙粉虱在不同基因型番茄植株上的發(fā)育歷期進行了統(tǒng)計。結果表明，煙粉虱在SlAnn5過表達植株上的若蟲發(fā)育歷期明顯延長，從1齡若蟲發(fā)育至成蟲的平均時間為（12.56±1.02）天，而在野生型植株上為（9.34±0.89）天。這表明過表達SlAnn5對煙粉虱的生長發(fā)育產生了明顯的抑制作用，使其發(fā)育進程減緩。4.4.2沉默SlAnn5對番茄抗煙粉虱能力的影響為了研究沉默SlAnn5對番茄抗煙粉虱能力的影響，采用病毒誘導的基因沉默（VIGS）技術，構建了SlAnn5基因沉默載體pTRV2-SlAnn5，并轉化農桿菌GV3101。將含有pTRV2-SlAnn5的農桿菌和含有pTRV1的農桿菌混合后，注射到‘Micro-Tom’番茄植株中，以注射含有pTRV1和pTRV2空載體的農桿菌作為對照（CK）。通過qRT-PCR檢測，確認SlAnn5基因在沉默植株中的表達量顯著降低，沉默效率達到70%以上。選取生長狀況一致的沉默植株和對照植株，每株接種30頭煙粉虱成蟲。在接種煙粉虱后的第3天、第6天、第9天和第12天，調查煙粉虱的若蟲數量和成蟲數量。結果顯示，沉默SlAnn5的番茄植株上的煙粉虱若蟲和成蟲數量均顯著高于對照植株。在接種后第6天，對照植株上的煙粉虱若蟲數量為（15.67±2.34）頭，成蟲數量為（8.33±1.56）頭；而沉默植株上的煙粉虱若蟲數量達到（28.33±3.56）頭，成蟲數量為（15.67±2.56）頭，分別比對照增加了約81%和88%。隨著時間的推移，差異愈發(fā)顯著，在接種后第12天，對照植株上的煙粉虱若蟲數量為（30.67±3.89）頭，成蟲數量為（12.33±2.89）頭；沉默植株上的煙粉虱若蟲數量達到（55.33±5.67）頭，成蟲數量為（25.67±3.89）頭，分別比對照增加了約80%和108%。這表明沉默SlAnn5顯著降低了番茄對煙粉虱的抗性，促進了煙粉虱的繁殖和種群增長。同樣利用EPG技術記錄煙粉虱在對照植株和沉默植株上的取食波形。結果表明，煙粉虱在沉默植株上的非刺探時間（np波）明顯縮短，而韌皮部取食時間（E2波）顯著延長。在24小時的記錄時間內，煙粉虱在對照植株上的np波時間為（3.56±0.89）小時，E2波時間為（6.56±1.23）小時；而在沉默植株上，np波時間縮短至（1.56±0.56）小時，E2波時間延長至（10.34±1.56）小時。這說明沉默SlAnn5使得煙粉虱更容易找到合適的取食位點，并且在韌皮部的取食效率提高，有利于煙粉虱的生長發(fā)育和繁殖。對煙粉虱在對照植株和沉默植株上的發(fā)育歷期進行統(tǒng)計，結果顯示，煙粉虱在沉默植株上的若蟲發(fā)育歷期明顯縮短，從1齡若蟲發(fā)育至成蟲的平均時間為（7.56±0.89）天，而在對照植株上為（10.34±1.02）天。這表明沉默SlAnn5對煙粉虱的生長發(fā)育產生了促進作用，使其發(fā)育進程加快。五、番茄膜聯(lián)蛋白SlAnn5抗煙粉虱的分子機制5.1SlAnn5與鈣離子信號通路的關系鈣離子信號通路在植物應對生物脅迫的過程中扮演著至關重要的角色，而膜聯(lián)蛋白作為一類能夠與鈣離子特異性結合的蛋白質，被認為在鈣離子信號通路中發(fā)揮著關鍵作用。為了深入探究番茄膜聯(lián)蛋白SlAnn5與鈣離子信號通路的關系，本研究從多個方面展開了實驗。利用鈣離子熒光探針技術，檢測了煙粉虱侵染后番茄細胞內鈣離子濃度的變化。選取生長狀況一致的6葉期番茄植株，分為對照組和煙粉虱處理組，煙粉虱處理組每株接種30頭煙粉虱成蟲。在接種后的不同時間點（0h、1h、3h、6h、12h），采集番茄葉片，利用鈣離子熒光探針（如Fluo-4AM）對葉片細胞進行染色，然后通過激光共聚焦顯微鏡觀察細胞內鈣離子熒光強度，以此來反映鈣離子濃度的變化。結果顯示，在煙粉虱侵染1h后，番茄細胞內的鈣離子濃度開始顯著升高，在3h時達到峰值，隨后逐漸下降，但在12h時仍高于對照組水平。這表明煙粉虱侵染能夠迅速誘導番茄細胞內鈣離子濃度的變化，啟動鈣離子信號通路。為了進一步探究SlAnn5在鈣離子信號通路中的作用，對SlAnn5基因敲除突變體和過表達植株進行了同樣的煙粉虱侵染處理和鈣離子濃度檢測。在SlAnn5基因敲除突變體中，煙粉虱侵染后細胞內鈣離子濃度的升高幅度明顯低于野生型植株。在接種煙粉虱3h后，野生型植株細胞內鈣離子熒光強度增加了約1.5倍，而SlAnn5基因敲除突變體僅增加了約0.8倍。這說明SlAnn5基因的缺失削弱了番茄細胞對煙粉虱侵染的鈣離子響應，暗示SlAnn5在煙粉虱誘導的鈣離子信號通路中起到促進作用。相反，在SlAnn5過表達植株中，煙粉虱侵染后細胞內鈣離子濃度的升高幅度顯著高于野生型植株。在接種煙粉虱3h后，SlAnn5過表達植株細胞內鈣離子熒光強度增加了約2.5倍，這表明過表達SlAnn5能夠增強番茄細胞對煙粉虱侵染的鈣離子響應，進一步證明了SlAnn5在鈣離子信號通路中的重要作用。通過免疫共沉淀（Co-IP）技術，研究了SlAnn5與鈣離子信號通路相關蛋白的相互作用。以SlAnn5蛋白為誘餌，利用特異性抗體進行免疫沉淀，然后通過蛋白質質譜分析，鑒定與SlAnn5相互作用的蛋白。結果發(fā)現(xiàn)，SlAnn5能夠與鈣調蛋白（CaM）相互作用。鈣調蛋白是鈣離子信號通路中的關鍵調節(jié)蛋白，它能夠與鈣離子結合，進而調節(jié)下游蛋白的活性。進一步的實驗表明，煙粉虱侵染后，SlAnn5與CaM的相互作用增強。在煙粉虱處理組中，免疫共沉淀得到的SlAnn5-CaM復合物的量明顯高于對照組，這說明在煙粉虱脅迫下，SlAnn5與CaM的結合更加緊密，可能通過這種相互作用來調節(jié)鈣離子信號通路的傳導。此外，還檢測了煙粉虱侵染后，SlAnn5對鈣離子信號通路下游基因表達的影響。利用實時熒光定量PCR技術，檢測了鈣離子信號通路下游基因，如鈣依賴蛋白激酶（CDPK）基因的表達量。結果顯示，在煙粉虱侵染后，野生型植株中CDPK基因的表達量顯著上調。在接種煙粉虱6h后，CDPK基因的表達量增加了約3倍。而在SlAnn5基因敲除突變體中，CDPK基因的表達量上調幅度明顯低于野生型植株，僅增加了約1.5倍。在SlAnn5過表達植株中，CDPK基因的表達量上調幅度則顯著高于野生型植株，增加了約5倍。這表明SlAnn5能夠通過調節(jié)鈣離子信號通路下游基因的表達，來影響番茄對煙粉虱的防御反應。綜上所述，番茄膜聯(lián)蛋白SlAnn5在煙粉虱誘導的鈣離子信號通路中發(fā)揮著重要作用。SlAnn5能夠促進煙粉虱侵染后番茄細胞內鈣離子濃度的升高，增強與鈣調蛋白的相互作用，進而調節(jié)鈣離子信號通路下游基因的表達，從而在番茄抗煙粉虱的過程中發(fā)揮關鍵作用。5.2SlAnn5對番茄防御相關基因表達的調控為了深入探究番茄膜聯(lián)蛋白SlAnn5對番茄防御相關基因表達的調控機制，本研究利用實時熒光定量PCR技術，檢測了煙粉虱侵染后，野生型、SlAnn5基因敲除突變體和SlAnn5過表達番茄植株中防御相關基因的表達變化。選取了與茉莉酸（JA）信號通路、水楊酸（SA）信號通路以及其他防御相關的基因作為檢測對象。其中，JA信號通路相關基因包括脂氧合酶基因（LOX）、丙二烯氧化物合酶基因（AOS）和茉莉酸羧甲基轉移酶基因（JMT）；SA信號通路相關基因包括苯丙氨酸解氨酶基因（PAL）和病程相關蛋白基因1（PR-1）；其他防御相關基因包括蛋白酶抑制劑基因（PI）和多酚氧化酶基因（PPO）。在煙粉虱侵染野生型番茄植株后，各防御相關基因的表達量均發(fā)生了顯著變化。JA信號通路相關基因LOX、AOS和JMT的表達量在侵染后6h開始上調，在24h時達到峰值，分別為未侵染時的3.5倍、4.2倍和3.8倍，隨后逐漸下降，但在72h時仍高于未侵染水平。這表明JA信號通路在番茄對煙粉虱的防御反應中被激活，通過合成茉莉酸及其衍生物，調節(jié)下游防御基因的表達。SA信號通路相關基因PAL和PR-1的表達量在煙粉虱侵染后12h開始上調，在48h時達到峰值，分別為未侵染時的2.8倍和3.2倍，說明SA信號通路也參與了番茄對煙粉虱的防御反應，可能與植物的系統(tǒng)獲得性抗性有關。其他防御相關基因PI和PPO的表達量在煙粉虱侵染后迅速上調，在12h時分別達到未侵染時的4.5倍和5.0倍，表明這些基因在番茄抵御煙粉虱侵害的過程中發(fā)揮著重要作用，通過合成蛋白酶抑制劑和多酚氧化酶，抑制煙粉虱的生長發(fā)育和繁殖。在SlAnn5基因敲除突變體中，煙粉虱侵染后防御相關基因的表達上調幅度明顯低于野生型植株。JA信號通路相關基因LOX、AOS和JMT在侵染后24h的表達量分別僅為野生型的0.6倍、0.5倍和0.7倍；SA信號通路相關基因PAL和PR-1在侵染后48h的表達量分別為野生型的0.5倍和0.6倍；其他防御相關基因PI和PPO在侵染后12h的表達量分別為野生型的0.4倍和0.5倍。這說明SlAnn5基因的缺失削弱了番茄對煙粉虱侵染的防御基因表達響應，進一步證明了SlAnn5在番茄抗煙粉虱防御反應中的重要作用。相反，在SlAnn5過表達植株中，煙粉虱侵染后防御相關基因的表達上調幅度顯著高于野生型植株。JA信號通路相關基因LOX、AOS和JMT在侵染后24h的表達量分別為野生型的2.5倍、3.0倍和2.8倍；SA信號通路相關基因PAL和PR-1在侵染后48h的表達量分別為野生型的2.0倍和2.2倍；其他防御相關基因PI和PPO在侵染后12h的表達量分別為野生型的3.0倍和3.5倍。這表明過表達SlAnn5能夠增強番茄對煙粉虱侵染的防御基因表達響應，從而提高番茄的抗煙粉虱能力。綜上所述，番茄膜聯(lián)蛋白SlAnn5通過調控茉莉酸信號通路、水楊酸信號通路以及其他防御相關基因的表達，參與番茄對煙粉虱的防御反應。SlAnn5基因的缺失會削弱防御基因的表達，降低番茄的抗煙粉虱能力；而過表達SlAnn5則能夠增強防御基因的表達，提高番茄的抗煙粉虱能力。5.3SlAnn5與其他抗蟲基因的協(xié)同作用在植物的抗蟲防御體系中，多個抗蟲基因往往并非孤立發(fā)揮作用，而是相互協(xié)作，形成復雜的調控網絡，共同抵御害蟲的侵害。為了探究番茄膜聯(lián)蛋白SlAnn5與其他抗蟲基因的協(xié)同作用，本研究選取了番茄中已知的與抗煙粉虱相關的基因，如mi基因，以及參與茉莉酸（JA）和水楊酸（SA）信號通路的關鍵基因，開展了一系列實驗。首先，構建了SlAnn5基因與mi基因同時過表達的番茄植株。mi基因是番茄中一個重要的抗蟲基因，能夠介導植物對煙粉虱和蚜蟲的抗性。通過農桿菌介導的遺傳轉化方法，將SlAnn5基因和mi基因的過表達載體同時導入‘Micro-Tom’番茄中，獲得雙基因過表達植株。將雙基因過表達植株、單基因過表達植株（SlAnn5過表達植株和mi基因過表達植株）以及野生型植株分別接種煙粉虱成蟲，觀察煙粉虱的取食行為、繁殖能力以及番茄植株的受害癥狀。結果顯示，雙基因過表達植株對煙粉虱的抗性顯著高于單基因過表達植株和野生型植株。在接種煙粉虱后的第12天，雙基因過表達植株上的煙粉虱若蟲數量僅為（10.67±2.15）頭，成蟲數量為（4.33±1.23）頭；而SlAnn5過表達植株上的煙粉虱若蟲數量為（18.67±2.34）頭，成蟲數量為（8.33±1.89）頭；mi基因過表達植株上的煙粉虱若蟲數量為（15.33±2.56）頭，成蟲數量為（6.67±1.56）頭；野生型植株上的煙粉虱若蟲數量達到（45.33±4.56）頭，成蟲數量為（20.67±3.56）頭。這表明SlAnn5基因與mi基因在抗煙粉虱過程中具有協(xié)同增效作用，雙基因的共同表達能夠更有效地抑制煙粉虱的繁殖和種群增長。進一步研究了SlAnn5與JA和SA信號通路關鍵基因的協(xié)同作用。通過實時熒光定量PCR技術，檢測了煙粉虱侵染后，野生型、SlAnn5基因敲除突變體和SlAnn5過表達番茄植株中JA信號通路相關基因（如LOX、AOS、JMT）和SA信號通路相關基因（如PAL、PR-1）的表達變化。結果表明，在煙粉虱侵染后，SlAnn5過表達植株中JA和SA信號通路相關基因的表達上調幅度顯著高于野生型植株；而在SlAnn5基因敲除突變體中，這些基因的表達上調幅度明顯低于野生型植株。這說明SlAnn5能夠增強JA和SA信號通路相關基因的表達，從而協(xié)同調控番茄對煙粉虱的防御反應。為了深入探究SlAnn5與其他抗蟲基因協(xié)同作用的分子機制，利用蛋白質免疫共沉淀（Co-IP）技術和酵母雙雜交技術，研究了SlAnn5與其他抗蟲基因編碼蛋白之間的相互作用。結果發(fā)現(xiàn)，SlAnn5能夠與mi基因編碼的蛋白相互作用，形成蛋白復合物。進一步的實驗表明，這種相互作用能夠激活下游的防御相關基因的表達，增強番茄對煙粉虱的抗性。此外，SlAnn5還能夠與JA和SA信號通路中的關鍵蛋白相互作用，調節(jié)信號通路的傳導，從而協(xié)同其他抗蟲基因共同發(fā)揮抗蟲作用。綜上所述，番茄膜聯(lián)蛋白SlAnn5與其他抗蟲基因在抗煙粉虱過程中具有協(xié)同作用。SlAnn5與mi基因的共同表達能夠顯著增強番茄對煙粉虱的抗性，SlAnn5還能夠通過調節(jié)JA和SA信號通路相關基因的表達，協(xié)同其他抗蟲基因共同抵御煙粉虱的侵害。這些結果為深入理解植物抗蟲的分子機制提供了新的線索，也為番茄抗煙粉虱育種提供了新的思路和策略。六、結論與展望6.1研究結論本研究通過一系列實驗，深入探究了番茄膜聯(lián)蛋白SlAnn5的抗煙粉虱功能及分子機制，取得了以下主要研究結論：SlAnn5基因的克隆與序列分析：