低分化食管鱗癌靶向核酸適配體的篩選、鑒定及性能研究

低分化食管鱗癌靶向核酸適配體的篩選、鑒定及性能研究一、引言1.1研究背景與意義食管癌是全球范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅人類健康的惡性腫瘤之一，在2020年，其新發(fā)病例數(shù)約60.4萬，死亡病例數(shù)約54.4萬，分別位居全球惡性腫瘤發(fā)病和死亡的第7位和第6位。在我國(guó)，食管癌的形勢(shì)更為嚴(yán)峻，每年新發(fā)病例約32.5萬，死亡病例約30.5萬，發(fā)病率和死亡率均位居國(guó)內(nèi)惡性腫瘤的第5位。食管鱗癌（ESCC）是食管癌的主要組織學(xué)類型，在我國(guó)約占食管癌病例的90%。低分化食管鱗癌作為食管鱗癌的一種特殊亞型，其癌細(xì)胞分化程度低，與正常食管上皮細(xì)胞形態(tài)差異顯著，呈現(xiàn)出細(xì)胞核增大、染色質(zhì)增多且分布不均、核仁明顯等特征。這種低分化特性使得癌細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，侵襲和轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)，患者預(yù)后較差。臨床數(shù)據(jù)顯示，低分化食管鱗癌患者的5年生存率通常低于20%，遠(yuǎn)低于高、中分化食管鱗癌患者。當(dāng)前，低分化食管鱗癌的治療手段主要包括手術(shù)切除、化療和放療。手術(shù)切除對(duì)于早期患者有一定的治愈機(jī)會(huì)，但由于低分化食管鱗癌早期癥狀隱匿，多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期，腫瘤常侵犯周圍組織或發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，使得手術(shù)切除難度增大，且術(shù)后復(fù)發(fā)率高?；熀头暖熾m能在一定程度上控制腫瘤進(jìn)展，但它們?nèi)狈?duì)腫瘤細(xì)胞的特異性識(shí)別和靶向作用，在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，也會(huì)對(duì)正常組織細(xì)胞造成損傷，引發(fā)一系列嚴(yán)重的副作用，如骨髓抑制、胃腸道反應(yīng)、肝腎功能損害等，導(dǎo)致患者生活質(zhì)量下降，且部分患者會(huì)出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象，使得治療效果大打折扣。核酸適配體（Aptamer）是一種通過指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（SELEX）從隨機(jī)單鏈核酸序列庫(kù)中篩選獲得的短單鏈DNA或RNA分子。它能通過自身折疊形成特定的三維結(jié)構(gòu)，與靶標(biāo)分子特異性結(jié)合，具有高親和力和高特異性，解離常數(shù)可達(dá)皮摩爾到納摩爾水平，被形象地稱為“化學(xué)抗體”，在功能上與傳統(tǒng)抗體相當(dāng)。與傳統(tǒng)抗體相比，核酸適配體具有諸多獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。在合成與修飾方面，它可通過化學(xué)合成獲得，制備過程相對(duì)簡(jiǎn)單、成本低，且易于進(jìn)行各種化學(xué)修飾，如熒光標(biāo)記、生物素標(biāo)記、PEG化修飾等，便于其在診斷和治療中的應(yīng)用。在穩(wěn)定性上，核酸適配體化學(xué)穩(wěn)定性高，能在不同的溫度、pH值等條件下保持結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定。從組織穿透性來看，其分子小，組織穿透能力強(qiáng)，能夠更容易地到達(dá)腫瘤組織部位。此外，核酸適配體還具有低毒性和低免疫原性的特點(diǎn)，減少了治療過程中對(duì)機(jī)體的不良影響。近年來，核酸適配體在癌癥診療領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的潛力。在癌癥診斷方面，它可作為分子探針用于腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)癌癥的早期診斷和精準(zhǔn)分型。例如，通過篩選得到的特異性識(shí)別膀胱癌細(xì)胞的核酸適配體，能夠區(qū)分正常細(xì)胞和癌細(xì)胞，為膀胱癌的早期診斷提供了新的策略。在癌癥治療中，核酸適配體可用于構(gòu)建靶向藥物遞送系統(tǒng)，將化療藥物、基因治療藥物等精準(zhǔn)地遞送至腫瘤細(xì)胞，提高藥物療效，降低毒副作用。如將核酸適配體與小劑量高毒性化療藥物結(jié)合，注入小鼠體內(nèi)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)前列腺腫瘤的靶向殺傷，且不傷害健康組織。鑒于低分化食管鱗癌的嚴(yán)峻現(xiàn)狀以及現(xiàn)有治療手段的局限性，篩選出特異性靶向低分化食管鱗癌的核酸適配體具有重要意義。一方面，核酸適配體可作為新型的診斷標(biāo)志物，用于低分化食管鱗癌的早期診斷和病情監(jiān)測(cè)，提高診斷的準(zhǔn)確性和敏感性，為患者的早期治療提供依據(jù)。另一方面，以核酸適配體為基礎(chǔ)構(gòu)建的靶向治療體系，有望實(shí)現(xiàn)對(duì)低分化食管鱗癌細(xì)胞的精準(zhǔn)打擊，克服傳統(tǒng)治療方法的弊端，提高治療效果，改善患者的預(yù)后和生活質(zhì)量。這不僅有助于推動(dòng)低分化食管鱗癌診療技術(shù)的發(fā)展，也為其他惡性腫瘤的治療提供了新思路和方法。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在低分化食管鱗癌的核酸適配體篩選方面，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已開展了一系列研究。國(guó)外如美國(guó)的科研團(tuán)隊(duì)利用Cell-SELEX技術(shù)，以低分化食管鱗癌細(xì)胞系為靶標(biāo)，從隨機(jī)單鏈核酸序列庫(kù)中進(jìn)行篩選，成功獲得了與低分化食管鱗癌細(xì)胞具有特異性結(jié)合能力的核酸適配體。國(guó)內(nèi)鄭州大學(xué)袁寶銀、劉康棟老師團(tuán)隊(duì)同樣運(yùn)用Cell-SELEX技術(shù)，篩選出可以特異性識(shí)別食管鱗癌細(xì)胞系（包括低分化細(xì)胞系）的核酸適配體，通過組織成像證明核酸適配體A2可識(shí)別病人食管鱗癌組織，還鑒定出該aptamer結(jié)合的靶標(biāo)為整合素β1。這些研究成果為低分化食管鱗癌的靶向診療提供了重要的基礎(chǔ)。在核酸適配體的性能研究方面，國(guó)內(nèi)外主要聚焦于其親和力、特異性以及穩(wěn)定性等關(guān)鍵性能。對(duì)于親和力，科研人員通過表面等離子共振（SPR）技術(shù)、等溫滴定量熱法（ITC）等手段精確測(cè)定核酸適配體與靶標(biāo)分子的結(jié)合常數(shù)，以此評(píng)估親和力的高低。在特異性研究中，運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)、免疫熒光等方法，對(duì)比核酸適配體與不同細(xì)胞或分子的結(jié)合情況，驗(yàn)證其對(duì)低分化食管鱗癌細(xì)胞的特異性識(shí)別能力。在穩(wěn)定性方面，研究人員探索各種化學(xué)修飾方法，如在核酸適配體的骨架或堿基上引入修飾基團(tuán)，以增強(qiáng)其對(duì)核酸酶的抗性，延長(zhǎng)在體內(nèi)的半衰期。例如，對(duì)核酸適配體進(jìn)行2'-O-甲基化修飾，可有效提高其穩(wěn)定性，減少被核酸酶降解的風(fēng)險(xiǎn)。在核酸適配體的應(yīng)用研究領(lǐng)域，國(guó)內(nèi)外均取得了一定進(jìn)展。在診斷應(yīng)用方面，國(guó)外有研究將核酸適配體與納米材料相結(jié)合，構(gòu)建熒光納米探針，用于低分化食管鱗癌的早期診斷，實(shí)現(xiàn)了對(duì)腫瘤標(biāo)志物的高靈敏檢測(cè)。國(guó)內(nèi)也有類似研究，通過將核酸適配體固定在傳感器表面，開發(fā)出新型的生物傳感器，用于檢測(cè)低分化食管鱗癌相關(guān)的生物標(biāo)志物，具有操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)快速等優(yōu)點(diǎn)。在治療應(yīng)用方面，國(guó)外有團(tuán)隊(duì)將核酸適配體與化療藥物偶聯(lián)，構(gòu)建靶向藥物遞送系統(tǒng)，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中展現(xiàn)出對(duì)低分化食管鱗癌腫瘤生長(zhǎng)的有效抑制作用。國(guó)內(nèi)譚蔚泓院士團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種利用細(xì)菌負(fù)載核酸適配體-藥物偶聯(lián)物的胰腺癌協(xié)同療法，這種策略也為低分化食管鱗癌的治療提供了新思路，即通過結(jié)合細(xì)菌的穿透能力和核酸適配體-藥物偶聯(lián)物的靶向和毒性作用，實(shí)現(xiàn)優(yōu)化的藥物遞送、增強(qiáng)治療效果和激活靶向免疫反應(yīng)。盡管國(guó)內(nèi)外在低分化食管鱗癌的核酸適配體研究方面取得了一定成果，但仍存在一些不足之處。在篩選技術(shù)方面，傳統(tǒng)的SELEX技術(shù)存在篩選周期長(zhǎng)、工作量大、篩選效率低等問題，難以快速獲得高親和力和高特異性的核酸適配體。在性能優(yōu)化方面，雖然目前對(duì)核酸適配體的親和力、特異性和穩(wěn)定性有了一定的研究，但如何進(jìn)一步提高其性能，尤其是在復(fù)雜的體內(nèi)環(huán)境下的性能，仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)。例如，如何在保證核酸適配體特異性的同時(shí)，提高其對(duì)腫瘤細(xì)胞的親和力，以及如何增強(qiáng)其在體內(nèi)的穩(wěn)定性，減少非特異性結(jié)合和免疫原性，都是亟待解決的問題。在應(yīng)用研究方面，從實(shí)驗(yàn)室研究到臨床應(yīng)用的轉(zhuǎn)化過程中，還面臨著諸多障礙，如核酸適配體的大規(guī)模制備工藝、質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)、安全性評(píng)價(jià)體系等尚未完善，這些都限制了核酸適配體在低分化食管鱗癌臨床治療中的廣泛應(yīng)用。此外，對(duì)于核酸適配體與腫瘤細(xì)胞相互作用的分子機(jī)制研究還不夠深入，這也制約了其在腫瘤治療中的進(jìn)一步發(fā)展。因此，未來需要在篩選技術(shù)創(chuàng)新、性能優(yōu)化策略以及應(yīng)用轉(zhuǎn)化研究等方面加大研究力度，以推動(dòng)低分化食管鱗癌的核酸適配體研究取得更大的突破。1.3研究?jī)?nèi)容與方法1.3.1靶向低分化食管鱗癌核酸適配體的篩選運(yùn)用Cell-SELEX技術(shù)，以低分化食管鱗癌細(xì)胞系（如KYSE410細(xì)胞系）為靶標(biāo)，從隨機(jī)單鏈核酸序列庫(kù)中進(jìn)行篩選。將隨機(jī)核酸文庫(kù)與靶細(xì)胞在適宜的緩沖液條件下孵育，讓核酸分子與靶細(xì)胞表面的靶標(biāo)分子充分結(jié)合，隨后通過洗滌去除未結(jié)合及非特異性結(jié)合的核酸分子，再對(duì)特異性結(jié)合的核酸分子進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)過多輪篩選，逐步富集與低分化食管鱗癌細(xì)胞具有高親和力和高特異性的核酸適配體。在篩選過程中，每一輪篩選后都通過流式細(xì)胞術(shù)分析核酸文庫(kù)與靶細(xì)胞的結(jié)合情況，監(jiān)測(cè)篩選效果，確保篩選得到的核酸適配體具有良好的結(jié)合性能。1.3.2核酸適配體的性能研究對(duì)篩選得到的核酸適配體，利用表面等離子共振（SPR）技術(shù)測(cè)定其與低分化食管鱗癌細(xì)胞的親和力，獲取解離常數(shù)（KD值），以此評(píng)估核酸適配體與靶細(xì)胞結(jié)合的緊密程度；通過流式細(xì)胞術(shù)，對(duì)比核酸適配體與低分化食管鱗癌細(xì)胞、正常食管上皮細(xì)胞以及其他腫瘤細(xì)胞系的結(jié)合情況，驗(yàn)證其對(duì)低分化食管鱗癌細(xì)胞的特異性識(shí)別能力；采用核酸酶消化實(shí)驗(yàn)，在不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)核酸適配體的完整性，研究其對(duì)核酸酶的抗性，評(píng)估穩(wěn)定性。同時(shí)，利用圓二色譜（CD）和核磁共振（NMR）技術(shù)分析核酸適配體的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，探究結(jié)構(gòu)與性能之間的關(guān)系。1.3.3核酸適配體的應(yīng)用探索將核酸適配體標(biāo)記熒光基團(tuán)（如FAM熒光素），與低分化食管鱗癌細(xì)胞進(jìn)行共孵育，通過熒光顯微鏡觀察核酸適配體在細(xì)胞內(nèi)的攝取情況和定位分布，研究其細(xì)胞內(nèi)化機(jī)制；構(gòu)建核酸適配體-化療藥物（如順鉑、紫杉醇）偶聯(lián)物，利用高效液相色譜（HPLC）和質(zhì)譜（MS）技術(shù)對(duì)其進(jìn)行表征，驗(yàn)證偶聯(lián)物的成功構(gòu)建。將偶聯(lián)物作用于低分化食管鱗癌細(xì)胞，通過MTT法、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞增殖和凋亡情況，評(píng)估偶聯(lián)物對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效果。在荷瘤小鼠模型中，尾靜脈注射核酸適配體-化療藥物偶聯(lián)物，觀察腫瘤生長(zhǎng)情況、測(cè)量腫瘤體積和重量，評(píng)價(jià)其在體內(nèi)的抗腫瘤效果。同時(shí)，通過組織切片的蘇木精-伊紅（HE）染色、免疫組化分析等方法，檢測(cè)偶聯(lián)物對(duì)小鼠重要臟器的影響，評(píng)估其安全性。1.3.4數(shù)據(jù)分析方法對(duì)于篩選過程中流式細(xì)胞術(shù)得到的數(shù)據(jù)，使用FlowJo軟件進(jìn)行分析，統(tǒng)計(jì)不同熒光強(qiáng)度下的細(xì)胞比例，評(píng)估核酸文庫(kù)與靶細(xì)胞的結(jié)合效率；在親和力測(cè)定中，利用SPR儀器自帶的軟件對(duì)SPR數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，計(jì)算解離常數(shù)；在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，所得數(shù)據(jù)采用GraphPadPrism軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)選擇合適的統(tǒng)計(jì)方法，如單因素方差分析（One-wayANOVA）、Student'st檢驗(yàn)等，以P<0.05作為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)，從而準(zhǔn)確評(píng)估實(shí)驗(yàn)結(jié)果，揭示核酸適配體的性能和應(yīng)用效果。1.4研究創(chuàng)新點(diǎn)在篩選技術(shù)方面，對(duì)傳統(tǒng)的Cell-SELEX技術(shù)進(jìn)行創(chuàng)新改進(jìn)。引入微流控芯片技術(shù)，將篩選過程集成到微流控芯片上進(jìn)行。芯片上的微通道結(jié)構(gòu)可精確控制核酸文庫(kù)與靶細(xì)胞的孵育、洗滌和擴(kuò)增等步驟，實(shí)現(xiàn)高通量、自動(dòng)化篩選。這種技術(shù)能夠顯著縮短篩選周期，從傳統(tǒng)的數(shù)周甚至數(shù)月縮短至數(shù)天，同時(shí)減少試劑消耗，降低篩選成本。此外，結(jié)合機(jī)器學(xué)習(xí)算法，對(duì)篩選過程中的數(shù)據(jù)進(jìn)行實(shí)時(shí)分析和反饋，指導(dǎo)篩選條件的優(yōu)化，提高篩選效率，更快速地獲得高親和力和高特異性的核酸適配體，這是以往研究中所未采用的新穎策略。在適配體性能優(yōu)化上，提出一種全新的多修飾協(xié)同策略。在核酸適配體的不同位點(diǎn)分別引入2'-O-甲基化修飾、鎖核酸（LNA）修飾以及PEG化修飾。2'-O-甲基化修飾增強(qiáng)核酸適配體對(duì)核酸酶的抗性，提高其在體內(nèi)的穩(wěn)定性；LNA修飾可調(diào)節(jié)核酸適配體的二級(jí)結(jié)構(gòu)，使其與靶標(biāo)分子的結(jié)合更加緊密，從而提升親和力；PEG化修飾則改善核酸適配體的水溶性和生物相容性，減少非特異性結(jié)合，降低免疫原性。通過這種多修飾協(xié)同的方式，全面優(yōu)化核酸適配體的性能，克服了以往單一修飾效果有限的問題，為核酸適配體的性能提升開辟了新途徑。在應(yīng)用拓展領(lǐng)域，首次探索將核酸適配體與基因編輯技術(shù)相結(jié)合。利用核酸適配體的靶向性，將基因編輯工具（如CRISPR-Cas9系統(tǒng)）精準(zhǔn)遞送至低分化食管鱗癌細(xì)胞中，實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤相關(guān)基因的定點(diǎn)編輯。通過敲除或修復(fù)與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)的基因，從基因?qū)用嬉种颇[瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，為低分化食管鱗癌的治療提供了一種全新的治療模式。這種跨領(lǐng)域的創(chuàng)新應(yīng)用，拓展了核酸適配體在腫瘤治療中的應(yīng)用邊界，有望為癌癥治療帶來新的突破。二、低分化食管鱗癌與核酸適配體概述2.1低分化食管鱗癌2.1.1低分化食管鱗癌的定義與特點(diǎn)低分化食管鱗癌是食管鱗癌的一種特殊類型，其分化程度低，癌細(xì)胞形態(tài)與正常食管上皮細(xì)胞存在顯著差異。在病理形態(tài)學(xué)上，低分化食管鱗癌細(xì)胞的細(xì)胞核明顯增大，染色質(zhì)增多且分布不均勻，核仁顯著，細(xì)胞排列紊亂，極性消失。這種低分化的特性使得癌細(xì)胞的惡性程度較高，具有生長(zhǎng)迅速、侵襲能力強(qiáng)和易轉(zhuǎn)移等特點(diǎn)。與高、中分化食管鱗癌相比，低分化食管鱗癌患者的病情進(jìn)展更為迅速，預(yù)后情況較差。低分化食管鱗癌生長(zhǎng)迅速，主要是由于其細(xì)胞增殖活性高，細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制紊亂，癌細(xì)胞不斷進(jìn)行分裂增殖，導(dǎo)致腫瘤體積快速增大。侵襲能力強(qiáng)表現(xiàn)為癌細(xì)胞能夠突破食管的基底膜，侵犯食管周圍的組織和器官，如氣管、支氣管、主動(dòng)脈等，引起相應(yīng)的臨床癥狀，如吞咽困難加重、呼吸困難、咯血等。易轉(zhuǎn)移是低分化食管鱗癌的又一顯著特點(diǎn)，癌細(xì)胞可通過淋巴道轉(zhuǎn)移至附近的淋巴結(jié)，也可通過血液循環(huán)轉(zhuǎn)移至遠(yuǎn)處器官，如肝臟、肺部、骨骼等，一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移，治療難度將大幅增加，患者的生存幾率也會(huì)顯著降低。臨床研究表明，低分化食管鱗癌患者在確診后的短時(shí)間內(nèi)，病情往往會(huì)迅速惡化，5年生存率通常低于20%，嚴(yán)重威脅患者的生命健康。2.1.2低分化食管鱗癌的發(fā)病機(jī)制與流行病學(xué)低分化食管鱗癌的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，涉及多種因素的相互作用。遺傳因素在其發(fā)病中起到一定作用，某些基因突變或多態(tài)性可能增加個(gè)體對(duì)低分化食管鱗癌的易感性。例如，TP53基因的突變?cè)诘头只彻荀[癌中較為常見，該基因突變會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞周期調(diào)控異常，使細(xì)胞更容易發(fā)生癌變。環(huán)境因素也是重要的致病因素，長(zhǎng)期吸煙、過度飲酒、食用過熱或腌制食物等不良生活習(xí)慣，以及暴露于某些化學(xué)物質(zhì)和污染物中，都可能對(duì)食管黏膜造成損傷，引發(fā)慢性炎癥，進(jìn)而促使食管上皮細(xì)胞發(fā)生異常增生和癌變。此外，人乳頭瘤病毒（HPV）感染與低分化食管鱗癌的發(fā)生也存在一定關(guān)聯(lián)，HPV的某些亞型可能通過其病毒蛋白干擾宿主細(xì)胞的正常生理功能，誘導(dǎo)細(xì)胞癌變。從流行病學(xué)角度來看，低分化食管鱗癌在全球范圍內(nèi)均有發(fā)病，但分布存在明顯的地域差異。在亞洲，尤其是中國(guó)、日本和韓國(guó)等國(guó)家，食管癌的發(fā)病率相對(duì)較高，其中低分化食管鱗癌占一定比例。在中國(guó)，食管癌是常見的惡性腫瘤之一，低分化食管鱗癌在食管鱗癌病例中所占比例不容忽視。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)每年新診斷的食管癌患者中，約有30%-40%為低分化食管鱗癌。而且，隨著人口老齡化的加劇以及不良生活方式的普遍存在，低分化食管鱗癌的發(fā)病呈上升趨勢(shì)。這種嚴(yán)峻的發(fā)病形勢(shì)，不僅給患者的健康帶來巨大威脅，也給社會(huì)和家庭帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，凸顯了對(duì)低分化食管鱗癌進(jìn)行深入研究和有效防控的緊迫性。2.1.3低分化食管鱗癌的現(xiàn)有治療方法及局限性目前，低分化食管鱗癌的治療方法主要包括手術(shù)治療、化療和放療，這些傳統(tǒng)治療手段在一定程度上能夠控制腫瘤的發(fā)展，但也存在諸多局限性。手術(shù)治療是早期低分化食管鱗癌的主要治療方法之一，通過切除腫瘤組織，有望實(shí)現(xiàn)根治。然而，由于低分化食管鱗癌早期癥狀不明顯，多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期，腫瘤往往侵犯周圍組織或發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，使得手術(shù)切除難度增大，且術(shù)后復(fù)發(fā)率較高。研究顯示，中晚期低分化食管鱗癌患者手術(shù)后的5年生存率僅為10%-30%。此外，手術(shù)還可能帶來一系列并發(fā)癥，如吻合口瘺、肺部感染、乳糜胸等，嚴(yán)重影響患者的康復(fù)和生活質(zhì)量?；熓抢没瘜W(xué)藥物殺死癌細(xì)胞的治療方法，常用的化療藥物包括順鉑、紫杉醇、氟尿嘧啶等?；熆梢酝ㄟ^全身用藥，對(duì)潛在的轉(zhuǎn)移病灶起到一定的控制作用。但化療藥物缺乏對(duì)腫瘤細(xì)胞的特異性識(shí)別能力，在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，也會(huì)對(duì)正常組織細(xì)胞造成損傷，引發(fā)多種副作用。常見的副作用有骨髓抑制，導(dǎo)致白細(xì)胞、血小板減少，使患者免疫力下降，容易發(fā)生感染；胃腸道反應(yīng)，如惡心、嘔吐、腹瀉等，影響患者的營(yíng)養(yǎng)攝入和身體狀況；肝腎功能損害，可能導(dǎo)致肝腎功能異常，進(jìn)一步影響患者的健康。而且，部分患者在化療過程中會(huì)出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象，使得化療效果逐漸降低，病情難以得到有效控制。放療則是利用高能射線照射腫瘤組織，殺死癌細(xì)胞。放療可分為根治性放療和姑息性放療，對(duì)于不能手術(shù)的患者，放療可作為主要的治療手段。但放療同樣存在副作用，如放射性食管炎、放射性肺炎、放射性脊髓炎等，這些副作用會(huì)給患者帶來痛苦，限制放療的劑量和療程。同時(shí)，放療對(duì)正常組織的損傷也會(huì)影響患者的生活質(zhì)量，且放療后腫瘤局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的情況仍較為常見。綜上所述，手術(shù)、化療和放療等現(xiàn)有治療方法在低分化食管鱗癌的治療中雖有一定作用，但都存在療效不佳、副作用大、易耐藥等局限性，迫切需要尋找新的治療方法，以提高低分化食管鱗癌患者的治療效果和生存質(zhì)量。2.2核酸適配體2.2.1核酸適配體的結(jié)構(gòu)與功能核酸適配體是一段單鏈寡核苷酸序列，通常由20-100個(gè)核苷酸組成，這些核苷酸可以是DNA、RNA或經(jīng)過化學(xué)修飾的核酸類似物。其獨(dú)特之處在于，單鏈核酸在溶液中能夠通過堿基互補(bǔ)配對(duì)、堿基堆積以及其他非共價(jià)相互作用，如氫鍵、范德華力和靜電作用等，折疊形成復(fù)雜且穩(wěn)定的三維結(jié)構(gòu)。這些三維結(jié)構(gòu)包括莖環(huán)結(jié)構(gòu)、發(fā)夾結(jié)構(gòu)、G-四鏈體結(jié)構(gòu)、假結(jié)結(jié)構(gòu)等，其中莖環(huán)結(jié)構(gòu)是較為常見的一種，由一段雙鏈莖區(qū)和一個(gè)單鏈環(huán)區(qū)組成，雙鏈莖區(qū)通過堿基互補(bǔ)配對(duì)形成穩(wěn)定的雙螺旋結(jié)構(gòu)，單鏈環(huán)區(qū)則可以與靶標(biāo)分子發(fā)生特異性相互作用。G-四鏈體結(jié)構(gòu)是由富含鳥嘌呤（G）的核酸序列在一定條件下形成的特殊結(jié)構(gòu)，由多個(gè)鳥嘌呤平面通過Hoogsteen氫鍵相互連接而成，具有高度的穩(wěn)定性和獨(dú)特的生物學(xué)功能。核酸適配體的主要功能是與靶標(biāo)分子特異性結(jié)合，這種結(jié)合具有高度的親和力和特異性，其解離常數(shù)（KD值）通常在皮摩爾（pM）到納摩爾（nM）級(jí)別，能夠精確識(shí)別和結(jié)合各種靶標(biāo)分子，包括蛋白質(zhì)、小分子、細(xì)胞、病毒等。其作用機(jī)制是基于適配體的三維結(jié)構(gòu)與靶標(biāo)分子表面的特定區(qū)域之間形成互補(bǔ)的空間構(gòu)象和相互作用。當(dāng)適配體與靶標(biāo)分子相遇時(shí)，適配體的特定結(jié)構(gòu)區(qū)域能夠與靶標(biāo)分子的活性位點(diǎn)或關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域緊密結(jié)合，就像鑰匙與鎖的關(guān)系一樣，通過分子間的各種作用力，如氫鍵、靜電作用、疏水作用等，形成穩(wěn)定的復(fù)合物。例如，適配體與蛋白質(zhì)靶標(biāo)結(jié)合時(shí)，適配體的環(huán)區(qū)或特定結(jié)構(gòu)域可以插入蛋白質(zhì)的活性口袋或與蛋白質(zhì)表面的關(guān)鍵氨基酸殘基相互作用，從而影響蛋白質(zhì)的活性、功能或信號(hào)傳導(dǎo)通路。對(duì)于小分子靶標(biāo)，適配體則通過精確的空間互補(bǔ)和分子間作用力，將小分子包裹在其結(jié)構(gòu)內(nèi)部，實(shí)現(xiàn)特異性結(jié)合。這種特異性結(jié)合能力使得核酸適配體在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景，可用于疾病診斷、治療以及生物分析等多個(gè)方面。2.2.2核酸適配體的篩選技術(shù)核酸適配體的篩選主要依賴于指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（SELEX），該技術(shù)由Tuerk和Gold于1990年首次提出，是一種從隨機(jī)單鏈核酸序列庫(kù)中篩選出與靶標(biāo)分子具有高親和力和高特異性核酸適配體的體外篩選方法。其基本原理是利用核酸分子的多樣性和可進(jìn)化性，通過多輪的篩選和富集過程，從包含1013-101?種不同序列的隨機(jī)核酸文庫(kù)中，逐步篩選出能夠與靶標(biāo)分子特異性結(jié)合的核酸適配體。SELEX技術(shù)的具體過程包括以下幾個(gè)關(guān)鍵步驟：首先，構(gòu)建一個(gè)隨機(jī)核酸文庫(kù)，該文庫(kù)通常由一段固定序列和中間的隨機(jī)序列組成，固定序列用于后續(xù)的PCR擴(kuò)增，隨機(jī)序列則提供了核酸分子的多樣性。然后，將隨機(jī)核酸文庫(kù)與靶標(biāo)分子在適宜的緩沖液條件下進(jìn)行孵育，使核酸分子與靶標(biāo)分子充分接觸，部分核酸分子會(huì)通過自身折疊形成特定結(jié)構(gòu)與靶標(biāo)分子結(jié)合。接著，通過洗滌步驟去除未結(jié)合及非特異性結(jié)合的核酸分子，保留與靶標(biāo)分子特異性結(jié)合的核酸分子。之后，對(duì)特異性結(jié)合的核酸分子進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使其數(shù)量得到大量增加，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)與靶標(biāo)分子結(jié)合的核酸序列的富集。將擴(kuò)增后的核酸分子作為下一輪篩選的文庫(kù)，重復(fù)上述孵育、洗滌、擴(kuò)增的過程，經(jīng)過多輪篩選后，與靶標(biāo)分子結(jié)合能力強(qiáng)的核酸適配體在文庫(kù)中的比例逐漸提高，最終得到高親和力和高特異性的核酸適配體。在篩選過程中，每一輪篩選后都需要對(duì)核酸文庫(kù)與靶標(biāo)分子的結(jié)合情況進(jìn)行分析，常用的分析方法包括電泳分析、流式細(xì)胞術(shù)分析等，以監(jiān)測(cè)篩選效果，確保篩選過程的有效性。以活細(xì)胞為靶點(diǎn)的Cell-SELEX技術(shù)是SELEX技術(shù)的一種重要改進(jìn)形式，在篩選針對(duì)低分化食管鱗癌細(xì)胞適配體方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。傳統(tǒng)的SELEX技術(shù)多以純化的蛋白或小分子為靶標(biāo)，然而在實(shí)際生物體內(nèi)，細(xì)胞表面的分子處于復(fù)雜的環(huán)境中，且細(xì)胞表面的分子表達(dá)和修飾情況與純化狀態(tài)下存在差異。Cell-SELEX技術(shù)直接以完整的活細(xì)胞作為靶標(biāo)，能夠充分考慮細(xì)胞表面天然的分子構(gòu)象和微環(huán)境，篩選得到的核酸適配體可以更好地識(shí)別細(xì)胞表面的多種靶標(biāo)分子，包括蛋白質(zhì)、糖蛋白、脂蛋白等，且能夠識(shí)別細(xì)胞表面分子之間的相互作用以及細(xì)胞表面的動(dòng)態(tài)變化。這使得篩選得到的核酸適配體對(duì)低分化食管鱗癌細(xì)胞具有更高的特異性和親和力，更符合實(shí)際應(yīng)用的需求。例如，在篩選過程中，核酸適配體可以識(shí)別低分化食管鱗癌細(xì)胞表面過表達(dá)或特異性表達(dá)的腫瘤標(biāo)志物，如表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）、細(xì)胞角蛋白19片段（CYFRA21-1）等，而對(duì)正常食管上皮細(xì)胞的結(jié)合較弱，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)低分化食管鱗癌細(xì)胞的精準(zhǔn)識(shí)別和靶向作用。此外，Cell-SELEX技術(shù)還可以在篩選過程中引入競(jìng)爭(zhēng)細(xì)胞，如正常食管上皮細(xì)胞，進(jìn)一步提高篩選得到的核酸適配體對(duì)低分化食管鱗癌細(xì)胞的特異性，減少非特異性結(jié)合，為后續(xù)的診斷和治療應(yīng)用提供更可靠的基礎(chǔ)。2.2.3核酸適配體的特點(diǎn)與優(yōu)勢(shì)與傳統(tǒng)抗體相比，核酸適配體在多個(gè)方面展現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。在合成與修飾方面，核酸適配體的合成相對(duì)簡(jiǎn)便，可通過化學(xué)合成方法大量制備，其合成過程不受生物體系的限制，成本較低，且易于進(jìn)行各種化學(xué)修飾。通過固相合成技術(shù)，可以精確控制核酸適配體的序列和長(zhǎng)度，合成過程具有高度的可重復(fù)性和可控性。在修飾方面，核酸適配體可以在其骨架、堿基或末端引入各種修飾基團(tuán)，如熒光基團(tuán)（如FAM、TAMRA等）、生物素、放射性核素、PEG（聚乙二醇）等。熒光基團(tuán)修飾可用于核酸適配體的熒光標(biāo)記，便于在細(xì)胞和體內(nèi)成像研究中追蹤其分布和作用過程；生物素修飾則有利于核酸適配體與親和素或鏈霉親和素的結(jié)合，用于構(gòu)建生物傳感器或進(jìn)行親和純化；放射性核素修飾可用于放射性診斷和治療；PEG化修飾能夠改善核酸適配體的水溶性和生物相容性，延長(zhǎng)其在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間，降低免疫原性。而傳統(tǒng)抗體的制備需要通過免疫動(dòng)物，經(jīng)過復(fù)雜的免疫反應(yīng)和雜交瘤技術(shù)，制備周期長(zhǎng)，成本高，且抗體的修飾相對(duì)困難，容易影響其活性和特異性。從穩(wěn)定性角度來看，核酸適配體具有較高的化學(xué)穩(wěn)定性，在不同的溫度、pH值和離子強(qiáng)度條件下，仍能保持其結(jié)構(gòu)和功能的相對(duì)穩(wěn)定。核酸適配體的磷酸二酯骨架結(jié)構(gòu)使其對(duì)化學(xué)降解具有一定的抗性，且在適當(dāng)?shù)谋４鏃l件下，如低溫、干燥環(huán)境，可長(zhǎng)時(shí)間保存而不喪失活性。此外，通過對(duì)核酸適配體進(jìn)行化學(xué)修飾，如2'-O-甲基化修飾、鎖核酸（LNA）修飾等，可以進(jìn)一步增強(qiáng)其對(duì)核酸酶的抗性，提高在體內(nèi)的穩(wěn)定性。相比之下，蛋白質(zhì)抗體對(duì)環(huán)境因素較為敏感，在高溫、極端pH值等條件下容易發(fā)生變性，導(dǎo)致活性喪失，且在體內(nèi)易被蛋白酶降解，半衰期較短。在免疫原性和組織穿透性方面，核酸適配體具有明顯優(yōu)勢(shì)。核酸適配體是由核酸分子組成，屬于非蛋白質(zhì)類物質(zhì)，在體內(nèi)幾乎不引起免疫反應(yīng)，具有極低的免疫原性，這使得其在體內(nèi)應(yīng)用時(shí)不會(huì)引發(fā)免疫排斥等不良反應(yīng)，安全性較高。而傳統(tǒng)抗體作為蛋白質(zhì)，可能會(huì)引起機(jī)體的免疫反應(yīng)，尤其是對(duì)于異源抗體，免疫原性問題更為突出，可能導(dǎo)致過敏反應(yīng)、血清病等不良反應(yīng)，限制了其在臨床治療中的應(yīng)用。核酸適配體分子相對(duì)較小，通常由幾十到幾百個(gè)核苷酸組成，分子量遠(yuǎn)小于傳統(tǒng)抗體，這賦予了其良好的組織穿透能力。核酸適配體能夠更容易地穿透生物膜、組織間隙等，到達(dá)腫瘤組織部位，實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的靶向作用。在腫瘤治療中，核酸適配體可以更有效地穿透腫瘤組織的血管壁和細(xì)胞外基質(zhì)，進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)部，發(fā)揮其治療作用，而傳統(tǒng)抗體由于分子量大，在組織中的擴(kuò)散和穿透能力受限，影響了其對(duì)腫瘤細(xì)胞的靶向效果。綜上所述，核酸適配體在合成、修飾、穩(wěn)定性、免疫原性和組織穿透性等方面的優(yōu)勢(shì)，使其在腫瘤診療領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景，有望成為傳統(tǒng)抗體的有力替代物。2.2.4核酸適配體在腫瘤診療中的應(yīng)用進(jìn)展核酸適配體在腫瘤診療領(lǐng)域展現(xiàn)出了廣泛的應(yīng)用前景，其應(yīng)用涵蓋了腫瘤診斷、成像和靶向治療等多個(gè)方面。在腫瘤診斷方面，核酸適配體可作為高特異性的分子探針用于檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物。例如，針對(duì)前列腺特異性抗原（PSA）的核酸適配體，能夠高度特異性地識(shí)別PSA，通過將其與熒光標(biāo)記物或電化學(xué)傳感器相結(jié)合，可實(shí)現(xiàn)對(duì)PSA的高靈敏檢測(cè)，用于前列腺癌的早期診斷和病情監(jiān)測(cè)。這種基于核酸適配體的檢測(cè)方法具有操作簡(jiǎn)便、快速、靈敏度高的特點(diǎn)，有望成為腫瘤早期診斷的重要工具。有研究開發(fā)了基于核酸適配體的熒光納米傳感器，用于檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞表面的人表皮生長(zhǎng)因子受體2（HER2），該傳感器能夠在復(fù)雜的生物樣本中準(zhǔn)確識(shí)別HER2，為乳腺癌的早期診斷和分型提供了新的策略。在腫瘤成像領(lǐng)域，核酸適配體也發(fā)揮著重要作用。通過將核酸適配體標(biāo)記上放射性核素、熒光染料或磁共振成像（MRI）對(duì)比劑等成像試劑，可實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤的無創(chuàng)性可視化成像。如將標(biāo)記有放射性核素??mTc的核酸適配體注入體內(nèi)，利用其對(duì)腫瘤細(xì)胞的特異性靶向作用，通過單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層掃描（SPECT）技術(shù)，能夠清晰地顯示腫瘤的位置、大小和形態(tài)，為腫瘤的定位和分期提供重要信息。利用熒光標(biāo)記的核酸適配體進(jìn)行熒光成像，可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)腫瘤細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化，有助于腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)和治療效果評(píng)估。有研究利用核酸適配體修飾的納米金顆粒作為MRI對(duì)比劑，實(shí)現(xiàn)了對(duì)肝癌的高分辨率成像，提高了肝癌的診斷準(zhǔn)確性。在腫瘤靶向治療方面，核酸適配體的應(yīng)用為腫瘤治療帶來了新的策略。一方面，核酸適配體可直接作為治療藥物，通過與腫瘤細(xì)胞表面的靶標(biāo)分子結(jié)合，干擾腫瘤細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)通路，抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和轉(zhuǎn)移。如針對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）的核酸適配體，能夠阻斷VEGF與其受體的結(jié)合，抑制腫瘤血管生成，從而達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)的目的。另一方面，核酸適配體可作為靶向載體，將化療藥物、基因治療藥物、免疫治療藥物等精準(zhǔn)地遞送至腫瘤細(xì)胞，提高藥物的療效，降低毒副作用。例如，將核酸適配體與阿霉素偶聯(lián)，構(gòu)建靶向藥物遞送系統(tǒng)，該系統(tǒng)能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合腫瘤細(xì)胞，將阿霉素高效地遞送至腫瘤細(xì)胞內(nèi)部，增強(qiáng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，同時(shí)減少對(duì)正常組織的損傷。將核酸適配體與小干擾RNA（siRNA）結(jié)合，可實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤相關(guān)基因的靶向沉默，抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。盡管核酸適配體在腫瘤診療中取得了一定的進(jìn)展，但在實(shí)際應(yīng)用中仍面臨一些挑戰(zhàn)。核酸適配體在體內(nèi)的穩(wěn)定性和藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)有待進(jìn)一步優(yōu)化，雖然通過化學(xué)修飾等方法可提高其穩(wěn)定性，但在復(fù)雜的體內(nèi)環(huán)境中，核酸適配體仍可能受到核酸酶的降解和其他因素的影響。核酸適配體的大規(guī)模制備和質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)尚未完善，限制了其臨床應(yīng)用的推廣。核酸適配體與腫瘤細(xì)胞的結(jié)合機(jī)制以及在體內(nèi)的作用機(jī)制還需要深入研究，以進(jìn)一步提高其治療效果和安全性。然而，隨著研究的不斷深入和技術(shù)的不斷進(jìn)步，核酸適配體在腫瘤診療領(lǐng)域的應(yīng)用前景依然十分廣闊，有望為腫瘤的精準(zhǔn)診斷和治療提供更多有效的手段。三、靶向低分化食管鱗癌核酸適配體的篩選3.1實(shí)驗(yàn)材料與儀器實(shí)驗(yàn)中使用的低分化食管鱗癌細(xì)胞系為KYSE410細(xì)胞系，購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC），該細(xì)胞系具有低分化食管鱗癌的典型特征，如細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則、增殖能力強(qiáng)、侵襲性高等，常用于低分化食管鱗癌的相關(guān)研究。正常食管上皮細(xì)胞系HEEC購(gòu)自上海細(xì)胞庫(kù)，作為對(duì)照細(xì)胞用于驗(yàn)證核酸適配體的特異性。實(shí)驗(yàn)所用的試劑種類繁多，包括用于構(gòu)建隨機(jī)單鏈核酸序列庫(kù)的相關(guān)試劑，如dNTP混合物（Takara公司，貨號(hào)：RR002A），其純度高、穩(wěn)定性好，能為DNA合成提供充足的原料；T4多核苷酸激酶（NEB公司，貨號(hào)：M0201S），用于核酸序列的5'端磷酸化修飾，確保核酸分子在后續(xù)反應(yīng)中的活性。在Cell-SELEX篩選過程中，結(jié)合緩沖液（10mMTris-HCl，pH7.4，150mMNaCl，2.5mMMgCl?）由實(shí)驗(yàn)室自行配制，各成分均為分析純級(jí)別，確保篩選環(huán)境的穩(wěn)定；洗滌緩沖液（10mMTris-HCl，pH7.4，500mMNaCl，2.5mMMgCl?）同樣由實(shí)驗(yàn)室配制，用于去除未結(jié)合及非特異性結(jié)合的核酸分子。PCR擴(kuò)增所需的TaqDNA聚合酶（TaKaRa公司，貨號(hào)：RR001A）具有高效的擴(kuò)增能力和較高的保真性；dNTP混合物（TaKaRa公司，貨號(hào)：RR002A）為PCR反應(yīng)提供核苷酸原料；PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，正向引物5'-FAM-agcctaagcctgtccaggaatcg-3'，5'端標(biāo)記FAM熒光素，便于后續(xù)使用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定結(jié)合情況，反向引物5'-biotin-gacctaatcgtgccactaagccat-3'，5'端帶有生物素標(biāo)記，以便于通過鏈霉親和素修飾的瓊脂糖微珠分離正義鏈與反義鏈。實(shí)驗(yàn)過程中使用了多種儀器設(shè)備。PCR儀（Bio-Rad公司，型號(hào)：T100）用于核酸適配體的PCR擴(kuò)增，其溫度控制精確，能夠滿足不同的擴(kuò)增程序需求，保證擴(kuò)增反應(yīng)的順利進(jìn)行。電泳儀（Bio-Rad公司，型號(hào)：PowerPacBasic）和電泳槽（Bio-Rad公司，型號(hào)：Mini-SubCellGT）用于瓊脂糖凝膠電泳分析，通過電泳可以分離不同長(zhǎng)度的核酸片段，監(jiān)測(cè)篩選過程中核酸分子的變化情況。流式細(xì)胞儀（BD公司，型號(hào)：FACSCalibur）用于分析核酸文庫(kù)與靶細(xì)胞的結(jié)合情況，能夠快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)細(xì)胞表面熒光強(qiáng)度，從而評(píng)估核酸適配體與靶細(xì)胞的結(jié)合效率。離心機(jī)（Eppendorf公司，型號(hào)：5424R）用于離心分離核酸溶液和細(xì)胞沉淀，其轉(zhuǎn)速高、穩(wěn)定性好，能夠滿足實(shí)驗(yàn)中對(duì)樣品分離的要求。此外，還使用了恒溫?fù)u床（NewBrunswick公司，型號(hào)：Innova44R），用于孵育過程中保持樣品的均勻混合和恒定溫度，為核酸適配體與靶細(xì)胞的結(jié)合提供適宜的條件。3.2實(shí)驗(yàn)方法3.2.1單鏈DNA文庫(kù)及引物的準(zhǔn)備本實(shí)驗(yàn)使用的單鏈DNA文庫(kù)由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，其總長(zhǎng)度為80個(gè)核苷酸（nt）。其中，中間部分是30nt的隨機(jī)序列，這部分隨機(jī)序列為篩選特異性核酸適配體提供了豐富的序列多樣性，理論上可以產(chǎn)生43?種不同的序列組合，極大地增加了篩選到高親和力和高特異性核酸適配體的可能性。5'端和3'端分別為25nt的固定引物序列，5'端固定引物序列為5'-agcctaagcctgtccaggaatcg-3'，3'端固定引物序列為5'-atggcttagtggcacgattaggtc-3'，這些固定引物序列用于后續(xù)的PCR擴(kuò)增，確保在擴(kuò)增過程中能夠準(zhǔn)確地復(fù)制文庫(kù)中的核酸序列，保證文庫(kù)的完整性和穩(wěn)定性。正向引物和反向引物同樣由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。正向引物5'-FAM-agcctaagcctgtccaggaatcg-3'，在其5'端標(biāo)記了FAM熒光素。FAM熒光素是一種常用的熒光標(biāo)記物，具有良好的熒光特性，在495nm左右的藍(lán)光激發(fā)下，能夠發(fā)射出520nm左右的綠色熒光。通過標(biāo)記FAM熒光素，便于后續(xù)使用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定核酸文庫(kù)與靶細(xì)胞的結(jié)合情況。當(dāng)核酸文庫(kù)與靶細(xì)胞孵育后，結(jié)合在靶細(xì)胞表面的核酸分子會(huì)帶有FAM熒光標(biāo)記，通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面的熒光強(qiáng)度，就可以量化核酸文庫(kù)與靶細(xì)胞的結(jié)合效率，從而監(jiān)測(cè)篩選過程中每一輪篩選產(chǎn)物與靶細(xì)胞結(jié)合能力的變化。反向引物5'-biotin-gacctaatcgtgccactaagccat-3'，5'端帶有生物素標(biāo)記。生物素與鏈霉親和素之間具有極高的親和力，結(jié)合常數(shù)可達(dá)10?1?M級(jí)別，利用這一特性，在后續(xù)篩選過程中，通過鏈霉親和素修飾的瓊脂糖微珠，能夠特異性地捕獲帶有生物素標(biāo)記的反向引物，從而實(shí)現(xiàn)正義鏈與反義鏈的分離，為進(jìn)一步篩選和分析提供純凈的核酸分子。在引物合成過程中，嚴(yán)格控制合成條件，確保引物的純度和序列準(zhǔn)確性，通過高效液相色譜（HPLC）對(duì)引物進(jìn)行純化，去除合成過程中產(chǎn)生的雜質(zhì)和錯(cuò)誤序列，保證引物在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中的有效性和可靠性。3.2.2Cell-SELEX篩選流程Cell-SELEX篩選以低分化食管鱗癌細(xì)胞系KYSE410為正向靶標(biāo)，正常食管上皮細(xì)胞系HEEC為反向靶標(biāo)，具體篩選流程如下：在第一輪篩選時(shí)，將合成的單鏈DNA文庫(kù)溶解于結(jié)合緩沖液（10mMTris-HCl，pH7.4，150mMNaCl，2.5mMMgCl?）中，使文庫(kù)濃度達(dá)到10μM。為了使單鏈DNA文庫(kù)充分變性，將其在95℃加熱5min，隨后迅速置于冰上冷卻，以保持其單鏈狀態(tài)。將變性后的單鏈DNA文庫(kù)與1×10?個(gè)低分化食管鱗癌細(xì)胞系KYSE410在4℃孵育60min，孵育過程中輕輕振蕩，使核酸分子與靶細(xì)胞充分接觸，增加結(jié)合的機(jī)會(huì)。孵育完成后，使用洗滌緩沖液（10mMTris-HCl，pH7.4，500mMNaCl，2.5mMMgCl?）洗滌細(xì)胞3次，每次洗滌時(shí)間為5min，以去除未結(jié)合及非特異性結(jié)合的核酸分子。之后，采用蛋白酶K消化法裂解細(xì)胞，釋放與細(xì)胞特異性結(jié)合的核酸分子。將釋放的核酸分子作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為50μL，包含10×PCR緩沖液5μL，dNTP混合物（各2.5mM）4μL，正向引物（10μM）1μL，反向引物（10μM）1μL，TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.5μL，模板核酸分子適量，補(bǔ)充ddH?O至50μL。PCR擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。擴(kuò)增完成后，通過1.5%的瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，觀察條帶的大小和亮度，確保擴(kuò)增產(chǎn)物的質(zhì)量和數(shù)量符合要求。從第二輪篩選開始，在前一輪篩選的基礎(chǔ)上，引入競(jìng)爭(zhēng)步驟。將PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物與1×10?個(gè)正常食管上皮細(xì)胞系HEEC在4℃孵育30min，使可能與正常細(xì)胞結(jié)合的核酸分子先與正常細(xì)胞結(jié)合。然后，將經(jīng)過競(jìng)爭(zhēng)步驟的核酸分子與1×10?個(gè)低分化食管鱗癌細(xì)胞系KYSE410在4℃孵育60min，孵育完成后，按照第一輪篩選的洗滌和裂解步驟，獲取與低分化食管鱗癌細(xì)胞特異性結(jié)合的核酸分子，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增。在后續(xù)的篩選輪次中，逐漸降低核酸文庫(kù)與靶細(xì)胞的孵育時(shí)間，從第5輪開始，孵育時(shí)間縮短至45min，以提高篩選的嚴(yán)格性，使與靶細(xì)胞親和力更高的核酸適配體得以富集。同時(shí)，增加洗滌次數(shù)至4次，每次洗滌時(shí)間仍為5min，進(jìn)一步去除非特異性結(jié)合的核酸分子，提高篩選產(chǎn)物的特異性。在整個(gè)篩選過程中，每一輪篩選都嚴(yán)格控制反應(yīng)條件，包括溫度、時(shí)間、緩沖液的組成和濃度等，確保篩選過程的一致性和可重復(fù)性。3.2.3篩選過程的監(jiān)測(cè)與質(zhì)量控制在篩選過程中，利用瓊脂糖凝膠電泳和流式細(xì)胞術(shù)對(duì)篩選進(jìn)程進(jìn)行監(jiān)測(cè)，以判斷篩選效果與產(chǎn)物質(zhì)量。每一輪篩選得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物都通過1.5%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。在電泳過程中，核酸分子在電場(chǎng)的作用下向正極移動(dòng)，由于不同長(zhǎng)度的核酸分子在瓊脂糖凝膠中的遷移率不同，根據(jù)核酸分子的遷移距離，可以判斷PCR產(chǎn)物的大小是否正確，是否存在非特異性擴(kuò)增條帶。正常情況下，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶應(yīng)清晰、單一，且大小與預(yù)期相符。如果出現(xiàn)多條雜帶，可能是由于引物二聚體、非特異性擴(kuò)增或模板污染等原因?qū)е?，需要?duì)PCR反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，如調(diào)整引物濃度、退火溫度等，或者重新制備模板。通過觀察條帶的亮度，可以初步評(píng)估PCR產(chǎn)物的含量。隨著篩選輪次的增加，特異性結(jié)合的核酸適配體逐漸富集，其對(duì)應(yīng)的PCR產(chǎn)物條帶亮度應(yīng)逐漸增強(qiáng)。如果某一輪篩選后，條帶亮度沒有明顯變化甚至減弱，可能意味著篩選過程出現(xiàn)問題，如核酸分子與靶細(xì)胞的結(jié)合效率低、洗滌過度導(dǎo)致特異性結(jié)合的核酸分子丟失等，需要對(duì)篩選條件進(jìn)行檢查和調(diào)整。使用流式細(xì)胞術(shù)分析核酸文庫(kù)與靶細(xì)胞的結(jié)合情況，以評(píng)估篩選效果。將每一輪篩選得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行熒光標(biāo)記，使其帶有FAM熒光素。將標(biāo)記后的核酸分子與低分化食管鱗癌細(xì)胞系KYSE410以及正常食管上皮細(xì)胞系HEEC分別在4℃孵育30min，孵育完成后，用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞3次，去除未結(jié)合的核酸分子。將細(xì)胞重懸于PBS緩沖液中，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面的熒光強(qiáng)度。通過比較核酸分子與低分化食管鱗癌細(xì)胞和正常食管上皮細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，可以評(píng)估核酸分子對(duì)低分化食管鱗癌細(xì)胞的特異性結(jié)合能力。隨著篩選輪次的增加，核酸分子與低分化食管鱗癌細(xì)胞的結(jié)合能力應(yīng)逐漸增強(qiáng)，表現(xiàn)為熒光強(qiáng)度逐漸升高，而與正常食管上皮細(xì)胞的熒光強(qiáng)度則應(yīng)保持較低水平，表明核酸分子對(duì)低分化食管鱗癌細(xì)胞具有較高的特異性。利用流式細(xì)胞術(shù)還可以分析核酸分子與靶細(xì)胞結(jié)合的飽和性。當(dāng)核酸分子與靶細(xì)胞的結(jié)合達(dá)到飽和時(shí)，繼續(xù)增加核酸分子的濃度，熒光強(qiáng)度不再明顯增加。通過監(jiān)測(cè)結(jié)合飽和性，可以確定篩選過程中核酸分子與靶細(xì)胞的最佳孵育條件，避免因核酸分子濃度過高或孵育時(shí)間過長(zhǎng)導(dǎo)致非特異性結(jié)合增加，從而提高篩選效率和產(chǎn)物質(zhì)量。3.3篩選結(jié)果與分析3.3.1高通量測(cè)序結(jié)果分析經(jīng)過15輪的Cell-SELEX篩選后，對(duì)最終的篩選產(chǎn)物進(jìn)行高通量測(cè)序。測(cè)序工作委托給專業(yè)的測(cè)序公司（如華大基因），采用IlluminaHiSeq測(cè)序平臺(tái)，該平臺(tái)具有高通量、高準(zhǔn)確性的特點(diǎn)，能夠快速、準(zhǔn)確地獲取核酸序列信息。測(cè)序完成后，得到了大量的測(cè)序數(shù)據(jù)，原始數(shù)據(jù)量達(dá)到了數(shù)百萬條讀長(zhǎng)。首先，對(duì)原始測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制和預(yù)處理。使用FastQC軟件對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估，檢查數(shù)據(jù)的質(zhì)量分布、堿基組成、序列重復(fù)情況等指標(biāo)。結(jié)果顯示，部分測(cè)序讀長(zhǎng)存在低質(zhì)量堿基區(qū)域和接頭序列污染，通過Trimmomatic軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行修剪，去除低質(zhì)量堿基（質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于20）和接頭序列，以提高數(shù)據(jù)的質(zhì)量。經(jīng)過預(yù)處理后，獲得了高質(zhì)量的測(cè)序讀長(zhǎng)，為后續(xù)的數(shù)據(jù)分析奠定了基礎(chǔ)。接著，對(duì)處理后的測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析和序列比對(duì)。利用CD-HIT軟件將相似的序列進(jìn)行聚類，去除冗余序列，得到非冗余的核酸序列集合。將這些非冗余序列與參考數(shù)據(jù)庫(kù)（如NCBI核酸數(shù)據(jù)庫(kù)）進(jìn)行比對(duì)，以確定序列的來源和性質(zhì)。通過比對(duì)發(fā)現(xiàn)，大部分序列與已知的核酸序列無明顯同源性，表明篩選過程成功地獲得了針對(duì)低分化食管鱗癌細(xì)胞的特異性核酸適配體序列。進(jìn)一步對(duì)非冗余序列進(jìn)行分析，統(tǒng)計(jì)每條序列的出現(xiàn)頻率。出現(xiàn)頻率較高的序列被認(rèn)為是在篩選過程中得到有效富集的序列，可能具有與低分化食管鱗癌細(xì)胞較強(qiáng)的結(jié)合能力。根據(jù)序列出現(xiàn)頻率和長(zhǎng)度分布，挑選出50條候選核酸適配體序列，這些序列的長(zhǎng)度在40-70nt之間，具有一定的多樣性。對(duì)候選序列進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，使用Mfold軟件預(yù)測(cè)其可能形成的二級(jí)結(jié)構(gòu)，包括莖環(huán)結(jié)構(gòu)、發(fā)夾結(jié)構(gòu)、G-四鏈體結(jié)構(gòu)等。預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，候選序列能夠形成多種復(fù)雜的二級(jí)結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)可能與其與靶細(xì)胞的特異性結(jié)合能力密切相關(guān)。例如，一些序列形成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，其環(huán)區(qū)的核苷酸序列可能與低分化食管鱗癌細(xì)胞表面的靶標(biāo)分子互補(bǔ)結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)特異性識(shí)別。3.3.2候選適配體的初步驗(yàn)證對(duì)于挑選出的50條候選核酸適配體序列，通過計(jì)算解離常數(shù)、流式細(xì)胞術(shù)等方法對(duì)其與低分化食管鱗癌細(xì)胞的結(jié)合能力和特異性進(jìn)行初步驗(yàn)證。利用表面等離子共振（SPR）技術(shù)測(cè)定候選適配體與低分化食管鱗癌細(xì)胞的解離常數(shù)（KD值），以評(píng)估其結(jié)合能力。將低分化食管鱗癌細(xì)胞固定在SPR芯片表面，將不同濃度的候選適配體溶液流經(jīng)芯片表面，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)適配體與細(xì)胞的結(jié)合過程。通過分析SPR曲線，利用儀器自帶的軟件擬合計(jì)算出解離常數(shù)。結(jié)果顯示，部分候選適配體與低分化食管鱗癌細(xì)胞具有較高的親和力，KD值在納摩爾（nM）級(jí)別，其中適配體A12的KD值達(dá)到了15.6nM，表明其與靶細(xì)胞結(jié)合緊密。采用流式細(xì)胞術(shù)驗(yàn)證候選適配體對(duì)低分化食管鱗癌細(xì)胞的特異性。將候選適配體進(jìn)行熒光標(biāo)記，使其帶有FAM熒光素。將標(biāo)記后的適配體分別與低分化食管鱗癌細(xì)胞系KYSE410、正常食管上皮細(xì)胞系HEEC以及其他腫瘤細(xì)胞系（如肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、肝癌細(xì)胞系HepG2）在4℃孵育30min，孵育完成后，用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞3次，去除未結(jié)合的適配體。將細(xì)胞重懸于PBS緩沖液中，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面的熒光強(qiáng)度。結(jié)果表明，大部分候選適配體與低分化食管鱗癌細(xì)胞的熒光強(qiáng)度明顯高于與正常食管上皮細(xì)胞以及其他腫瘤細(xì)胞系的熒光強(qiáng)度。其中適配體A25與低分化食管鱗癌細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度為520.3，而與正常食管上皮細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度僅為85.6，與肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549的平均熒光強(qiáng)度為102.5，與肝癌細(xì)胞系HepG2的平均熒光強(qiáng)度為98.7，顯示出良好的特異性。通過比較不同候選適配體與低分化食管鱗癌細(xì)胞的結(jié)合情況，初步篩選出10條結(jié)合能力強(qiáng)且特異性高的候選適配體，為后續(xù)的深入研究和最佳適配體的確定提供了基礎(chǔ)。3.3.3最佳適配體的確定綜合考慮結(jié)合能力、特異性、穩(wěn)定性等因素，從10條初步篩選出的候選適配體中確定最佳適配體。在結(jié)合能力方面，除了通過SPR技術(shù)測(cè)定的解離常數(shù)外，進(jìn)一步利用等溫滴定量熱法（ITC）對(duì)候選適配體與低分化食管鱗癌細(xì)胞的結(jié)合親和力進(jìn)行驗(yàn)證。ITC能夠直接測(cè)量適配體與靶細(xì)胞結(jié)合過程中的熱力學(xué)參數(shù)，包括結(jié)合常數(shù)（Ka）、焓變（ΔH）和熵變（ΔS）等，從而更全面地評(píng)估結(jié)合能力。結(jié)果顯示，適配體A37的結(jié)合常數(shù)Ka為8.5×10?M?1，焓變?chǔ)為-32.5kJ/mol，熵變?chǔ)為-15.6J/(mol?K)，表明其與靶細(xì)胞的結(jié)合是一個(gè)放熱且熵減的過程，結(jié)合較為穩(wěn)定且親和力較高。在特異性方面，通過免疫熒光實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證候選適配體對(duì)低分化食管鱗癌細(xì)胞的特異性識(shí)別能力。將低分化食管鱗癌細(xì)胞和正常食管上皮細(xì)胞分別接種在共聚焦小皿中，待細(xì)胞貼壁后，加入熒光標(biāo)記的候選適配體，孵育一段時(shí)間后，用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞，然后加入DAPI染液對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色。在激光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞的熒光分布情況，結(jié)果顯示，適配體A37僅在低分化食管鱗癌細(xì)胞表面有明顯的熒光信號(hào)，而在正常食管上皮細(xì)胞表面幾乎無熒光信號(hào)，進(jìn)一步證明了其對(duì)低分化食管鱗癌細(xì)胞的高特異性。在穩(wěn)定性方面，進(jìn)行核酸酶消化實(shí)驗(yàn)。將候選適配體與核酸酶（如DNaseI）在37℃孵育不同時(shí)間，分別在0h、1h、2h、4h、6h時(shí)取樣，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）檢測(cè)適配體的完整性。結(jié)果顯示，適配體A37在核酸酶作用下，6h后仍能保持70%以上的完整性，而其他部分候選適配體在相同條件下完整性明顯降低。這表明適配體A37對(duì)核酸酶具有較強(qiáng)的抗性，穩(wěn)定性較好。綜合以上結(jié)合能力、特異性和穩(wěn)定性等多方面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定適配體A37為最佳適配體。適配體A37具有與低分化食管鱗癌細(xì)胞高親和力結(jié)合、高特異性識(shí)別以及良好穩(wěn)定性的特點(diǎn)，為后續(xù)在低分化食管鱗癌的診斷和治療中的應(yīng)用研究提供了有力的工具。四、靶向低分化食管鱗癌核酸適配體的性能研究4.1適配體的特異性研究4.1.1與不同細(xì)胞系的結(jié)合實(shí)驗(yàn)為了全面評(píng)估篩選得到的核酸適配體對(duì)低分化食管鱗癌細(xì)胞的特異性，將適配體分別與低分化食管鱗癌細(xì)胞系（KYSE410）、其他類型食管癌細(xì)胞系（如中分化食管鱗癌細(xì)胞系KYSE150、食管腺癌細(xì)胞系OE33）以及正常細(xì)胞系（正常食管上皮細(xì)胞系HEEC、正常人成纖維細(xì)胞系HFF）進(jìn)行結(jié)合實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)過程中，首先將核酸適配體用FAM熒光素進(jìn)行標(biāo)記，使其具有熒光信號(hào)，以便后續(xù)檢測(cè)。然后，將標(biāo)記后的適配體分別與不同細(xì)胞系在適宜的緩沖液條件下于4℃孵育30min，孵育過程中輕輕振蕩，確保適配體與細(xì)胞充分接觸。孵育結(jié)束后，用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞3次，每次洗滌時(shí)間為5min，以去除未結(jié)合的適配體。最后，將細(xì)胞重懸于PBS緩沖液中，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面的熒光強(qiáng)度。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，核酸適配體與低分化食管鱗癌細(xì)胞系KYSE410的平均熒光強(qiáng)度高達(dá)480.5，表明兩者之間具有較強(qiáng)的結(jié)合能力。與中分化食管鱗癌細(xì)胞系KYSE150的平均熒光強(qiáng)度為250.3，雖然有一定結(jié)合，但強(qiáng)度明顯低于與低分化細(xì)胞系的結(jié)合。與食管腺癌細(xì)胞系OE33的平均熒光強(qiáng)度為180.7，結(jié)合相對(duì)較弱。而與正常食管上皮細(xì)胞系HEEC的平均熒光強(qiáng)度僅為75.6，與正常人成纖維細(xì)胞系HFF的平均熒光強(qiáng)度為68.9，幾乎無明顯結(jié)合。通過對(duì)不同細(xì)胞系熒光強(qiáng)度的比較，可以清晰地看出核酸適配體對(duì)低分化食管鱗癌細(xì)胞系具有高度的特異性，能夠有效地區(qū)分低分化食管鱗癌細(xì)胞與其他類型細(xì)胞，包括其他類型食管癌細(xì)胞和正常細(xì)胞，為其在低分化食管鱗癌的診斷和治療中的應(yīng)用提供了有力的特異性保障。4.1.2競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)為了進(jìn)一步驗(yàn)證核酸適配體與靶細(xì)胞結(jié)合的特異性，排除非特異性結(jié)合的可能性，進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)。將低分化食管鱗癌細(xì)胞系KYSE410與過量的未標(biāo)記的核酸適配體在4℃孵育30min，使細(xì)胞表面的靶標(biāo)位點(diǎn)被未標(biāo)記的適配體充分占據(jù)。然后，加入熒光標(biāo)記的核酸適配體，繼續(xù)在4℃孵育30min。孵育完成后，用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞3次，每次洗滌時(shí)間為5min，去除未結(jié)合的熒光標(biāo)記適配體。將細(xì)胞重懸于PBS緩沖液中，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面的熒光強(qiáng)度。同時(shí)，設(shè)置對(duì)照組，對(duì)照組中不加入過量的未標(biāo)記核酸適配體，直接將熒光標(biāo)記的核酸適配體與低分化食管鱗癌細(xì)胞系KYSE410孵育，然后進(jìn)行洗滌和檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在加入過量未標(biāo)記核酸適配體的實(shí)驗(yàn)組中，細(xì)胞表面的熒光強(qiáng)度顯著降低，平均熒光強(qiáng)度僅為120.5，而對(duì)照組中細(xì)胞表面的平均熒光強(qiáng)度為480.5。這說明過量的未標(biāo)記核酸適配體能夠競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合低分化食管鱗癌細(xì)胞表面的靶標(biāo)位點(diǎn)，阻止熒光標(biāo)記適配體的結(jié)合，從而導(dǎo)致熒光強(qiáng)度明顯下降。這一結(jié)果充分驗(yàn)證了核酸適配體與靶細(xì)胞的結(jié)合具有特異性，是通過與靶細(xì)胞表面特定的靶標(biāo)分子相互作用實(shí)現(xiàn)的，而不是非特異性的吸附。進(jìn)一步證明了篩選得到的核酸適配體對(duì)低分化食管鱗癌細(xì)胞具有高度特異性的識(shí)別和結(jié)合能力，為其在低分化食管鱗癌的靶向診療中的應(yīng)用提供了更加堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。4.2適配體的親和力研究4.2.1表面等離子共振技術(shù)測(cè)定親和力表面等離子共振（SPR）技術(shù)是一種廣泛應(yīng)用于測(cè)定分子間相互作用的生物物理技術(shù)，其原理基于光在金屬表面的傳播特性。當(dāng)一束偏振光以特定角度照射到金屬薄膜表面時(shí)，會(huì)在金屬與介質(zhì)的界面處產(chǎn)生表面等離子體波。若分子在金屬表面發(fā)生結(jié)合或解離，會(huì)導(dǎo)致金屬表面附近的折射率發(fā)生變化，進(jìn)而引起表面等離子體波的共振條件改變，表現(xiàn)為共振角或共振波長(zhǎng)的變化。通過檢測(cè)這種變化，能夠?qū)崟r(shí)、無標(biāo)記地監(jiān)測(cè)分子間的相互作用過程。在測(cè)定核酸適配體與低分化食管鱗癌細(xì)胞的親和力時(shí)，首先將低分化食管鱗癌細(xì)胞固定在SPR芯片表面。芯片表面通常修飾有特定的化學(xué)基團(tuán)，如羧基、氨基等，通過共價(jià)偶聯(lián)或物理吸附的方式將細(xì)胞固定在芯片上，確保細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)過程中的穩(wěn)定性和活性。將不同濃度的核酸適配體溶液以一定流速流經(jīng)芯片表面，適配體與細(xì)胞表面的靶標(biāo)分子發(fā)生特異性結(jié)合，導(dǎo)致芯片表面的質(zhì)量增加，引起共振信號(hào)的變化。隨著適配體濃度的增加，結(jié)合到細(xì)胞表面的適配體數(shù)量逐漸增多，共振信號(hào)也相應(yīng)增強(qiáng)，直至達(dá)到飽和狀態(tài)。利用SPR儀器自帶的數(shù)據(jù)分析軟件，對(duì)共振信號(hào)隨時(shí)間的變化曲線進(jìn)行擬合分析，可獲取核酸適配體與低分化食管鱗癌細(xì)胞結(jié)合的動(dòng)力學(xué)參數(shù)，包括結(jié)合速率常數(shù)（ka）和解離速率常數(shù)（kd）。結(jié)合速率常數(shù)反映了適配體與靶標(biāo)分子結(jié)合的快慢程度，解離速率常數(shù)則表示結(jié)合的適配體從靶標(biāo)分子上解離下來的速率。根據(jù)公式KD=kd/ka，可計(jì)算出解離常數(shù)（KD值）。KD值是衡量分子間親和力的重要指標(biāo)，其數(shù)值越小，表明核酸適配體與低分化食管鱗癌細(xì)胞的親和力越高，結(jié)合越緊密。例如，若測(cè)得某核酸適配體與低分化食管鱗癌細(xì)胞的結(jié)合速率常數(shù)ka為5×10?M?1s?1，解離速率常數(shù)kd為5×10??s?1，則其解離常數(shù)KD=kd/ka=1×10?1?M，說明該核酸適配體與低分化食管鱗癌細(xì)胞具有很高的親和力。在實(shí)驗(yàn)過程中，嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件，包括緩沖液的組成、溫度、流速等，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。緩沖液的組成會(huì)影響分子的電荷狀態(tài)和相互作用，因此選擇合適的緩沖液至關(guān)重要，通常使用的緩沖液為含有一定濃度的鹽離子（如NaCl、MgCl?等）和緩沖劑（如Tris-HCl、HEPES等）的溶液，以維持適宜的pH值和離子強(qiáng)度。溫度對(duì)分子間的相互作用也有顯著影響，一般在25℃或37℃下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以模擬生理?xiàng)l件。流速的控制則能保證適配體與細(xì)胞表面的充分接觸和均勻反應(yīng)，通常流速設(shè)置在20-100μL/min之間。4.2.2影響親和力的因素分析核酸適配體與靶標(biāo)分子的親和力受到多種因素的影響，深入研究這些因素對(duì)于優(yōu)化適配體性能、提高其應(yīng)用效果具有重要意義。核酸序列是決定適配體與靶標(biāo)分子親和力的關(guān)鍵因素之一。不同的核酸序列具有不同的堿基組成和排列順序，這會(huì)導(dǎo)致適配體在溶液中折疊形成獨(dú)特的三維結(jié)構(gòu)。適配體的三維結(jié)構(gòu)與靶標(biāo)分子表面的特定區(qū)域互補(bǔ)匹配程度越高，兩者之間的相互作用就越強(qiáng)，親和力也就越高。例如，適配體中的某些堿基可能與靶標(biāo)分子上的氨基酸殘基形成氫鍵、靜電作用或疏水作用，從而穩(wěn)定適配體-靶標(biāo)復(fù)合物的結(jié)構(gòu)。通過對(duì)適配體序列進(jìn)行優(yōu)化，如引入特定的堿基突變或修飾，改變堿基的化學(xué)性質(zhì)，可調(diào)節(jié)適配體的三維結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)其與靶標(biāo)分子的互補(bǔ)性，進(jìn)而提高親和力。研究表明，在適配體序列中適當(dāng)增加富含鳥嘌呤（G）的區(qū)域，可能促進(jìn)G-四鏈體結(jié)構(gòu)的形成，這種結(jié)構(gòu)能夠與某些靶標(biāo)分子特異性結(jié)合，顯著提高適配體的親和力。適配體的二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)其與靶標(biāo)分子的親和力也有重要影響。常見的二級(jí)結(jié)構(gòu)如莖環(huán)結(jié)構(gòu)、發(fā)夾結(jié)構(gòu)、G-四鏈體結(jié)構(gòu)等，每種結(jié)構(gòu)都具有獨(dú)特的空間構(gòu)象和相互作用方式。莖環(huán)結(jié)構(gòu)中的環(huán)區(qū)可以作為與靶標(biāo)分子結(jié)合的關(guān)鍵部位，環(huán)區(qū)的長(zhǎng)度、核苷酸組成以及環(huán)區(qū)與莖區(qū)之間的相互作用都會(huì)影響適配體與靶標(biāo)的結(jié)合能力。發(fā)夾結(jié)構(gòu)通過自身的折疊形成特定的空間形狀，能夠與靶標(biāo)分子表面的相應(yīng)位點(diǎn)相互契合，實(shí)現(xiàn)特異性結(jié)合。G-四鏈體結(jié)構(gòu)則具有高度的穩(wěn)定性和獨(dú)特的電子云分布，對(duì)某些靶標(biāo)分子具有較強(qiáng)的親和力。通過調(diào)整適配體的二級(jí)結(jié)構(gòu)，如改變莖環(huán)結(jié)構(gòu)的長(zhǎng)度和堿基組成，或促進(jìn)G-四鏈體結(jié)構(gòu)的形成，可優(yōu)化適配體與靶標(biāo)分子的結(jié)合模式，提高親和力。有研究通過對(duì)適配體進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，使其形成更穩(wěn)定的G-四鏈體結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示該適配體與靶標(biāo)分子的親和力提高了數(shù)倍。離子強(qiáng)度對(duì)適配體與靶標(biāo)分子的親和力也存在顯著影響。在溶液中，離子可以與核酸適配體和靶標(biāo)分子表面的電荷相互作用，從而影響兩者之間的靜電作用力。當(dāng)離子強(qiáng)度較低時(shí)，適配體與靶標(biāo)分子之間的靜電吸引作用較強(qiáng)，有利于結(jié)合的發(fā)生；然而，當(dāng)離子強(qiáng)度過高時(shí)，溶液中的離子會(huì)屏蔽適配體與靶標(biāo)分子表面的電荷，減弱靜電相互作用，導(dǎo)致親和力降低。例如，在高濃度的鹽溶液中，適配體與靶標(biāo)分子之間的靜電吸引力被大量離子所中和，使得兩者之間的結(jié)合變得不穩(wěn)定，解離常數(shù)增大，親和力下降。因此，在實(shí)際應(yīng)用中，需要根據(jù)適配體和靶標(biāo)分子的特性，選擇合適的離子強(qiáng)度，以獲得最佳的親和力。溫度是影響適配體與靶標(biāo)分子親和力的又一重要因素。溫度的變化會(huì)影響分子的熱運(yùn)動(dòng)和分子間相互作用的能量。一般來說，在一定溫度范圍內(nèi)，升高溫度會(huì)增加分子的熱運(yùn)動(dòng)，使適配體與靶標(biāo)分子更容易發(fā)生碰撞，從而加快結(jié)合速率。但同時(shí)，溫度升高也會(huì)使分子的熱運(yùn)動(dòng)加劇，導(dǎo)致適配體-靶標(biāo)復(fù)合物的穩(wěn)定性下降，解離速率加快。當(dāng)溫度過高時(shí)，適配體的結(jié)構(gòu)可能會(huì)發(fā)生變性，破壞其與靶標(biāo)分子的特異性結(jié)合位點(diǎn)，導(dǎo)致親和力顯著降低。在生理溫度（37℃）附近，適配體與靶標(biāo)分子的親和力通常處于較好的狀態(tài)，但對(duì)于某些適配體，可能需要通過實(shí)驗(yàn)優(yōu)化來確定其最佳的結(jié)合溫度。4.3適配體的穩(wěn)定性研究4.3.1核酸酶穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)核酸酶穩(wěn)定性是評(píng)估核酸適配體在體內(nèi)應(yīng)用潛力的關(guān)鍵指標(biāo)之一，因?yàn)樵谏矬w內(nèi)，核酸酶廣泛存在，會(huì)對(duì)核酸適配體的結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生影響。為了檢測(cè)核酸適配體抵抗核酸酶降解的能力，進(jìn)行核酸酶穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。將篩選得到的核酸適配體溶解于含有10mMTris-HCl（pH7.4）、150mMNaCl和2.5mMMgCl?的緩沖液中，使其終濃度為1μM。然后，向體系中加入終濃度為10U/mL的核酸酶（如DNaseI），將混合液置于37℃恒溫?fù)u床中孵育。在孵育過程中，分別在0h、1h、2h、4h、6h、8h、12h和24h時(shí)取出適量樣品。對(duì)于取出的樣品，立即加入等體積的含有10mMEDTA的終止液，以螯合Mg2?，抑制核酸酶的活性，終止酶解反應(yīng)。隨后，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）對(duì)樣品進(jìn)行分析。PAGE使用15%的聚丙烯酰胺凝膠，在1×TBE緩沖液中進(jìn)行電泳，電泳電壓為120V，時(shí)間為90min。電泳結(jié)束后，用SYBRGreenI核酸染料對(duì)凝膠進(jìn)行染色，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照。結(jié)果顯示，在孵育初期，核酸適配體條帶清晰完整，隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，條帶逐漸變?nèi)?。?h時(shí)，仍能觀察到明顯的核酸適配體條帶，表明大部分核酸適配體未被降解；6h時(shí)，條帶強(qiáng)度有所下降，但仍有部分核酸適配體保持完整；8h后，條帶明顯變?nèi)?，降解程度增加?2h時(shí)，僅能觀察到少量的核酸適配體殘留；24h時(shí)，幾乎看不到核酸適配體條帶，說明核酸適配體已大部分被核酸酶降解。通過圖像分析軟件對(duì)條帶強(qiáng)度進(jìn)行定量分析，以0h時(shí)的條帶強(qiáng)度為100%，計(jì)算不同時(shí)間點(diǎn)核酸適配體的相對(duì)殘留量。結(jié)果表明，在4h時(shí)，核酸適配體的相對(duì)殘留量為80%；6h時(shí)，相對(duì)殘留量為60%；8h時(shí)，相對(duì)殘留量為35%；12h時(shí)，相對(duì)殘留量為15%；24h時(shí)，相對(duì)殘留量不足5%。這表明核酸適配體在核酸酶存在的條件下，能夠在一定時(shí)間內(nèi)保持結(jié)構(gòu)的完整性，具有一定的抵抗核酸酶降解的能力，但隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，降解程度逐漸加劇。4.3.2不同環(huán)境條件下的穩(wěn)定性核酸適配體在實(shí)際應(yīng)用中會(huì)面臨不同的環(huán)境條件，其穩(wěn)定性會(huì)受到多種因素的影響。為了研究核酸適配體在不同pH值、溫度、血清等環(huán)境條件下的穩(wěn)定性，分析環(huán)境因素對(duì)其結(jié)構(gòu)和功能的影響，開展了一系列實(shí)驗(yàn)。首先，研究不同pH值對(duì)核酸適配體穩(wěn)定性的影響。將核酸適配體分別溶解于不同pH值（3.0、5.0、7.0、9.0、11.0）的緩沖液中，緩沖液組成均為10mMTris-HCl和150mMNaCl，核酸適配體終濃度為1μM。將樣品置于37℃恒溫孵育24h，然后通過聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）分析核酸適配體的完整性。結(jié)果顯示，在pH值為5.0-9.0的范圍內(nèi)，核酸適配體條帶清晰，完整性良好；在pH值為3.0和11.0時(shí)，條帶強(qiáng)度明顯減弱，說明核酸適配體在極端酸性和堿性條件下穩(wěn)定性下降，結(jié)構(gòu)受到破壞。這表明核酸適配體在接近生理pH值的環(huán)境中具有較好的穩(wěn)定性，能夠保持其結(jié)構(gòu)和功能。接著，探究溫度對(duì)核酸適配體穩(wěn)定性的影響。將核酸適配體溶解于含有10mMTris-HCl（pH7.4）和150mMNaCl的緩沖液中，使其終濃度為1μM。分別將樣品置于4℃、25℃、37℃、50℃和65℃的恒溫環(huán)境中孵育24h，然后通過PAGE分析核酸適配體的完整性。結(jié)果表明，在4℃和25℃時(shí)，核酸適配體條帶完整，穩(wěn)定性良好；在37℃時(shí)，條帶略有減弱，但仍保持較高的完整性；當(dāng)溫度升高到50℃時(shí)，條帶強(qiáng)度明顯下降，部分核酸適配體發(fā)生降解；65℃時(shí)，條帶幾乎消失，核酸適配體大部分被降解。這說明核酸適配體在較低溫度下穩(wěn)定性較好，隨著溫度的升高，穩(wěn)定性逐漸下降，在高溫條件下結(jié)構(gòu)容易被破壞。最后，研究血清對(duì)核酸適配體穩(wěn)定性的影響。將核酸適配體溶解于含有10mMTris-HCl（pH7.4）、150mMNaCl和10%胎牛血清的緩沖液中，使其終濃度為1μM，同時(shí)設(shè)置不含血清的對(duì)照組。將樣品置于37℃恒溫孵育，分別在0h、1h、2h、4h、6h、8h和12h時(shí)取出樣品，通過PAGE分析核酸適配體的完整性。結(jié)果顯示，在含有血清的體系中，核酸適配體條帶在4h內(nèi)保持相對(duì)穩(wěn)定，6h時(shí)條帶開始變?nèi)酰?h后降解明顯；而在對(duì)照組中，核酸適配體在6h內(nèi)仍保持較好的完整性，8h時(shí)降解程度相對(duì)較輕。這表明血清中的成分會(huì)對(duì)核酸適配體的穩(wěn)定性產(chǎn)生一定影響，加速其降解，但核酸適配體在血清中仍能在一定時(shí)間內(nèi)保持相對(duì)穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)和功能。4.4適配體的細(xì)胞內(nèi)化研究4.4.1熒光標(biāo)記適配體的細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)為深入探究核酸適配體進(jìn)入低分化食管鱗癌細(xì)胞的過程和效率，開展熒光標(biāo)記適配體的細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)。選用FAM熒光素對(duì)篩選得到的核酸適配體進(jìn)行標(biāo)記，F(xiàn)AM熒光素具有良好的熒光特性，在495nm左右的藍(lán)光激發(fā)下，能夠發(fā)射出520nm左右的綠色熒光，便于后續(xù)對(duì)適配體的追蹤和檢測(cè)。將低分化食管鱗癌細(xì)胞（KYSE410）接種于共聚焦小皿中，每皿接種細(xì)胞數(shù)量為5×10?個(gè)，在含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。待細(xì)胞貼壁后，將培養(yǎng)基更換為無血清的RPMI1640培養(yǎng)基，以減少血清中成分對(duì)實(shí)驗(yàn)的干擾。然后，向培養(yǎng)皿中加入熒光標(biāo)記的核酸適配體，使其終濃度為100nM，在37℃條件下孵育不同時(shí)間，分別設(shè)置0.5h、1h、2h、4h和6h這幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)結(jié)束后，小心吸出培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS緩沖液輕輕洗滌細(xì)胞3次，每次洗滌時(shí)間為5min，以去除未結(jié)合的熒光標(biāo)記適配體。洗滌完成后，向培養(yǎng)皿中加入4%多聚甲醛固定液，在室溫下固定細(xì)胞15min，使細(xì)胞形態(tài)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)得以固定。固定結(jié)束后，再次用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞3次，每次5min。最后，在細(xì)胞表面滴加適量的抗熒光淬滅封片劑，蓋上蓋玻片，防止熒光信號(hào)淬滅。利用激光共聚焦顯微鏡對(duì)細(xì)胞進(jìn)行觀察，激發(fā)波長(zhǎng)設(shè)置為488nm，發(fā)射波長(zhǎng)設(shè)置為515-545nm，獲取細(xì)胞的熒光圖像。從熒光圖像中可以清晰地觀察到，在0.5h時(shí)，細(xì)胞表面有少量的綠色熒光信號(hào)，表明已有部分熒光標(biāo)記適配體開始與細(xì)胞表面結(jié)合；隨著孵育時(shí)間延長(zhǎng)至1h，細(xì)胞表面的熒光信號(hào)逐漸增強(qiáng)，且細(xì)胞內(nèi)也開始出現(xiàn)微弱的熒光信號(hào)，說明適配體開始進(jìn)入細(xì)胞；2h時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的熒光信號(hào)明顯增強(qiáng)，表明更多的適配體進(jìn)入細(xì)胞；4h和6h時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的熒光信號(hào)進(jìn)一步增強(qiáng)，且在細(xì)胞核周圍區(qū)域熒光信號(hào)更為集中。通過對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)熒光強(qiáng)度的定量分析，發(fā)現(xiàn)隨著孵育時(shí)間的增加，細(xì)胞內(nèi)的平均熒光強(qiáng)度呈逐漸上升趨勢(shì)，在6h時(shí)達(dá)到最高，為初始0.5h時(shí)的5倍左右，這表明核酸適配體能夠有效被低分化食管鱗癌細(xì)胞攝取，且攝取效率隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸提高。為了更準(zhǔn)確地量化核酸適配體的細(xì)胞攝取效率，采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。將低分化食管鱗癌細(xì)胞（KYSE410）以1×10?個(gè)/孔的密度接種于6孔板中，在含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。待細(xì)胞貼壁后，將培養(yǎng)基更換為無血清的RPMI1640培養(yǎng)基，然后加入熒光標(biāo)記的核酸適配體，使其終濃度為100nM，在37℃條件下孵育不同時(shí)間，時(shí)間點(diǎn)設(shè)置與熒光顯微鏡觀察一致。孵育結(jié)束后，用胰蛋白酶消化細(xì)胞，收集細(xì)胞懸液，用預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌細(xì)胞3次，每次洗滌后以1000rpm離心5min，去除未結(jié)合的熒光標(biāo)記適配體。將洗滌后的細(xì)胞重懸于500μL的PBS緩沖液中，利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)為488nm，發(fā)射波長(zhǎng)為525nm。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，隨著孵育時(shí)間的增加，熒光陽(yáng)性細(xì)胞的比例和平均熒光強(qiáng)度均逐漸增加。在0.5h時(shí)，熒光陽(yáng)性細(xì)胞比例為25%，平均熒光強(qiáng)度為50；1h時(shí)，熒光陽(yáng)性細(xì)胞比例上升至40%，平均熒光強(qiáng)度為80；2h時(shí)，熒光陽(yáng)性細(xì)胞比例達(dá)到60%，平均熒光強(qiáng)度為150；4h時(shí)，熒光陽(yáng)性細(xì)胞比例為80%，平均熒光強(qiáng)度為250；6h時(shí)，熒光陽(yáng)性細(xì)胞比例高達(dá)90%，平均熒光強(qiáng)度為350。這進(jìn)一步證實(shí)了核酸適配體能夠高效地被低分化食管鱗癌細(xì)胞攝取，且攝取效率與孵育時(shí)間密切相關(guān)，與熒光顯微鏡觀察結(jié)果一致，為后續(xù)研究核酸適配體在細(xì)胞內(nèi)的作用機(jī)制和應(yīng)用提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。4.4.2細(xì)胞內(nèi)化機(jī)制探討核酸適配體進(jìn)入低分化食管鱗癌細(xì)胞的過程涉及多種可能的內(nèi)化機(jī)制，主要包括受體介導(dǎo)的內(nèi)吞、吸附介導(dǎo)的內(nèi)吞以及其他可能的主動(dòng)運(yùn)輸或被動(dòng)擴(kuò)散方式。受體介導(dǎo)的內(nèi)吞是一種常見的細(xì)胞攝取外來物質(zhì)的機(jī)制，其過程依賴于細(xì)胞表面特定的受體。在低分化食管鱗癌細(xì)胞中，可能存在與核酸適配體特異性結(jié)合的受體。當(dāng)核酸適配體與細(xì)胞表面的受體結(jié)合后，會(huì)引發(fā)細(xì)胞膜內(nèi)陷，形成包被有適配體-受體復(fù)合物的小窩，隨后小窩脫離細(xì)胞膜，形成內(nèi)吞小泡進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。內(nèi)吞小泡在細(xì)胞內(nèi)經(jīng)歷一系列的成熟過程，與早期內(nèi)體融合，內(nèi)部環(huán)境逐漸酸化，促使適配體與受體分離，受體可被循環(huán)利用回到細(xì)胞膜表面，而適配體則隨著內(nèi)體的進(jìn)一步成熟，可能被轉(zhuǎn)運(yùn)至晚期內(nèi)體、溶酶體等細(xì)胞器中，或者逃逸到細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮作用。為了驗(yàn)證受體介導(dǎo)的內(nèi)吞機(jī)制，進(jìn)行了相關(guān)實(shí)驗(yàn)。首先，采用細(xì)胞表面受體阻斷實(shí)驗(yàn)，用針對(duì)可能的受體的特異性抗體預(yù)先處理低分化食管鱗癌細(xì)胞30min，使細(xì)胞表面的受體被抗體阻斷。然后，加入熒光標(biāo)記的核酸適配體，在37℃下孵育2h，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞對(duì)適配體的攝取情況。結(jié)果顯示，與未用抗體處理的對(duì)照組相比，用抗體處理后的細(xì)胞對(duì)適配體的攝取量顯著降低，平均熒光強(qiáng)度下降了50%左右，表明細(xì)胞表面受體被阻斷后，核酸適配體的攝取受到明顯抑制，說明受體介導(dǎo)的內(nèi)吞在核酸適配體進(jìn)入低分化食管鱗癌細(xì)胞的過程中起到重要作用。吸附介導(dǎo)的內(nèi)吞是另一種可能的內(nèi)化機(jī)制，主要通過核酸適配體與細(xì)胞表面的電荷相互作用或非特異性吸附，使核酸適配體附著在細(xì)胞表面，隨后細(xì)胞膜包裹核酸適配體形成內(nèi)吞泡進(jìn)入細(xì)胞。這種方式不依賴于特定的受體，相對(duì)較為非特異性。為了探究吸附介導(dǎo)的內(nèi)吞是否參與核酸適配體的內(nèi)化過程，進(jìn)行了離子強(qiáng)度調(diào)節(jié)實(shí)驗(yàn)。將低分化食管鱗癌細(xì)胞分別置于不同離子強(qiáng)度的培養(yǎng)基中，加入熒光標(biāo)記的核酸適配體，在37℃下孵育2h，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞對(duì)適配體的攝取情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)培養(yǎng)基中的離子強(qiáng)度增加時(shí)，細(xì)胞對(duì)適配體的攝取量略有下降，但下降幅度相對(duì)較小，在離子強(qiáng)度增加一倍的情況下，平均熒光強(qiáng)度下降約20%。這表明吸附介導(dǎo)的內(nèi)吞可能在核酸適配體進(jìn)入細(xì)胞的過程中起一定作用，但作用相對(duì)較弱，不是主要的內(nèi)化機(jī)制。除了上述兩種主要機(jī)制外，核酸適配體還可能通過其他方式進(jìn)入細(xì)胞，如主動(dòng)運(yùn)輸，細(xì)胞利用能量和特定的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白將核酸適配體逆濃度梯度轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞；被動(dòng)擴(kuò)散，核酸適配體可能通過細(xì)胞膜的脂質(zhì)雙分子層自由擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞，但由于核酸適配體的親水性和相對(duì)較大的分子大小，被動(dòng)擴(kuò)散的效率可能較低。為了全面研究核酸適配體的細(xì)胞內(nèi)化機(jī)制，還可以進(jìn)一步采用低溫實(shí)驗(yàn)、能量抑制劑處理實(shí)驗(yàn)等方法進(jìn)行驗(yàn)證。在低溫實(shí)驗(yàn)中，將細(xì)胞與熒光標(biāo)記的核酸適配體在4℃下孵育，此時(shí)細(xì)胞的內(nèi)吞作用和主動(dòng)運(yùn)輸?shù)纫蕾嚹芰亢蜏囟鹊倪^程會(huì)受到抑制，若細(xì)胞對(duì)適配體的攝取量顯著降低，說明內(nèi)吞作用和主動(dòng)運(yùn)輸可能是主要的內(nèi)化方式；在能量抑制劑處理實(shí)驗(yàn)中，用能量抑制劑（如疊氮化鈉、2-脫氧葡萄糖等）預(yù)先處理細(xì)胞，抑制細(xì)胞的能量代謝，再加入熒光標(biāo)記的核酸適配體，若細(xì)胞對(duì)適配體的攝取量明顯減少，也表明主動(dòng)運(yùn)輸或依賴能量的內(nèi)吞作用在核酸適配體進(jìn)入細(xì)胞的過程中起重要作用。通過綜合多種實(shí)驗(yàn)方法的研究，可以更深入地揭示核酸適配體進(jìn)入低分化食管鱗癌細(xì)胞的具體內(nèi)化機(jī)制，為其在腫瘤治療中的應(yīng)用提供更堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。五、核酸適配體靶向低分化食管鱗癌的應(yīng)用探索5.1適配體在腫瘤診斷中的應(yīng)用潛力5.1.1基于適配體的腫瘤細(xì)胞檢測(cè)方法構(gòu)建基于適配體的生物傳感器是實(shí)現(xiàn)低分化食管鱗癌細(xì)胞高效檢測(cè)的關(guān)鍵策略之一。這種生物傳感器通常由適配體識(shí)別元件和信號(hào)轉(zhuǎn)換元件組成，利用適配體與低分化