DB23T-土壤嗜鹽細(xì)菌與古菌資源快速分離鑒定技術(shù)規(guī)程

ICS65.020.20CCSB05FORMTEXTDBFORMTEXT23DB23/TXXXX—XXXXFORMTEXT（征求意見(jiàn)稿）FORMTEXT主要起草單位：黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料與環(huán)境資源研究所哈爾濱市芮煊科技有限公司聯(lián)系人：王爽聯(lián)系電話系信箱：wangshuang0726@163.comXXX-FORMTEXTXX-FORMTEXTXX發(fā)布FORMTEXTXXXX-FORMTEXTXX-FORMTEXTXX實(shí)施黑龍江省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布DB23/TXXXX—XXXX前言本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專(zhuān)利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專(zhuān)利的責(zé)任。本文件由黑龍江省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出。本文件起草單位：黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料與環(huán)境資源研究所、哈爾濱市芮煊科技有限公司。本文件主要起草人：王爽、趙文博、孫磊、金品嬌、李偉群、陳雪麗、萬(wàn)書(shū)明、劉凱。土壤嗜鹽細(xì)菌與古菌資源快速分離鑒定技術(shù)規(guī)程1范圍本文件規(guī)定了嗜鹽微生物、嗜鹽細(xì)菌和嗜鹽古菌的術(shù)語(yǔ)和定義，分離原則和快速鑒別的方法。本文件適用于鹽堿土壤中嗜鹽細(xì)菌和嗜鹽古菌的分離和鑒定。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T19495.2轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)要求GB/T19495.3轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)核酸提取純化方法NY/T2066-2011微生物肥料生產(chǎn)菌株鑒別--PCR方法NY/T1736-2009微生物肥料菌種鑒定技術(shù)規(guī)范NY/T1114-2006微生物肥料實(shí)驗(yàn)用培養(yǎng)基技術(shù)條件NY/T2321-2013微生物肥料產(chǎn)品檢驗(yàn)規(guī)程3術(shù)語(yǔ)和微生物肥料菌種鑒定技術(shù)規(guī)范定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1嗜鹽微生物（Halophiles）在鹽環(huán)境中生長(zhǎng)旺盛的一類(lèi)喜鹽的微生物，包括原核生物（細(xì)菌和古菌）和真核生物。根據(jù)它們對(duì)氯化鈉的需求，可分為輕度（最適鹽濃度0.2mol/L～0.5mol/L）、中度（最適鹽濃度0.5mol/L～2.5mol/L）和極端嗜鹽菌（最適鹽濃度2.5mol/L～5.2mol/L）。3.2嗜鹽細(xì)菌（Halophilicbacteria）分類(lèi)學(xué)上屬于細(xì)菌域（Bacteriadomain），在0.2mol/L～2.5mol/L鹽濃度范圍內(nèi)有最佳生長(zhǎng)的一類(lèi)微生物，主要為輕度和中度嗜鹽菌。3.3嗜鹽古菌（Halophilicarchaeon）分類(lèi)學(xué)上屬于細(xì)菌域（Archaeadomain），在含2.5mol/L～5.2mol/L鹽的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)最好的一類(lèi)極端微生物。3.4分類(lèi)（classification）用特定培養(yǎng)基分離篩選微生物，通過(guò)詳細(xì)觀察和描述一個(gè)未知名稱(chēng)純種微生物的各種性狀特征，然后查找現(xiàn)成的分類(lèi)系統(tǒng)，把各種微生物按照它們的親緣關(guān)系分群歸類(lèi)的過(guò)程。4原理嗜鹽細(xì)菌和嗜鹽古菌最適生長(zhǎng)的鹽濃度范圍不同，設(shè)計(jì)不同鹽濃度的培養(yǎng)基試驗(yàn)細(xì)菌和古菌菌株的分離。DNA是微生物的遺傳物質(zhì)，攜帶所有的遺傳信息。從DNA分子水平上進(jìn)行嗜鹽細(xì)菌和古菌鑒別的最為有效的方法。本方法采用特異性引物對(duì)待測(cè)菌株的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，通過(guò)比較PCR產(chǎn)物的有無(wú)及大小來(lái)判斷其為細(xì)菌還是古菌。5要求5.1一般要求試驗(yàn)操作人員應(yīng)具備良好的微生物學(xué)知識(shí)積累和分子生物學(xué)專(zhuān)業(yè)技能，操作熟練。實(shí)驗(yàn)室有毒、有害、廢棄物質(zhì)的處理及個(gè)人安全防護(hù)應(yīng)符合GB/T19495.2的要求。6分離方法6.1工具臺(tái)秤，2mm孔徑的篩子，往復(fù)式電動(dòng)振蕩機(jī)，錐形瓶，無(wú)菌大試管，無(wú)菌水，微量可調(diào)移液器（1000μL），培養(yǎng)皿，玻璃刮鏟，接種環(huán)，全自動(dòng)高壓滅菌鍋，超凈工作臺(tái)，靜置培養(yǎng)箱。6.1培養(yǎng)基的選擇與培養(yǎng)基平板的制備6.1.1嗜鹽細(xì)菌分離培養(yǎng)基的選擇營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（LB），復(fù)合培養(yǎng)基（CM），TSA培養(yǎng)基，R2A培養(yǎng)基，海鹽瓊脂培養(yǎng)基（2216E），培養(yǎng)基成分及配制要點(diǎn)見(jiàn)附錄A。6.1.2嗜鹽古菌分離培養(yǎng)基的選擇纖維素酪素復(fù)合鹽培養(yǎng)基（CCMS），改良的高氏一號(hào)（Cause1）培養(yǎng)基，改良ISP5培養(yǎng)基，腐殖酸（HV）培養(yǎng)基，改良的S-G培養(yǎng)基，培養(yǎng)基成分及配制按附錄A。6.1.3培養(yǎng)基平板的制備培養(yǎng)基的配制按照NY/T1114-2006中6的要求進(jìn)行。培養(yǎng)基平板的制備應(yīng)符合NY/T2321-2013中的要求，對(duì)于培養(yǎng)古菌的固體培養(yǎng)基要稍厚一些，且制備好的培養(yǎng)基應(yīng)放置無(wú)菌密封袋中于4oC保存。6.2土壤樣品的預(yù)處理及土壤懸浮液的制備新鮮土壤樣品需進(jìn)行過(guò)2mm孔徑篩的預(yù)處理，按照NY/T2321-2013中的要求用系列稀釋方法獲得不同濃度的土壤懸浮液（菌懸液）。對(duì)于不能立即用于微生物分離的新鮮土樣應(yīng)暫存于4oC冰箱中。6.3菌懸液的加樣及培養(yǎng)6.2中的土壤懸浮液按照NY/T2321-2013中的要求涂布在制備好的培養(yǎng)基平板上，在30oC～35oC恒溫靜置培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)。培養(yǎng)極端嗜鹽古菌的平板需要放在大封口袋中，并在袋中放置盛一定量水的燒杯，培養(yǎng)時(shí)間7d～10d。6.4注意事項(xiàng)a）分離古菌的培養(yǎng)基中不能含DifcoBacto-Peptone蛋白胨；b）分離古菌的培養(yǎng)基中瓊脂要先清洗后再加入，具體的方法是：稱(chēng)取16.5g瓊脂至蒸餾水中，攪拌5min，放置30min靜置沉降瓊脂，吸去上清，重復(fù)洗滌直到上清液變澄清，然后加水至50ml，再攪拌加入培養(yǎng)液中；c）高鹽濃度下瓊脂容易沉積，而且比普通的培養(yǎng)基更不容易去除氣泡，分離古菌的培養(yǎng)基應(yīng)在滅菌后的較高溫度下將瓊脂緩慢搖勻再倒平板。7鑒定方法7.1工具小型離心機(jī)，微量可調(diào)移液器（2.5μL、10μL、100μL、1000μL）及對(duì)應(yīng)的無(wú)菌Tip頭，細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，超凈工作臺(tái)，PCR儀，電泳儀及電泳槽，凝膠成像分析系統(tǒng)。7.2模板DNA的提取及其濃度測(cè)定分別設(shè)置細(xì)菌和古菌的陽(yáng)性對(duì)照，微生物基因組DNA的提取及其濃度測(cè)定按照NY/T2066-2011中5.4的要求。7.3引物的選擇細(xì)菌通用引物：27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；1492R：5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’。古菌通用引物：21F：5’-ATTCCGGTTGATCCTGCCGGA-3’；1540R：5’-AGGAGGTGATCCAGCCGCAG-3’。7.4PCR反應(yīng)以同一待測(cè)菌株的DNA為模板，分別用細(xì)菌引物和古菌引物擴(kuò)增，擴(kuò)增出目標(biāo)片段，且片段大小在1.5kb～1.6kb的為目標(biāo)菌。反應(yīng)體系和反應(yīng)參數(shù)按附錄B.1和B.2，PCR反應(yīng)的質(zhì)量控制按照NY/T2066-2011中5.2規(guī)定的方法進(jìn)行。7.4PCR產(chǎn)物檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測(cè)按照NY/T2066-2011中附錄A4.4的要求。7.5結(jié)果判定檢測(cè)方法按附錄B.3，若待測(cè)菌株的PCR反應(yīng)擴(kuò)增出與陽(yáng)性對(duì)照菌位置一致的目標(biāo)片段，且片段大小在1500bp左右，則判定待測(cè)菌株為該類(lèi)微生物。附錄A（規(guī)范性）培養(yǎng)基配方A.1纖維素酪素復(fù)合鹽培養(yǎng)基（CCMS）:微晶纖維素（Microcrystallinecellulose）,10.0g；干酪素（Casein），0.3g；KNO3，2.0g；MgSO4·7H2O，0.05g；K2HPO4，0.2g；CaCO3，0.02g；FeSO4·7H2O；0.1g；KCl，20.0g；MgCl2，30.0g；NaCl，180g～300g；Agar，18g～20g；H2O，1000mL。A.2改良的高氏一號(hào)（Cause1）培養(yǎng)基：可溶性淀粉，20.0g；KNO3，1.0g；MgSO4·7H2O，0.5g；K2HPO4，0.5g；NaCl，180g～300g；微量鹽，1mL；Agar，18g～20g；H2O，1000mL。注意：淀粉用少量冷水調(diào)成糊狀，加熱溶解后再加入到培養(yǎng)基中。A.3改良ISP5培養(yǎng)基：酵母提取物（Yeastextract），5.0g；K2PO4，1.0g；甘油，1.0g；KNO3，5.0g；天冬酰胺，1.0g；NaCl，180g～300g；Agar，18g～20g；H2O，1000mL。A.4腐殖酸（HV）培養(yǎng)基：腐殖酸（Humicacid），1.0g；Na2HPO4，0.5g；KCl，1.7g；MgSO4·7H2O，0.05g；FeSO4·7H2O，0.01g；CaCl2，1.0g；NaCl，180g～300g；Agar，18g～20g；H2O，1000mL。A.5改良的S-G培養(yǎng)基：酵母提取物（Yeastextract），10.0g；酪蛋白氨基酸（Casaminoacid），7.5g；檸檬酸鈉（Trisodiumcitrate），3.0g；KCl，2.0g；MgSO4·7H2O，0.2g；FeSO4·7H2O，0.036g；NaCl，180g～300g；Agar，18g～20g；H2O，1000mL。A.6培養(yǎng)基pH值的調(diào)節(jié)：對(duì)于嗜堿性的嗜鹽細(xì)菌或古菌，可利用碳酸鈉或碳酸氫鈉來(lái)調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值，碳酸鈉溶液應(yīng)用用培養(yǎng)基總體積中的一小部分水來(lái)單獨(dú)溶解，滅菌后與培養(yǎng)基其余成分混勻再倒平板。不同碳酸鈉濃度對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)基pH值如下表1：表1不同碳酸鈉濃度對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)基pH值NaCO3的質(zhì)量體積比（w/v）對(duì)應(yīng)培養(yǎng)基pH值0.5%7.5～7.70.6%7.8～7.90.7%7.9～8.01.0%8.2～8.52.0%9.0～9.55.0%9.5～10.010.0%10.5～11.0附錄B（規(guī)范性）PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序B.1PCR反應(yīng)體系PCR反應(yīng)總體積為30μL：10×PCRbuffer，3.0μL；dNTP（25mM），2.5μL；正向引物，1.5μL；反向引物，1.5μL；10ng～50ng的DNA模板，1.0μL；IUTaqDNA聚合酶，0.3μL；加水至總體積30μL。B.2