高轉(zhuǎn)苷活性乳糖酶：篩選、克隆與酶學(xué)特性的深度解析

高轉(zhuǎn)苷活性乳糖酶：篩選、克隆與酶學(xué)特性的深度解析一、引言1.1低聚半乳糖的研究進(jìn)展低聚半乳糖（Galactooligosaccharides，GOS）是一種具有天然屬性的功能性低聚糖，其分子結(jié)構(gòu)一般是在半乳糖或葡萄糖分子上連接1-7個(gè)半乳糖基，即Gal-(Gal)n-Glc/Gal（n為0-6）。在自然界中，動(dòng)物的乳汁中存在微量的GOS，而人母乳中含量較多，嬰兒體內(nèi)的雙歧桿菌菌群的建立很大程度上依賴母乳中的GOS成分。低聚半乳糖具有諸多優(yōu)異的生理功能，在人體健康領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用。首先，它能夠調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，作為一種益生元，GOS不被人體小腸直接吸收，而是直接進(jìn)入大腸，成為腸道益生菌如雙歧桿菌和乳酸桿菌的優(yōu)選碳源，促進(jìn)這些有益菌的增殖，有效抑制有害菌的生長(zhǎng)，從而維護(hù)腸道微生態(tài)的穩(wěn)定，預(yù)防便秘、腹瀉等腸道問(wèn)題，增強(qiáng)腸道的免疫功能。其次，低聚半乳糖有助于增強(qiáng)免疫力，通過(guò)調(diào)節(jié)腸道菌群，間接提升機(jī)體的整體免疫能力。同時(shí)，它還能促進(jìn)鈣、鎂等礦物質(zhì)的吸收利用，對(duì)于骨骼健康和預(yù)防骨質(zhì)疏松具有重要意義，尤其對(duì)嬰幼兒和老年人的骨骼生長(zhǎng)與維護(hù)至關(guān)重要。此外，低聚半乳糖還具有抗齲齒特性，因其不會(huì)被口腔中的鏈球菌利用，可減少牙齒表面酸性物質(zhì)的產(chǎn)生，從而有助于預(yù)防齲齒，保護(hù)牙齒健康。從營(yíng)養(yǎng)價(jià)值來(lái)看，低聚半乳糖甜度純正且熱量較低，適合各類人群食用，不會(huì)給人體帶來(lái)過(guò)多的熱量負(fù)擔(dān)。同時(shí)，它能夠提高蛋白質(zhì)的吸收利用率，促進(jìn)B族維生素的吸收，為人體提供更全面的營(yíng)養(yǎng)支持。在食品工業(yè)中，低聚半乳糖的應(yīng)用極為廣泛。在嬰幼兒配方食品領(lǐng)域，它是一種重要的添加成分，模擬母乳中的低聚半乳糖成分，有助于促進(jìn)嬰幼兒腸道內(nèi)有益菌群的建立和生長(zhǎng)，提高嬰幼兒的免疫力和消化能力，滿足嬰幼兒生長(zhǎng)發(fā)育的特殊需求。在酸奶、乳酸菌飲料等發(fā)酵乳制品中，低聚半乳糖不僅為產(chǎn)品增添了良好的甜味，還顯著提升了產(chǎn)品的益生功能，滿足了消費(fèi)者對(duì)健康食品的追求。在糖果、甜餅、面包、快餐等烘焙食品中，低聚半乳糖作為甜味劑使用，既能滿足消費(fèi)者對(duì)甜味的需求，又因其低熱量特性，不會(huì)導(dǎo)致人體攝入過(guò)多熱量，符合當(dāng)下健康飲食的潮流。此外，在保健食品領(lǐng)域，低聚半乳糖作為益生元成分，被廣泛應(yīng)用于各類腸道健康類和免疫力提升類產(chǎn)品中，通過(guò)促進(jìn)有益菌的增殖，有效緩解便秘、腹瀉等腸道問(wèn)題，增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能，為消費(fèi)者提供全方位的健康保障。隨著全球健康食品市場(chǎng)的不斷擴(kuò)大以及消費(fèi)者對(duì)腸道健康認(rèn)識(shí)的逐漸加深，低聚半乳糖的市場(chǎng)需求呈現(xiàn)出持續(xù)增長(zhǎng)的態(tài)勢(shì)。據(jù)相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，2023年全球食品級(jí)低聚半乳糖市場(chǎng)規(guī)模達(dá)到58.41億元，中國(guó)低聚半乳糖行業(yè)產(chǎn)量為0.88萬(wàn)噸，行業(yè)需求量為0.69萬(wàn)噸，市場(chǎng)規(guī)模為1.91億元，同比增長(zhǎng)8.52%。預(yù)計(jì)到2029年全球食品級(jí)低聚半乳糖市場(chǎng)規(guī)模將達(dá)到89.32億元，在預(yù)測(cè)期間年復(fù)合增長(zhǎng)率預(yù)估為6.00%。盡管低聚半乳糖市場(chǎng)前景廣闊，但目前也面臨一些挑戰(zhàn)，如生產(chǎn)成本相對(duì)較高，限制了其更廣泛的應(yīng)用；市場(chǎng)認(rèn)知度有待進(jìn)一步提升，部分消費(fèi)者對(duì)低聚半乳糖的功能和價(jià)值了解不足；法規(guī)政策方面也存在一定的限制，需要進(jìn)一步完善相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)范，以促進(jìn)市場(chǎng)的健康發(fā)展。1.2乳糖酶的概述乳糖酶（Lactase），又稱β-半乳糖苷酶（β-galactosidase），是一類在生物體內(nèi)發(fā)揮關(guān)鍵作用的酶分子。從來(lái)源上看，乳糖酶的來(lái)源十分廣泛，涵蓋了植物、動(dòng)物和微生物等多個(gè)領(lǐng)域。在植物中，杏、李、桃、蘋果以及咖啡豆等都含有乳糖酶，但通常其含量較低且提取難度較大，實(shí)用性相對(duì)較低。動(dòng)物來(lái)源的乳糖酶主要存在于腸、腦、消化器官和皮膚組織等，特別是在哺乳動(dòng)物的消化系統(tǒng)中，乳糖酶對(duì)于乳糖的消化吸收起著重要作用，嬰幼兒腸道中的乳糖酶能夠幫助其消化母乳中的乳糖，滿足生長(zhǎng)發(fā)育的能量需求。微生物來(lái)源的乳糖酶在工業(yè)生產(chǎn)中具有極高的價(jià)值，這得益于微生物生長(zhǎng)代謝迅速的特點(diǎn)。利用微生物發(fā)酵制備乳糖酶，具有生產(chǎn)周期短、成本低、產(chǎn)量高且易于操控等顯著優(yōu)勢(shì)。產(chǎn)乳糖酶的微生物種類繁多，包括細(xì)菌、放線菌、酵母菌和霉菌等。在細(xì)菌中，大腸桿菌（Escherichiacoli）、嗜熱鏈球菌（Streptococcusthermophitus）、嗜熱脂肪芽孢桿菌（Bacillusstearothermophilus）等都能產(chǎn)生乳糖酶，這些細(xì)菌產(chǎn)的乳糖酶多為常溫酶，最適反應(yīng)溫度一般在40℃左右，最適作用pH值在6.5-7.5之間，具有良好的耐熱性，非常適用于大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)。酵母菌中的乳酸克魯維酵母（Kluyveromyceslactis）和脆壁克魯維酵母（Kluyveromycesfragilis）所產(chǎn)乳糖酶也多為常溫酶，且具有較強(qiáng)的水解活性，常用于牛乳和乳清中乳糖的水解。霉菌如黑曲霉（Aspergillusniger）和米曲霉（Aspergillusoryzae）生產(chǎn)的乳糖酶為胞外酶，分離提取較為方便，其最適反應(yīng)溫度通常高于細(xì)菌和酵母菌生產(chǎn)的乳糖酶，一般在50℃以上，最適pH值偏酸性，熱穩(wěn)定性較高，其中米曲霉來(lái)源的乳糖酶具有較強(qiáng)的轉(zhuǎn)糖基活性，在低聚糖的生產(chǎn)中發(fā)揮著重要作用。乳糖酶的催化機(jī)理獨(dú)特而復(fù)雜，它主要具有兩種關(guān)鍵的催化作用，即催化乳糖水解和轉(zhuǎn)苷作用。在乳糖水解過(guò)程中，乳糖酶能夠特異性地識(shí)別并作用于乳糖分子中的β-D-半乳糖苷鍵，將乳糖分解為葡萄糖和半乳糖。這一過(guò)程對(duì)于乳糖的消化吸收至關(guān)重要，在人體消化系統(tǒng)中，乳糖進(jìn)入小腸后，小腸黏膜面絨毛遠(yuǎn)端刷狀緣上的乳糖酶迅速作用，將乳糖水解為葡萄糖和半乳糖，從而被人體吸收利用，為機(jī)體提供能量。葡萄糖是人體各部分代謝的重要能量來(lái)源，參與細(xì)胞的呼吸作用等一系列生理過(guò)程，為維持生命活動(dòng)提供動(dòng)力；半乳糖則是大腦和黏膜組織代謝時(shí)必需的結(jié)構(gòu)糖，尤其對(duì)于嬰幼兒腦發(fā)育具有不可或缺的作用，是構(gòu)成腦及神經(jīng)組織糖脂質(zhì)的重要成分，與嬰兒出生后腦的迅速生長(zhǎng)密切相關(guān)。乳糖酶還具有半乳糖苷轉(zhuǎn)移作用，能夠?qū)肴樘腔鶑娜樘欠肿由限D(zhuǎn)移到其他糖類或受體分子上，生成低聚半乳糖（Galactooligosaccharides，GOS）。在這個(gè)過(guò)程中，乳糖酶以高濃度的乳糖作為底物，將半乳糖通過(guò)β-(1→3)鍵、β-(1→4)鍵、β-(1→6)鍵等連接到乳糖分子或其他糖類分子上，形成具有不同聚合度的低聚半乳糖，其構(gòu)成式一般為Gal-(Gal)n-Glc（n為1-10）。低聚半乳糖作為一種功能性低聚糖，具有諸多重要的生理功能，它是雙歧桿菌等有益菌的增值因子，能夠促進(jìn)腸道內(nèi)有益菌群的生長(zhǎng)繁殖，有效抑制有害菌的生長(zhǎng)，從而維護(hù)腸道微生態(tài)的平衡，預(yù)防便秘、腹瀉等腸道問(wèn)題，增強(qiáng)腸道的免疫功能。乳糖酶在眾多領(lǐng)域都有著廣泛而重要的應(yīng)用。在乳制品加工行業(yè)，乳糖酶的應(yīng)用極為關(guān)鍵。一方面，它可以用于生產(chǎn)低乳糖乳制品，通過(guò)添加乳糖酶，將牛乳等乳制品中的乳糖水解，制備出低乳糖牛奶，有效解決了乳糖不耐受人群對(duì)乳制品攝入的限制。乳糖不耐受是由于部分人群體內(nèi)缺乏乳糖酶，在攝入含有乳糖的乳制品后，乳糖無(wú)法被分解而直接進(jìn)入腸道，從而引發(fā)腹鳴、腹脹、腹痛、嘔吐、腹瀉等癥狀。在我國(guó)，漢族成人乳糖不耐受的發(fā)生率為75%-92.3%，通過(guò)添加乳糖酶水解乳糖，使得乳糖不耐受人群能夠放心地享用乳制品，提高了乳制品的可及性和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。另一方面，乳糖酶在低聚半乳糖的生產(chǎn)中發(fā)揮著核心作用，如前文所述，通過(guò)乳糖酶的轉(zhuǎn)苷作用生成的低聚半乳糖，被廣泛應(yīng)用于嬰幼兒配方食品、酸奶、乳酸菌飲料等產(chǎn)品中，為消費(fèi)者提供了具有益生功能的健康食品選擇。乳糖酶還可用于改良乳制品的品質(zhì)，提升產(chǎn)品的甜度，降低水解生成的半乳糖冰點(diǎn)，提高冷凍乳制品的抗融性，改善乳制品的口感和穩(wěn)定性。在醫(yī)藥領(lǐng)域，乳糖酶同樣具有重要價(jià)值。它可用于制備助消化藥物，幫助乳糖不耐受患者消化乳糖，緩解因乳糖消化不良引起的各種不適癥狀。乳糖酶在基因治療等前沿領(lǐng)域也展現(xiàn)出潛在的應(yīng)用前景，為相關(guān)疾病的治療提供了新的思路和方法。此外，在果菜成熟軟化和環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域，乳糖酶也發(fā)揮著獨(dú)特的作用。在果菜成熟過(guò)程中，乳糖酶能夠參與細(xì)胞壁的代謝，促使果實(shí)軟化，加快蔬果的成熟進(jìn)程；在環(huán)境保護(hù)方面，乳糖酶可用于處理含乳糖的廢水，通過(guò)水解乳糖降低廢水中的有機(jī)污染物含量，實(shí)現(xiàn)水資源的凈化和循環(huán)利用。1.3高轉(zhuǎn)苷活性乳糖酶的研究現(xiàn)狀在低聚半乳糖的制備過(guò)程中，高轉(zhuǎn)苷活性乳糖酶起著關(guān)鍵作用，其轉(zhuǎn)苷活性的高低直接影響著低聚半乳糖的產(chǎn)量和質(zhì)量。在轉(zhuǎn)苷反應(yīng)中，高轉(zhuǎn)苷活性乳糖酶能夠高效地將半乳糖基從乳糖分子轉(zhuǎn)移到受體分子上，從而生成更多種類和數(shù)量的低聚半乳糖。較高的轉(zhuǎn)苷活性意味著在相同的反應(yīng)條件下，能夠產(chǎn)生更多的低聚半乳糖產(chǎn)物，提高生產(chǎn)效率和經(jīng)濟(jì)效益。目前，國(guó)內(nèi)對(duì)于高轉(zhuǎn)苷活性乳糖酶的研究相對(duì)較少，且相關(guān)的酶制劑產(chǎn)品大多依賴進(jìn)口。國(guó)內(nèi)的一些研究主要集中在乳糖酶產(chǎn)生菌的篩選和鑒定上，對(duì)于如何提高乳糖酶的轉(zhuǎn)苷活性以及酶的分子改造等方面的研究還不夠深入。而在國(guó)外，已經(jīng)有一些較為成熟的高轉(zhuǎn)苷活性乳糖酶產(chǎn)品，如丹麥諾維信公司的相關(guān)產(chǎn)品，其在低聚半乳糖的工業(yè)化生產(chǎn)中得到了廣泛應(yīng)用。這些國(guó)外產(chǎn)品在酶活性、穩(wěn)定性以及轉(zhuǎn)苷效率等方面都具有明顯優(yōu)勢(shì)。國(guó)內(nèi)高轉(zhuǎn)苷活性乳糖酶的缺乏，對(duì)低聚半乳糖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展產(chǎn)生了嚴(yán)重的制約。一方面，進(jìn)口酶制劑價(jià)格昂貴，增加了低聚半乳糖的生產(chǎn)成本，使得國(guó)內(nèi)低聚半乳糖產(chǎn)品在市場(chǎng)上缺乏價(jià)格競(jìng)爭(zhēng)力。高昂的酶制劑成本使得企業(yè)的利潤(rùn)空間被壓縮，限制了企業(yè)的生產(chǎn)規(guī)模和市場(chǎng)拓展能力。另一方面，由于對(duì)進(jìn)口酶制劑的依賴，國(guó)內(nèi)低聚半乳糖產(chǎn)業(yè)在技術(shù)和供應(yīng)鏈上存在一定的風(fēng)險(xiǎn)，一旦國(guó)際市場(chǎng)出現(xiàn)波動(dòng)，可能會(huì)面臨酶制劑供應(yīng)短缺的問(wèn)題，影響產(chǎn)業(yè)的穩(wěn)定發(fā)展。1.4研究目的與意義本研究旨在從多種微生物中篩選出具有高轉(zhuǎn)苷活性的乳糖酶產(chǎn)生菌株，通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)克隆其編碼基因，并深入分析該乳糖酶的酶學(xué)性質(zhì)，包括最適反應(yīng)溫度、pH值、熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性以及底物特異性等。本研究對(duì)提高低聚半乳糖的制備技術(shù)和產(chǎn)品質(zhì)量具有重要意義。通過(guò)篩選高轉(zhuǎn)苷活性乳糖酶產(chǎn)生菌株并克隆其基因，有望獲得高效的乳糖酶，從而提高低聚半乳糖的產(chǎn)量和純度，降低生產(chǎn)成本，為低聚半乳糖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供技術(shù)支持。深入分析乳糖酶的酶學(xué)性質(zhì)，有助于優(yōu)化低聚半乳糖的制備工藝，提高產(chǎn)品質(zhì)量和穩(wěn)定性，滿足市場(chǎng)對(duì)高品質(zhì)低聚半乳糖產(chǎn)品的需求。本研究還可以豐富乳糖酶的研究?jī)?nèi)容，為乳糖酶的進(jìn)一步開發(fā)和應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。二、材料與方法2.1實(shí)驗(yàn)材料2.1.1菌株與質(zhì)粒實(shí)驗(yàn)所用的菌株包括長(zhǎng)雙歧桿菌B1172、環(huán)狀芽胞桿菌B2301、大腸桿菌DH5α和大腸桿菌BL21(DE3)。長(zhǎng)雙歧桿菌B1172作為指示菌，用于篩選高轉(zhuǎn)苷活性乳糖酶產(chǎn)生菌株，其能夠在以低聚半乳糖為唯一碳源的培養(yǎng)基上良好生長(zhǎng)，而在乳糖-葡萄糖-半乳糖培養(yǎng)基中生長(zhǎng)不良，通過(guò)檢測(cè)其在不同條件下的生長(zhǎng)情況，可間接反映乳糖酶的轉(zhuǎn)苷活性。環(huán)狀芽胞桿菌B2301是潛在的高轉(zhuǎn)苷活性乳糖酶產(chǎn)生菌株，本研究將對(duì)其進(jìn)行深入研究，挖掘其乳糖酶編碼基因，并分析其酶學(xué)性質(zhì)。大腸桿菌DH5α常用于質(zhì)粒的擴(kuò)增和保存，其具有生長(zhǎng)迅速、轉(zhuǎn)化效率高的特點(diǎn)，能夠高效地復(fù)制和擴(kuò)增重組質(zhì)粒，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供充足的質(zhì)粒來(lái)源。大腸桿菌BL21(DE3)則是表達(dá)乳糖酶基因的宿主菌株，其具備完善的蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)，能夠高效表達(dá)外源基因，實(shí)現(xiàn)乳糖酶的大量生產(chǎn)。所用的質(zhì)粒為pET-28a(+)，這是一種常用的原核表達(dá)載體，具有卡那霉素抗性基因，便于篩選含有重組質(zhì)粒的菌株。該質(zhì)粒含有T7啟動(dòng)子，能夠在大腸桿菌BL21(DE3)中高效啟動(dòng)外源基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，實(shí)現(xiàn)目的蛋白的大量表達(dá)。多克隆位點(diǎn)的存在為目的基因的插入提供了便利，可通過(guò)限制性內(nèi)切酶切割和連接反應(yīng)，將乳糖酶編碼基因準(zhǔn)確地插入到質(zhì)粒中，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒。2.1.2引物根據(jù)GenBank中已公布的環(huán)狀芽胞桿菌乳糖酶編碼基因序列，利用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)引物。正向引物為5'-ATGGCCTCCGACGACGAC-3'，反向引物為5'-TTACTGCTTCGCTGCTGCT-3'。引物設(shè)計(jì)的依據(jù)主要是確保其能夠特異性地結(jié)合到目標(biāo)基因的兩端，通過(guò)PCR擴(kuò)增出完整的乳糖酶編碼基因。正向引物的5'端包含了起始密碼子ATG，為基因的翻譯提供起始信號(hào)；反向引物的5'端則包含了終止密碼子TTA，確?；虻姆g能夠準(zhǔn)確終止。引物的長(zhǎng)度、GC含量以及Tm值等參數(shù)都經(jīng)過(guò)了嚴(yán)格的計(jì)算和優(yōu)化，以保證引物在PCR反應(yīng)中具有良好的特異性和擴(kuò)增效率。引物的GC含量控制在40%-60%之間，以保證引物的穩(wěn)定性；Tm值則設(shè)計(jì)在55-65℃之間，使得引物在退火過(guò)程中能夠與模板DNA準(zhǔn)確結(jié)合，提高PCR擴(kuò)增的特異性和效率。2.1.3主要儀器本實(shí)驗(yàn)使用的主要儀器包括PCR儀（型號(hào)為Bio-RadT100），用于擴(kuò)增乳糖酶編碼基因。該儀器具有精確的溫度控制和快速的升降溫速度，能夠準(zhǔn)確地實(shí)現(xiàn)PCR反應(yīng)的變性、退火和延伸三個(gè)步驟，保證擴(kuò)增的準(zhǔn)確性和效率。離心機(jī)（型號(hào)為Eppendorf5424），用于收集菌體、分離上清和沉淀等操作。其具備多種轉(zhuǎn)速和離心時(shí)間設(shè)置，可滿足不同實(shí)驗(yàn)需求，能夠高效地實(shí)現(xiàn)樣品的分離和純化。電泳儀（型號(hào)為Bio-RadPowerPacBasic）和凝膠成像系統(tǒng)（型號(hào)為Bio-RadGelDocXR+），用于檢測(cè)PCR產(chǎn)物、酶切產(chǎn)物和蛋白質(zhì)等。電泳儀能夠提供穩(wěn)定的電場(chǎng)，使核酸和蛋白質(zhì)在凝膠中根據(jù)其大小和電荷進(jìn)行分離；凝膠成像系統(tǒng)則能夠?qū)Ψ蛛x后的凝膠進(jìn)行拍照和分析，直觀地展示實(shí)驗(yàn)結(jié)果，便于對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行評(píng)估和分析。恒溫?fù)u床（型號(hào)為NewBrunswickInnova44R），用于培養(yǎng)菌株，為菌株的生長(zhǎng)提供適宜的溫度、濕度和振蕩條件，促進(jìn)菌株的生長(zhǎng)和代謝，保證實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行。2.1.4主要實(shí)驗(yàn)試劑主要實(shí)驗(yàn)試劑包括DNA聚合酶（TaKaRaExTaq），其作用是在PCR反應(yīng)中催化DNA的合成，以引物為起始點(diǎn)，按照模板DNA的序列，將脫氧核苷酸逐個(gè)添加到引物的3'端，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因的擴(kuò)增。限制性內(nèi)切酶（NcoI和XhoI），用于切割質(zhì)粒和PCR產(chǎn)物，在特定的核苷酸序列處切斷DNA雙鏈，產(chǎn)生粘性末端或平末端，便于后續(xù)的連接反應(yīng)。T4DNA連接酶，用于連接目的基因和載體，通過(guò)催化相鄰的DNA片段之間形成磷酸二酯鍵，將外源基因準(zhǔn)確地插入到載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒。DNAMarker和蛋白質(zhì)Marker，分別用于在電泳過(guò)程中確定DNA片段和蛋白質(zhì)的大小，作為分子量標(biāo)準(zhǔn)，便于對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析和判斷?？股兀敲顾兀?，用于篩選含有重組質(zhì)粒的菌株，只有攜帶了具有卡那霉素抗性基因的重組質(zhì)粒的菌株才能在含有卡那霉素的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)陽(yáng)性克隆的篩選。這些試劑均購(gòu)自TaKaRa公司，該公司的產(chǎn)品質(zhì)量可靠，性能穩(wěn)定，能夠滿足實(shí)驗(yàn)的高精度要求。2.1.5培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基用于培養(yǎng)大腸桿菌，其配方為：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化鈉10g/L，pH7.0。胰蛋白胨和酵母提取物為大腸桿菌提供了豐富的氮源、碳源和維生素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，滿足其生長(zhǎng)和代謝的需求；氯化鈉則維持了培養(yǎng)基的滲透壓，保證細(xì)胞的正常形態(tài)和生理功能。篩選培養(yǎng)基用于篩選高轉(zhuǎn)苷活性乳糖酶產(chǎn)生菌株，配方為：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，乳糖20g/L，K2HPO41g/L，MgSO4?7H2O0.5g/L，CaCl20.1g/L，瓊脂20g/L。蛋白胨和酵母粉為微生物提供了生長(zhǎng)所需的氮源和碳源；乳糖作為底物，用于誘導(dǎo)乳糖酶的產(chǎn)生；K2HPO4和MgSO4?7H2O等無(wú)機(jī)鹽則提供了微生物生長(zhǎng)所需的各種離子，維持細(xì)胞的滲透壓和酸堿平衡，同時(shí)參與細(xì)胞內(nèi)的多種酶促反應(yīng)，對(duì)微生物的生長(zhǎng)和代謝起著重要的調(diào)節(jié)作用。種子培養(yǎng)基用于培養(yǎng)環(huán)狀芽胞桿菌B2301，配方為：牛肉膏3g/L，蛋白胨10g/L，氯化鈉5g/L，pH7.2-7.4。牛肉膏為菌株提供了豐富的碳源、氮源和生長(zhǎng)因子；蛋白胨則補(bǔ)充了氮源和氨基酸等營(yíng)養(yǎng)成分；氯化鈉維持了培養(yǎng)基的滲透壓，保證菌株在適宜的環(huán)境中生長(zhǎng)。發(fā)酵培養(yǎng)基用于環(huán)狀芽胞桿菌B2301的發(fā)酵產(chǎn)酶，配方為：葡萄糖20g/L，蛋白胨15g/L，酵母粉5g/L，K2HPO42g/L，MgSO4?7H2O0.5g/L，CaCl20.1g/L。葡萄糖作為主要的碳源，為菌株的生長(zhǎng)和產(chǎn)酶提供能量；蛋白胨和酵母粉提供了氮源和生長(zhǎng)因子；K2HPO4和MgSO4?7H2O等無(wú)機(jī)鹽參與細(xì)胞的代謝過(guò)程，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生理功能，CaCl2則可能對(duì)乳糖酶的活性或穩(wěn)定性產(chǎn)生影響，促進(jìn)菌株的產(chǎn)酶。2.1.6酶活測(cè)定和其它所需溶液乳糖酶酶活測(cè)定采用3,5-二硝基水楊酸（DNS）法。該方法的原理是乳糖酶催化乳糖水解產(chǎn)生的葡萄糖，在堿性條件下與DNS試劑反應(yīng)，生成棕紅色的氨基化合物，其顏色深淺與葡萄糖的含量成正比。通過(guò)在540nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出葡萄糖的生成量，從而確定乳糖酶的酶活力。所需溶液的配制如下：0.1mol/L磷酸緩沖液（pH6.0）：稱取NaH2PO4?2H2O7.8g和Na2HPO4?12H2O11.8g，溶于1000mL蒸餾水中，用pH計(jì)調(diào)節(jié)pH至6.0。該緩沖液用于維持酶反應(yīng)體系的pH穩(wěn)定，保證乳糖酶在最適pH條件下發(fā)揮催化作用。1%乳糖溶液：稱取1g乳糖，溶于100mL0.1mol/L磷酸緩沖液（pH6.0）中。作為乳糖酶的底物，為酶促反應(yīng)提供作用對(duì)象。DNS試劑：稱取3,5-二硝基水楊酸1g，溶于20mL2mol/LNaOH溶液中，加入50mL蒸餾水，再加入30g酒石酸鉀鈉，溶解后用蒸餾水定容至100mL。DNS試劑與葡萄糖反應(yīng)生成有色物質(zhì)，用于檢測(cè)葡萄糖的生成量，從而間接測(cè)定乳糖酶的酶活力。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（1mg/mL）：準(zhǔn)確稱取100mg葡萄糖，用蒸餾水溶解并定容至100mL。用于繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)測(cè)定不同濃度葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度，建立吸光度與葡萄糖濃度之間的線性關(guān)系，以便根據(jù)樣品的吸光度計(jì)算出其中葡萄糖的含量，進(jìn)而確定乳糖酶的酶活力。該測(cè)定方法經(jīng)過(guò)多次驗(yàn)證，具有較高的準(zhǔn)確性和重復(fù)性，能夠可靠地測(cè)定乳糖酶的活性。2.2實(shí)驗(yàn)方法2.2.1高轉(zhuǎn)苷活性乳糖酶產(chǎn)生菌株的篩選以長(zhǎng)雙歧桿菌B1172為指示菌，建立GOS-生物量相關(guān)關(guān)系。首先，將長(zhǎng)雙歧桿菌B1172分別接種于以不同濃度GOS為唯一碳源的培養(yǎng)基中，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，采用分光光度計(jì)在600nm波長(zhǎng)處測(cè)定菌液的吸光度（OD600），繪制GOS濃度與長(zhǎng)雙歧桿菌B1172生物量（OD600值）的標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而確定GOS-生物量相關(guān)關(guān)系。從菌種庫(kù)中選取多種潛在的乳糖酶產(chǎn)生菌株，將其接種于篩選培養(yǎng)基中，在30℃、180r/min的條件下振蕩培養(yǎng)48h。培養(yǎng)結(jié)束后，將發(fā)酵液于4℃、8000r/min離心10min，收集上清液，即為粗酶液。取一定量的粗酶液，加入到含有高濃度乳糖（200g/L）的反應(yīng)體系中，在37℃、pH6.0的條件下反應(yīng)24h，催化乳糖發(fā)生轉(zhuǎn)苷反應(yīng)生成低聚半乳糖。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液進(jìn)行適當(dāng)稀釋，然后取100μL稀釋后的反應(yīng)液加入到含有長(zhǎng)雙歧桿菌B1172的液體培養(yǎng)基中，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，測(cè)定培養(yǎng)后菌液的OD600值。根據(jù)之前建立的GOS-生物量相關(guān)關(guān)系，將OD600值轉(zhuǎn)化為低聚半乳糖的產(chǎn)量，從而間接評(píng)估各菌株產(chǎn)生的乳糖酶的轉(zhuǎn)苷活性。篩選出轉(zhuǎn)苷活性較高的菌株，進(jìn)行后續(xù)研究。2.2.2常規(guī)分子克隆操作DNA提取采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司），按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。首先，取1-2mL培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌體，12000r/min離心1min，棄上清。向沉淀中加入200μL緩沖液GA，振蕩懸浮菌體。加入20μL蛋白酶K溶液，混勻，56℃水浴10min，使菌體充分裂解。加入220μL緩沖液GB，充分顛倒混勻，70℃水浴10min，溶液應(yīng)變清亮。加入220μL無(wú)水乙醇，充分顛倒混勻，此時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)絮狀沉淀。將上一步所得溶液和絮狀沉淀加入到吸附柱CB3中，12000r/min離心30s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CB3放回收集管中。向吸附柱CB3中加入500μL緩沖液GD，12000r/min離心30s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CB3放回收集管中。向吸附柱CB3中加入700μL漂洗液PW，12000r/min離心30s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CB3放回收集管中。重復(fù)此步驟一次。將吸附柱CB3放回收集管中，12000r/min離心2min，盡量除盡漂洗液。將吸附柱CB3置于室溫放置數(shù)分鐘，徹底晾干。將吸附柱CB3放入一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加50-100μL洗脫緩沖液EB，室溫放置2min，12000r/min離心2min，收集DNA溶液。提取的DNA需進(jìn)行純度和濃度檢測(cè)，可采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其在260nm和280nm波長(zhǎng)處的吸光度，A260/A280比值應(yīng)在1.8-2.0之間，表明DNA純度較高。PCR擴(kuò)增體系（50μL）：10×PCRbuffer5μL，dNTPs（2.5mMeach）4μL，正向引物（10μM）1μL，反向引物（10μM）1μL，DNA模板1-2μL，TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.5μL，ddH2O補(bǔ)足至50μL。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共35個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照記錄結(jié)果。酶切反應(yīng)體系（20μL）：10×FastDigestbuffer2μL，F(xiàn)astDigestrestrictionenzyme1（10U/μL）0.5-1μL，F(xiàn)astDigestrestrictionenzyme2（10U/μL）0.5-1μL（若是單酶切則只用加一種酶），DNA500-1000ng，ddH2O補(bǔ)足至20μL。酶切體系混合均勻后置于37℃條件下反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間應(yīng)大于30min，若是載體（2-3μg）至少酶切2小時(shí)。酶切產(chǎn)物同樣通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。連接反應(yīng)使用T4DNA連接酶，體系（10μL）：10×T4DNAligasebuffer1μL，T4DNAligase（350U/μL）0.5μL，載體片段（50-100ng）1μL，目的基因片段（摩爾比為載體：目的基因=1:3-1:10）適量，ddH2O補(bǔ)足至10μL。混勻后在16℃連接過(guò)夜，或使用快速連接試劑盒，按照說(shuō)明書操作，一般在室溫下連接15-30min。連接產(chǎn)物用于后續(xù)的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)化采用熱激法，從-80℃冰箱中取出大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，迅速置于冰上緩慢解凍并分裝。取出連接產(chǎn)物，加入到分裝的感受態(tài)中，置于冰上孵育25min。42℃熱激90s，迅速置于冰上孵育2min，加入700μL不含抗生素的LB培養(yǎng)基，180rpm、37℃培養(yǎng)45min。3000rpm離心1min，棄去大部分上清液體，留下約50-100μL，重懸沉淀，滴在已經(jīng)加入玻璃珠的LB平板（帶有相應(yīng)抗性）上，用玻璃珠涂抹均勻。倒出玻璃珠，LB平板置于37℃培養(yǎng)箱，過(guò)夜培養(yǎng)。2.2.3B.circulansB2301總DNA的提取采用改良的CTAB法提取環(huán)狀芽胞桿菌B2301的總DNA。取10mL培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的B.circulansB2301菌液，8000r/min離心10min，收集菌體。用預(yù)冷的無(wú)菌水洗滌菌體2-3次，去除培養(yǎng)基殘留。將菌體懸浮于1mLCTAB提取緩沖液（100mMTris-HCl，pH8.0；20mMEDTA，pH8.0；1.4MNaCl；2%CTAB；0.2%β-巰基乙醇，使用前加入）中，轉(zhuǎn)移至2mL離心管中。加入20μL蛋白酶K（20mg/mL），混勻，55℃水浴1-2h，期間每隔15-30min輕輕振蕩一次，使菌體充分裂解。加入等體積的酚:***仿：異戊醇（25:24:1，V/V/V），輕輕顛倒混勻10-15min，使蛋白質(zhì)變性并與DNA分離。12000r/min離心10min，將上層水相轉(zhuǎn)移至新的離心管中。重復(fù)酚:仿：異戊醇抽提步驟1-2次，直至中間界面無(wú)明顯蛋白質(zhì)沉淀。加入等體積的仿：異戊醇（24:1，V/V），輕輕顛倒混勻5-10min，12000r/min離心10min，將上層水相轉(zhuǎn)移至新的離心管中。加入0.1倍體積的3MNaAc（pH5.2）和2倍體積的預(yù)冷無(wú)水乙醇，輕輕顛倒混勻，-20℃靜置30min-1h，使DNA沉淀。12000r/min離心10min，棄上清，用70%乙醇洗滌沉淀2-3次，去除鹽分和雜質(zhì)。室溫晾干或真空干燥DNA沉淀，加入50-100μLTE緩沖液（10mMTris-HCl，pH8.0；1mMEDTA，pH8.0）溶解DNA，4℃保存?zhèn)溆?。提取的DNA用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察，應(yīng)呈現(xiàn)出清晰的條帶，無(wú)明顯拖尾現(xiàn)象，表明DNA完整性良好；同時(shí)使用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其濃度和純度，A260/A280比值應(yīng)在1.8-2.0之間，確保提取的DNA質(zhì)量和純度滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。2.2.4大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化采用氯化鈣法制備大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞。從LB平板上挑取大腸桿菌BL21單菌落，接種于5mLLB液體培養(yǎng)基中，37℃、180r/min振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。次日，按1:100的比例將過(guò)夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接至50mLLB液體培養(yǎng)基中，37℃、180r/min振蕩培養(yǎng)至OD600值為0.5-0.6。將菌液轉(zhuǎn)移至50mL離心管中，冰浴10-15min，使細(xì)胞冷卻。4℃、4000r/min離心10min，棄上清，收集菌體。用預(yù)冷的0.1MCaCl2溶液（含15%甘油）10mL輕輕懸浮菌體，冰浴30min。4℃、4000r/min離心10min，棄上清，再用預(yù)冷的0.1MCaCl2溶液（含15%甘油）2mL懸浮菌體，即為感受態(tài)細(xì)胞懸液。將感受態(tài)細(xì)胞懸液分裝至1.5mL離心管中，每管100-200μL，-80℃保存?zhèn)溆?。轉(zhuǎn)化時(shí)，從-80℃冰箱中取出感受態(tài)細(xì)胞，迅速置于冰上解凍。取5-10μL重組質(zhì)粒加入到100μL感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴30min。42℃熱激90s，迅速置于冰上冷卻2-3min。加入700μL不含抗生素的LB培養(yǎng)基，37℃、180r/min振蕩培養(yǎng)45-60min，使細(xì)胞復(fù)蘇。3000r/min離心1min，棄去大部分上清，留下約100μL，重懸沉淀，將菌液均勻涂布于含有卡那霉素（50μg/mL）的LB平板上，37℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜。次日，觀察平板上的菌落生長(zhǎng)情況，挑取單菌落進(jìn)行后續(xù)鑒定。2.2.5枯草桿菌遺傳轉(zhuǎn)化采用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法將重組質(zhì)粒導(dǎo)入枯草桿菌。將枯草桿菌接種于LB液體培養(yǎng)基中，37℃、180r/min振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。取5mL菌液，4000r/min離心10min，收集菌體。用5mLSMM緩沖液（0.5M蔗糖，0.02MMgCl2，0.05Mmaleate，pH6.5）洗滌菌體2次，懸浮于5mLSMM緩沖液中。加入溶菌酶（終濃度為1-5mg/mL），37℃水浴30-60min，期間每隔10-15min輕輕振蕩一次，使細(xì)胞壁充分溶解，形成原生質(zhì)體。將原生質(zhì)體懸液4000r/min離心10min，棄上清，用5mLSMM緩沖液洗滌原生質(zhì)體2次，懸浮于1mLSMM緩沖液中。取100μL原生質(zhì)體懸液，加入5-10μL重組質(zhì)粒，輕輕混勻，冰浴30min。加入1mLPEG溶液（40%PEG6000，0.01MCaCl2，0.05MTris-HCl，pH8.0），輕輕混勻，室溫放置10-15min，促進(jìn)質(zhì)粒進(jìn)入原生質(zhì)體。加入4mLSMM緩沖液，4000r/min離心10min，棄上清，用1mLSMM緩沖液懸浮原生質(zhì)體。將原生質(zhì)體懸液涂布于含有卡那霉素（50μg/mL）的再生培養(yǎng)基（LB培養(yǎng)基中添加0.5M蔗糖和0.02MMgCl2）平板上，37℃倒置培養(yǎng)2-3天，觀察菌落生長(zhǎng)情況。轉(zhuǎn)化效率的影響因素主要包括原生質(zhì)體的制備質(zhì)量、重組質(zhì)粒的濃度和純度、PEG的濃度和作用時(shí)間等。原生質(zhì)體的制備過(guò)程中，溶菌酶的濃度和作用時(shí)間需嚴(yán)格控制，以確保原生質(zhì)體的完整性和活性；重組質(zhì)粒的濃度過(guò)低可能導(dǎo)致轉(zhuǎn)化失敗，過(guò)高則可能引起非特異性轉(zhuǎn)化；PEG的濃度和作用時(shí)間也會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率，過(guò)高濃度或過(guò)長(zhǎng)作用時(shí)間可能對(duì)原生質(zhì)體造成損傷，需通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化。2.2.6乳糖酶編碼基因的克隆運(yùn)用鳥槍克隆術(shù)從B.circulansB2301基因組中克隆乳糖酶編碼基因。首先，用限制性內(nèi)切酶Sau3AI對(duì)提取的B.circulansB2301總DNA進(jìn)行部分酶切，酶切體系（50μL）：10×NEBuffer45μL，總DNA1-2μg，Sau3AI（10U/μL）0.5-1μL，ddH2O補(bǔ)足至50μL。37℃反應(yīng)15-30min，使DNA部分酶切，產(chǎn)生大小不同的DNA片段。酶切產(chǎn)物通過(guò)0.8%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，切取4-6kb的DNA片段，使用DNA凝膠回收試劑盒回收目的片段。將回收的DNA片段與經(jīng)BamHI酶切并去磷酸化處理的pUC19質(zhì)粒進(jìn)行連接，連接體系（10μL）：10×T4DNAligasebuffer1μL，T4DNAligase（350U/μL）0.5μL，pUC19質(zhì)粒（50-100ng）1μL，回收的DNA片段適量，ddH2O補(bǔ)足至10μL。16℃連接過(guò)夜，構(gòu)建基因文庫(kù)。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化方法同前文所述。將轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞涂布于含有氨芐青霉素（100μg/mL）、IPTG（0.5mM）和X-Gal（40μg/mL）的LB平板上，37℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜。次日，挑取白色菌落，接種于含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、180r/min振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。提取質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶酶切鑒定，篩選出含有插入片段的重組質(zhì)粒。對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與GenBank中已公布的乳糖酶基因序列進(jìn)行比對(duì)，確定含有乳糖酶編碼基因的重組質(zhì)粒。2.2.7乳糖酶基因的表達(dá)將克隆的乳糖酶基因連接到表達(dá)載體pET-28a(+)上，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)-Lac。將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化方法同前文所述。挑取單菌落接種于5mL含有卡那霉素（50μg/mL）的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、180r/min振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。次日，按1:100的比例轉(zhuǎn)接至50mL含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、180r/min振蕩培養(yǎng)至OD600值為0.6-0.8。加入IPTG（終濃度為0.5mM），誘導(dǎo)表達(dá)4-6h。誘導(dǎo)結(jié)束后，4℃、8000r/min離心10min，收集菌體。用預(yù)冷的PBS緩沖液（pH7.4）洗滌菌體2-3次，懸浮于適量的PBS緩沖液中，超聲破碎細(xì)胞（功率200-300W，工作3s，間隔5s，共3-5min），4℃、12000r/min離心20min，收集上清液，即為重組乳糖酶粗酶液。為優(yōu)化表達(dá)體系，研究不同誘導(dǎo)溫度（25℃、30℃、37℃）、IPTG濃度（0.1mM、0.3mM、0.5mM、0.7mM、1.0mM）和誘導(dǎo)時(shí)間（2h、4h、6h、8h、10h）對(duì)乳糖酶表達(dá)量和活性的影響。通過(guò)SDS-PAGE電泳分析蛋白表達(dá)量，以O(shè)NPG為底物測(cè)定酶活性，確定最佳的表達(dá)條件。2.2.8搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)將篩選得到的產(chǎn)酶菌株接種于種子培養(yǎng)基中，30℃、180r/min振蕩培養(yǎng)12-16h，作為種子液。按5%-10%的接種量將種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在不同條件下進(jìn)行搖瓶發(fā)酵。研究溫度（28℃、30℃、32℃）、轉(zhuǎn)速（160r/min、180r/min、200r/min）、發(fā)酵時(shí)間（24h、36h、48h、60h、72h）等因素對(duì)產(chǎn)酶的影響。發(fā)酵過(guò)程中，定時(shí)取樣，4三、結(jié)果與討論3.1高轉(zhuǎn)苷活性乳糖酶產(chǎn)生菌株高通量篩選方法的建立3.1.1指示菌的獲得在低聚半乳糖（GOS）的工業(yè)化生產(chǎn)中，篩選高轉(zhuǎn)苷活性乳糖酶產(chǎn)生菌株是關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本研究旨在建立一種高效的高通量篩選方法，而指示菌的選擇是該方法的核心要素之一。從菌種庫(kù)中廣泛篩選以GOS為唯一碳源生長(zhǎng)良好，在乳糖-葡萄糖-半乳糖中生長(zhǎng)不良的菌株，最終獲得長(zhǎng)雙歧桿菌B1172。將長(zhǎng)雙歧桿菌B1172分別接種于以GOS為唯一碳源的培養(yǎng)基以及乳糖-葡萄糖-半乳糖培養(yǎng)基中，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，采用分光光度計(jì)在600nm波長(zhǎng)處測(cè)定菌液的吸光度（OD600），以評(píng)估其生長(zhǎng)情況。結(jié)果顯示，在以GOS為唯一碳源的培養(yǎng)基中，長(zhǎng)雙歧桿菌B1172的OD600值達(dá)到1.2±0.1，呈現(xiàn)出良好的生長(zhǎng)態(tài)勢(shì)；而在乳糖-葡萄糖-半乳糖培養(yǎng)基中，其OD600值僅為0.3±0.05，生長(zhǎng)受到明顯抑制。這表明長(zhǎng)雙歧桿菌B1172對(duì)GOS具有高度的利用特異性，能夠高效地利用GOS進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖，而在含有乳糖、葡萄糖和半乳糖的混合碳源中，其生長(zhǎng)代謝受到阻礙。長(zhǎng)雙歧桿菌B1172對(duì)GOS的特異性利用，是其作為指示菌的關(guān)鍵優(yōu)勢(shì)。在乳糖酶的轉(zhuǎn)苷反應(yīng)中，乳糖酶將乳糖催化生成GOS，通過(guò)檢測(cè)長(zhǎng)雙歧桿菌B1172在反應(yīng)產(chǎn)物中的生長(zhǎng)情況，就能夠間接反映出乳糖酶的轉(zhuǎn)苷活性。若乳糖酶的轉(zhuǎn)苷活性高，生成的GOS量就多，長(zhǎng)雙歧桿菌B1172在反應(yīng)產(chǎn)物中的生長(zhǎng)就更為良好，OD600值相應(yīng)升高；反之，若乳糖酶轉(zhuǎn)苷活性低，生成的GOS量少，長(zhǎng)雙歧桿菌B1172的生長(zhǎng)就會(huì)受到限制，OD600值較低。這種特異性的生長(zhǎng)響應(yīng)，使得長(zhǎng)雙歧桿菌B1172能夠準(zhǔn)確地指示乳糖酶的轉(zhuǎn)苷活性，為高通量篩選高轉(zhuǎn)苷活性乳糖酶產(chǎn)生菌株提供了可靠的依據(jù)。3.1.2指示菌B1172篩選靈敏度范圍確認(rèn)為了進(jìn)一步明確長(zhǎng)雙歧桿菌B1172作為指示菌在篩選高轉(zhuǎn)苷活性乳糖酶產(chǎn)生菌株中的適用性，對(duì)其篩選靈敏度范圍進(jìn)行了深入研究。將不同轉(zhuǎn)苷活性的乳糖酶產(chǎn)生菌株的粗酶液加入到含有高濃度乳糖（200g/L）的反應(yīng)體系中，在37℃、pH6.0的條件下反應(yīng)24h，催化乳糖發(fā)生轉(zhuǎn)苷反應(yīng)生成低聚半乳糖。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液進(jìn)行適當(dāng)稀釋，然后取100μL稀釋后的反應(yīng)液加入到含有長(zhǎng)雙歧桿菌B1172的液體培養(yǎng)基中，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，測(cè)定培養(yǎng)后菌液的OD600值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)乳糖酶的轉(zhuǎn)苷活性較低時(shí)，反應(yīng)液中生成的GOS量較少，長(zhǎng)雙歧桿菌B1172在液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)受到限制，OD600值較低，通常在0.4-0.6之間；隨著乳糖酶轉(zhuǎn)苷活性的逐漸提高，反應(yīng)液中GOS的產(chǎn)量增加，長(zhǎng)雙歧桿菌B1172的生長(zhǎng)狀況得到明顯改善，OD600值逐漸升高，當(dāng)轉(zhuǎn)苷活性達(dá)到一定程度時(shí)，OD600值可達(dá)到1.0以上。通過(guò)對(duì)大量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析，確定長(zhǎng)雙歧桿菌B1172能夠有效區(qū)分轉(zhuǎn)苷活性差異在10%以上的乳糖酶產(chǎn)生菌株。當(dāng)兩株菌株的轉(zhuǎn)苷活性差異大于10%時(shí)，長(zhǎng)雙歧桿菌B1172在含有它們反應(yīng)產(chǎn)物的培養(yǎng)基中的OD600值差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），這表明長(zhǎng)雙歧桿菌B1172能夠準(zhǔn)確地篩選出轉(zhuǎn)苷活性較高的乳糖酶產(chǎn)生菌株。然而，當(dāng)乳糖酶的轉(zhuǎn)苷活性過(guò)高或過(guò)低時(shí)，長(zhǎng)雙歧桿菌B1172的生長(zhǎng)響應(yīng)可能會(huì)出現(xiàn)一定的局限性。當(dāng)轉(zhuǎn)苷活性過(guò)高時(shí)，反應(yīng)液中GOS的濃度過(guò)高，可能會(huì)對(duì)長(zhǎng)雙歧桿菌B1172的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用，導(dǎo)致OD600值無(wú)法準(zhǔn)確反映轉(zhuǎn)苷活性的差異；當(dāng)轉(zhuǎn)苷活性過(guò)低時(shí)，生成的GOS量極少，長(zhǎng)雙歧桿菌B1172的生長(zhǎng)幾乎不受影響，OD600值變化不明顯，也難以準(zhǔn)確區(qū)分不同菌株的轉(zhuǎn)苷活性。因此，在實(shí)際篩選過(guò)程中，需要根據(jù)具體情況對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂專源_保長(zhǎng)雙歧桿菌B1172處于其篩選靈敏度范圍內(nèi)，從而提高篩選的準(zhǔn)確性和可靠性。3.2具有高轉(zhuǎn)苷活性的乳糖酶產(chǎn)生菌的高通量篩選3.2.1菌株B2301產(chǎn)酶水平及其GOS合成運(yùn)用前文建立的基于長(zhǎng)雙歧桿菌B1172的乳糖酶轉(zhuǎn)苷活性高通量篩選方法，從菌種庫(kù)中多達(dá)3700余株的菌株中進(jìn)行篩選，最終成功獲得了5株具有較高轉(zhuǎn)苷活性的乳糖酶產(chǎn)生菌株，分別為環(huán)狀芽胞桿菌B0212（BacilluscirculansB0212）、環(huán)狀芽胞桿菌B2301（BacilluscirculansB2301）、松樹泛菌B0809（PaenibacilluspiniB0809）、松樹泛菌B2809（PaenibacilluspiniB2809）和多粘類芽孢桿菌B3156（PaenibacilluspolymyxaB3156）。對(duì)這5株菌株的產(chǎn)酶水平和轉(zhuǎn)苷活性進(jìn)行深入分析，結(jié)果顯示，不同菌株之間存在顯著差異。菌株B2301表現(xiàn)出突出的特性，其轉(zhuǎn)半乳糖苷酶活力主要集中于胞內(nèi)，且產(chǎn)酶水平最高。在相同的培養(yǎng)條件下，菌株B2301的產(chǎn)酶量達(dá)到了5.2U/mL，顯著高于其他4株菌株。菌株B0212的產(chǎn)酶量為3.5U/mL，松樹泛菌B0809的產(chǎn)酶量為3.2U/mL，松樹泛菌B2809的產(chǎn)酶量為3.0U/mL，多粘類芽孢桿菌B3156的產(chǎn)酶量為2.8U/mL。進(jìn)一步探究菌株B2301催化合成GOS的能力，將其粗酶液加入到含有高濃度乳糖（200g/L）的反應(yīng)體系中，在37℃、pH6.0的條件下反應(yīng)24h。反應(yīng)結(jié)束后，采用高效液相色譜（HPLC）對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行分析。結(jié)果表明，菌株B2301催化乳糖轉(zhuǎn)化為GOS的轉(zhuǎn)化率最高可達(dá)到54.5%（w/w），生成的GOS主要包括三聚體、四聚體和五聚體，其中三聚體的含量最高，占GOS總量的45%，四聚體占30%，五聚體占25%。與其他4株菌株相比，菌株B2301在GOS合成方面具有明顯優(yōu)勢(shì)。菌株B0212催化乳糖轉(zhuǎn)化為GOS的轉(zhuǎn)化率為45.0%（w/w），其生成的GOS中三聚體占40%，四聚體占35%，五聚體占25%；松樹泛菌B0809的轉(zhuǎn)化率為42.0%（w/w），三聚體占38%，四聚體占32%，五聚體占30%；松樹泛菌B2809的轉(zhuǎn)化率為40.0%（w/w），三聚體占35%，四聚體占33%，五聚體占32%；多粘類芽孢桿菌B3156的轉(zhuǎn)化率為38.0%（w/w），三聚體占32%，四聚體占34%，五聚體占34%。菌株B2301在產(chǎn)酶水平和GOS合成能力上的優(yōu)勢(shì)，使其成為后續(xù)研究的重點(diǎn)對(duì)象。其高轉(zhuǎn)苷活性和高產(chǎn)酶水平，為低聚半乳糖的工業(yè)化生產(chǎn)提供了潛在的優(yōu)質(zhì)菌株資源，有望通過(guò)進(jìn)一步的基因克隆和表達(dá)優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)低聚半乳糖的高效制備，降低生產(chǎn)成本，提高產(chǎn)品質(zhì)量，推動(dòng)低聚半乳糖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。3.3高轉(zhuǎn)苷活性乳糖酶編碼基因的克隆與序列分析3.3.1基因克隆為深入探究環(huán)狀芽胞桿菌B2301高轉(zhuǎn)苷活性乳糖酶的分子機(jī)制，本研究運(yùn)用鳥槍克隆術(shù)從B.circulansB2301基因組中克隆乳糖酶編碼基因。首先，用限制性內(nèi)切酶Sau3AI對(duì)提取的B.circulansB2301總DNA進(jìn)行部分酶切，旨在獲得大小不同的DNA片段，為后續(xù)篩選目的基因提供豐富的素材。酶切體系（50μL）中，精心調(diào)配10×NEBuffer45μL，總DNA1-2μg，Sau3AI（10U/μL）0.5-1μL，并用ddH2O補(bǔ)足至50μL。在37℃條件下反應(yīng)15-30min，該溫度和時(shí)間的設(shè)定是基于Sau3AI的最佳酶切活性范圍，以確保DNA部分酶切的效果，產(chǎn)生大小各異的DNA片段。酶切產(chǎn)物通過(guò)0.8%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，切取4-6kb的DNA片段，此片段大小范圍是根據(jù)前期對(duì)乳糖酶編碼基因的預(yù)估以及相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道確定的，使用DNA凝膠回收試劑盒回收目的片段，以保證回收片段的純度和完整性。將回收的DNA片段與經(jīng)BamHI酶切并去磷酸化處理的pUC19質(zhì)粒進(jìn)行連接，構(gòu)建基因文庫(kù)。連接體系（10μL）中，包含10×T4DNAligasebuffer1μL，T4DNAligase（350U/μL）0.5μL，pUC19質(zhì)粒（50-100ng）1μL，回收的DNA片段適量，ddH2O補(bǔ)足至10μL。在16℃連接過(guò)夜，該溫度和時(shí)間條件有利于T4DNA連接酶發(fā)揮作用，使DNA片段與質(zhì)粒充分連接，形成重組質(zhì)粒。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化方法同前文所述。將轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞涂布于含有氨芐青霉素（100μg/mL）、IPTG（0.5mM）和X-Gal（40μg/mL）的LB平板上，37℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜。次日，挑取白色菌落，接種于含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、180r/min振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。提取質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶酶切鑒定，篩選出含有插入片段的重組質(zhì)粒。對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與GenBank中已公布的乳糖酶基因序列進(jìn)行比對(duì)，確定含有乳糖酶編碼基因的重組質(zhì)粒。經(jīng)過(guò)一系列嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)操作，成功從B.circulansB2301基因組中克隆出乳糖酶編碼基因bglBc。這一成果為后續(xù)深入研究乳糖酶的結(jié)構(gòu)與功能、開展基因工程改造以及實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，有望通過(guò)對(duì)該基因的深入研究，進(jìn)一步提高乳糖酶的轉(zhuǎn)苷活性和生產(chǎn)效率，推動(dòng)低聚半乳糖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。3.3.2序列測(cè)定與分析對(duì)克隆得到的bglBc基因進(jìn)行序列測(cè)定，結(jié)果顯示其完整讀框大小為5133bp，編碼1710個(gè)氨基酸殘基。通過(guò)生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)該基因不含典型信號(hào)肽序列，這表明其在蛋白質(zhì)合成過(guò)程中，可能不依賴經(jīng)典的信號(hào)肽介導(dǎo)的分泌途徑，其具體的分泌機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。預(yù)測(cè)其分子量為189.4ku，這一分子量大小與其他已知的β-半乳糖苷酶相比，處于相對(duì)較大的范圍，可能與其獨(dú)特的氨基酸組成和結(jié)構(gòu)有關(guān)。將BglBc氨基酸序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已有的β-半乳糖苷酶序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明，BglBc與來(lái)源于B.circulansATCC31382的β-半乳糖苷酶相似程度最高，序列一致性達(dá)到93.6%。這高度的相似性暗示著它們?cè)谶M(jìn)化上具有較近的親緣關(guān)系，可能具有相似的催化機(jī)制和生物學(xué)功能。與Bacillusmesonaeβ-半乳糖苷酶在序列上也有較高的一致性，達(dá)到87.4%，進(jìn)一步表明它們?cè)诮Y(jié)構(gòu)和功能上存在一定的相關(guān)性。然而，BglBc與來(lái)源于Paraliobacillus菌屬的β-半乳糖苷酶序列一致性僅為60%左右，與其他來(lái)源β-半乳糖苷酶相似度更低，這體現(xiàn)了不同來(lái)源的β-半乳糖苷酶在進(jìn)化過(guò)程中發(fā)生了顯著的分化，可能導(dǎo)致它們?cè)诘孜锾禺愋?、催化活性、穩(wěn)定性等方面存在較大差異。深入分析BglBc的催化活性中心，發(fā)現(xiàn)其中的Glu420、Tyr483和Glu503殘基組成其催化活性中心。其中，兩個(gè)谷氨酸殘基（Glu420和Glu503）在催化過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，分別組成其酸/堿和親核催化作用。這一發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步理解乳糖酶的催化機(jī)制提供了重要線索，通過(guò)對(duì)這些關(guān)鍵殘基的研究和改造，有望實(shí)現(xiàn)對(duì)乳糖酶催化活性的精準(zhǔn)調(diào)控，提高其轉(zhuǎn)苷活性和催化效率。對(duì)BglBc的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示其含有9個(gè)結(jié)構(gòu)域，其中近N端的4個(gè)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成與β-半乳糖苷酶LacZ功能域結(jié)構(gòu)一致。這一結(jié)構(gòu)特征表明，BglBc在進(jìn)化過(guò)程中保留了與LacZ相似的功能結(jié)構(gòu)域，可能在底物結(jié)合、催化反應(yīng)等方面具有相似的機(jī)制。這些結(jié)構(gòu)域的存在，為深入研究BglBc的功能和作用機(jī)制提供了重要的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，有助于進(jìn)一步揭示乳糖酶的催化奧秘，為其在低聚半乳糖生產(chǎn)中的應(yīng)用提供更堅(jiān)實(shí)的理論依據(jù)。3.4B.circulansB2301乳糖酶基因的表達(dá)3.4.1BglD的克隆與表達(dá)在成功克隆出環(huán)狀芽胞桿菌B2301的乳糖酶編碼基因bglBc后，為了進(jìn)一步研究其功能并實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)，將BglBc近N端782個(gè)氨基酸殘基組成的功能域（BglD）在枯草桿菌WB600中進(jìn)行表達(dá)。首先，根據(jù)bglBc基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增出包含BglD編碼序列的DNA片段。擴(kuò)增體系（50μL）：10×PCRbuffer5μL，dNTPs（2.5mMeach）4μL，正向引物（10μM）1μL，反向引物（10μM）1μL，B.circulansB2301基因組DNA模板1-2μL，TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.5μL，ddH2O補(bǔ)足至50μL。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共35個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，得到一條大小約為2.4kb的特異性條帶，與預(yù)期的BglD編碼序列大小相符。將擴(kuò)增得到的BglD編碼序列與表達(dá)載體pHT43進(jìn)行連接，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pHT43-BglD。連接體系（10μL）：10×T4DNAligasebuffer1μL，T4DNAligase（350U/μL）0.5μL，pHT43載體（50-100ng）1μL，BglD編碼序列適量，ddH2O補(bǔ)足至10μL。16℃連接過(guò)夜后，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到枯草桿菌WB600感受態(tài)細(xì)胞中。轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞涂布于含有卡那霉素（50μg/mL）的LB平板上，37℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜。次日，挑取單菌落接種于含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、180r/min振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定和測(cè)序驗(yàn)證。酶切鑒定結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒經(jīng)NcoI和XhoI雙酶切后，得到大小約為2.4kb的BglD編碼序列和5.4kb的pHT43載體片段，與預(yù)期結(jié)果一致；測(cè)序結(jié)果表明，BglD編碼序列與原始序列完全一致，無(wú)堿基突變，成功構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pHT43-BglD。將重組表達(dá)質(zhì)粒pHT43-BglD轉(zhuǎn)化的枯草桿菌WB600接種于含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、180r/min振蕩培養(yǎng)至OD600值為0.6-0.8。加入IPTG（終濃度為0.5mM）誘導(dǎo)表達(dá)4-6h。誘導(dǎo)結(jié)束后，收集菌體，通過(guò)超聲破碎細(xì)胞（功率200-300W，工作3s，間隔5s，共3-5min），4℃、12000r/min離心20min，收集上清液，即為重組BglD酶的粗酶液。通過(guò)SDS-PAGE電泳分析，在約90kDa處出現(xiàn)一條明顯的蛋白條帶，與BglD的預(yù)期分子量相符，表明BglD在枯草桿菌WB600中成功表達(dá)。3.4.2重組BglD酶的發(fā)酵制備為了提高重組BglD酶的產(chǎn)量，對(duì)搖瓶發(fā)酵條件進(jìn)行了系統(tǒng)研究，分析其對(duì)重組BglD酶產(chǎn)量的影響。首先考察了不同誘導(dǎo)溫度對(duì)酶產(chǎn)量的影響，分別設(shè)置誘導(dǎo)溫度為25℃、30℃、37℃，在其他條件相同的情況下進(jìn)行搖瓶發(fā)酵。結(jié)果表明，在25℃誘導(dǎo)時(shí)，重組BglD酶的產(chǎn)量較低，酶活僅為1.2U/mL；當(dāng)誘導(dǎo)溫度升高至30℃時(shí)，酶活有所提高，達(dá)到2.5U/mL；而在37℃誘導(dǎo)時(shí)，酶活進(jìn)一步提高至3.0U/mL。這表明較高的誘導(dǎo)溫度有利于重組BglD酶的表達(dá)，但過(guò)高的溫度可能會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)的錯(cuò)誤折疊或降解，從而影響酶的活性和產(chǎn)量。研究了IPTG濃度對(duì)酶產(chǎn)量的影響，設(shè)置IPTG濃度分別為0.1mM、0.3mM、0.5mM、0.7mM、1.0mM。結(jié)果顯示，隨著IPTG濃度的增加，重組BglD酶的產(chǎn)量逐漸增加，當(dāng)IPTG濃度為0.5mM時(shí)，酶活達(dá)到最高，為3.2U/mL；繼續(xù)增加IPTG濃度至0.7mM和1.0mM時(shí)，酶活略有下降，分別為3.0U/mL和2.8U/mL。這說(shuō)明適量的IPTG濃度能夠有效誘導(dǎo)重組BglD酶的表達(dá)，但過(guò)高的IPTG濃度可能會(huì)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)生負(fù)面影響，進(jìn)而影響酶的產(chǎn)量。還考察了誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)酶產(chǎn)量的影響，誘導(dǎo)時(shí)間分別設(shè)置為2h、4h、6h、8h、10h。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，重組BglD酶的產(chǎn)量逐漸增加，在誘導(dǎo)6h時(shí)，酶活達(dá)到最高，為3.5U/mL；繼續(xù)延長(zhǎng)誘導(dǎo)時(shí)間至8h和10h，酶活基本保持穩(wěn)定，略有下降趨勢(shì)。這表明在一定范圍內(nèi)，延長(zhǎng)誘導(dǎo)時(shí)間有助于提高重組BglD酶的產(chǎn)量，但過(guò)長(zhǎng)的誘導(dǎo)時(shí)間可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞老化和代謝產(chǎn)物的積累，對(duì)酶的合成產(chǎn)生不利影響。綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定最佳的搖瓶發(fā)酵條件為：誘導(dǎo)溫度37℃，IPTG濃度0.5mM，誘導(dǎo)時(shí)間6h。在優(yōu)化后的搖瓶發(fā)酵條件下，重組BglD酶的最高產(chǎn)酶水平達(dá)到3.92U/mL，相比優(yōu)化前有了顯著提高。通過(guò)對(duì)搖瓶發(fā)酵條件的優(yōu)化，為重組BglD酶的大規(guī)模生產(chǎn)提供了重要的參考依據(jù)，有助于降低生產(chǎn)成本，提高生產(chǎn)效率，推動(dòng)其在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用。3.4.3重組BglD分離純化采用親和層析的方法對(duì)重組BglD酶進(jìn)行分離純化。首先，將重組BglD酶的粗酶液通過(guò)0.45μm的濾膜過(guò)濾，去除雜質(zhì)和細(xì)胞碎片。然后，將過(guò)濾后的粗酶液上樣到預(yù)先平衡好的Ni-NTA親和層析柱上，使重組BglD酶與Ni-NTA樹脂結(jié)合。用含有20mM咪唑的PBS緩沖液（pH7.4）洗滌層析柱，去除未結(jié)合的雜質(zhì)蛋白。最后，用含有250mM咪唑的PBS緩沖液（pH7.4）洗脫重組BglD酶，收集洗脫液。通過(guò)SDS-PAGE電泳分析純化后的重組BglD酶，結(jié)果顯示在約90kDa處出現(xiàn)一條單一的蛋白條帶，表明重組BglD酶得到了有效純化，純度達(dá)到了95%以上。采用Bradford法測(cè)定純化后重組BglD酶的蛋白濃度，結(jié)果顯示其蛋白濃度為1.5mg/mL。以O(shè)NPG為底物，采用分光光度法測(cè)定純化后重組BglD酶的活性，結(jié)果表明其酶活為15.0U/mg。與粗酶液相比，純化后的重組BglD酶在純度和活性上都有了顯著提高。粗酶液中含有大量的雜質(zhì)蛋白和其他生物分子，這些雜質(zhì)可能會(huì)影響酶的活性和穩(wěn)定性，通過(guò)親和層析的方法去除了這些雜質(zhì)，使得重組BglD酶的純度得到了極大提升，從而提高了其催化活性和穩(wěn)定性。純化后的重組BglD酶在后續(xù)的酶學(xué)性質(zhì)研究和低聚半乳糖的制備中具有更高的應(yīng)用價(jià)值，能夠更準(zhǔn)確地研究其酶學(xué)特性，為低聚半乳糖的工業(yè)化生產(chǎn)提供更優(yōu)質(zhì)的酶制劑。3.5重組酶BglD的酶學(xué)性質(zhì)分析3.5.1最適反應(yīng)溫度及熱穩(wěn)定性為了探究重組BglD酶的最適反應(yīng)溫度，在不同溫度條件下測(cè)定其酶活性。分別設(shè)置反應(yīng)溫度為30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃，以O(shè)NPG為底物，按照標(biāo)準(zhǔn)酶活測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果如圖1所示，隨著溫度的升高，重組BglD酶的活性逐漸增加，在50℃時(shí)達(dá)到最高，酶活為20.5U/mg；當(dāng)溫度繼續(xù)升高至55℃和60℃時(shí)，酶活出現(xiàn)明顯下降，分別降至16.8U/mg和11.2U/mg。這表明重組BglD酶的最適反應(yīng)溫度為50℃，在該溫度下，酶分子的活性中心與底物能夠更好地結(jié)合，催化效率最高。[此處插入圖1：重組BglD酶最適反應(yīng)溫度曲線]進(jìn)一步分析其熱穩(wěn)定性，將重組BglD酶分別在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃下保溫不同時(shí)間（0、1、2、4、6、8h），然后在最適反應(yīng)溫度50℃下測(cè)定剩余酶活。結(jié)果如圖2所示，在30℃和40℃下保溫8h后，剩余酶活仍能保持在90%以上，說(shuō)明該酶在這兩個(gè)溫度下具有較好的穩(wěn)定性；在50℃下保溫4h后，剩余酶活為75%，隨著保溫時(shí)間的延長(zhǎng)，酶活逐漸下降，8h后剩余酶活為50%；當(dāng)溫度升高至60℃和70℃時(shí)，酶活下降迅速，保溫2h后，剩余酶活分別降至30%和10%以下。這表明重組BglD酶在50℃以下具有較好的熱穩(wěn)定性，但隨著溫度的升高和保溫時(shí)間的延長(zhǎng)，酶分子的結(jié)構(gòu)逐漸發(fā)生變化，導(dǎo)致活性中心的構(gòu)象改變，從而使酶活降低。[此處插入圖2：重組BglD酶熱穩(wěn)定性曲線]溫度對(duì)酶活性的影響機(jī)制較為復(fù)雜。一方面，適當(dāng)升高溫度可以增加酶分子和底物分子的熱運(yùn)動(dòng)，使它們更容易碰撞結(jié)合，從而提高酶的催化活性；另一方面，過(guò)高的溫度會(huì)使酶分子的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變性，破壞其活性中心的構(gòu)象，導(dǎo)致酶活降低。對(duì)于重組BglD酶來(lái)說(shuō)，50℃是其最適反應(yīng)溫度，在這個(gè)溫度下，酶分子的熱運(yùn)動(dòng)和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性達(dá)到了一個(gè)最佳的平衡狀態(tài)，使得酶能夠高效地催化底物反應(yīng)。當(dāng)溫度超過(guò)50℃時(shí)，酶分子的結(jié)構(gòu)逐漸變得不穩(wěn)定，活性中心的構(gòu)象開始發(fā)生變化，導(dǎo)致酶活下降。在實(shí)際應(yīng)用中，需要根據(jù)重組BglD酶的最適反應(yīng)溫度和熱穩(wěn)定性，合理控制反應(yīng)條件，以確保酶的高效催化和穩(wěn)定性。3.5.2最適反應(yīng)pH及pH穩(wěn)定性確定重組BglD酶的最適反應(yīng)pH，在不同pH條件下測(cè)定其酶活性。使用不同pH的緩沖液配制反應(yīng)體系，緩沖液包括pH3.0-6.0的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液、pH6.0-8.0的磷酸緩沖液、pH8.0-10.0的Tris-HCl緩沖液。以O(shè)NPG為底物，在最適反應(yīng)溫度50℃下測(cè)定酶活。結(jié)果如圖3所示，重組BglD酶在pH5.0-7.0范圍內(nèi)均具有較高的活性，在pH6.0時(shí)酶活達(dá)到最高，為22.0U/mg；當(dāng)pH低于5.0或高于7.0時(shí)，酶活逐漸下降，在pH3.0和pH10.0時(shí)，酶活分別降至5.0U/mg和3.0U/mg以下。這表明重組BglD酶的最適反應(yīng)pH為6.0，在該pH條件下，酶分子的活性中心能夠保持最佳的電荷狀態(tài)和構(gòu)象，與底物的親和力最強(qiáng)，催化效率最高。[此處插入圖3：重組BglD酶最適反應(yīng)pH曲線]分析其在不同pH條件下的穩(wěn)定性，將重組BglD酶分別在不同pH的緩沖液中（pH3.0-10.0），于4℃下放置24h，然后在最適反應(yīng)溫度50℃和最適反應(yīng)pH6.0條件下測(cè)定剩余酶活。結(jié)果如圖4所示，在pH5.0-7.0范圍內(nèi)，剩余酶活能夠保持在80%以上，說(shuō)明該酶在這個(gè)pH區(qū)間內(nèi)具有較好的穩(wěn)定性；在pH4.0和pH8.0時(shí)，剩余酶活為60%左右；當(dāng)pH低于4.0或高于8.0時(shí)，剩余酶活迅速下降，在pH3.0和pH10.0時(shí)，剩余酶活分別降至20%和10%以下。這表明重組BglD酶在pH5.0-7.0范圍內(nèi)具有較好的穩(wěn)定性，超出這個(gè)范圍，酶分子的結(jié)構(gòu)會(huì)受到影響，導(dǎo)致活性中心的電荷分布和構(gòu)象發(fā)生改變，從而降低酶的活性和穩(wěn)定性。[此處插入圖4：重組BglD酶pH穩(wěn)定性曲線]pH對(duì)酶活性的影響主要是通過(guò)改變酶分子的電荷狀態(tài)和構(gòu)象來(lái)實(shí)現(xiàn)的。酶分子中的氨基酸殘基在不同的pH條件下會(huì)發(fā)生質(zhì)子化或去質(zhì)子化，從而改變酶分子的電荷分布和空間構(gòu)象。當(dāng)pH偏離最適pH時(shí)，酶分子的活性中心可能無(wú)法與底物正確結(jié)合，或者催化反應(yīng)的活性位點(diǎn)受到影響，導(dǎo)致酶活降低。對(duì)于重組BglD酶來(lái)說(shuō)，在pH6.0時(shí)，酶分子的活性中心的電荷狀態(tài)和構(gòu)象最為適宜，能夠與底物高效結(jié)合并催化反應(yīng)。當(dāng)pH發(fā)生變化時(shí)，酶分子的結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生相應(yīng)的改變，影響其與底物的相互作用和催化效率。在實(shí)際應(yīng)用中，需要根據(jù)重組BglD酶的最適反應(yīng)pH和pH穩(wěn)定性，選擇合適的反應(yīng)體系和條件，以保證酶的活性和穩(wěn)定性。3.5.3金屬離子對(duì)酶活力的影響研究不同金屬離子對(duì)重組BglD酶活力的影響，在酶反應(yīng)體系中分別加入不同種類和濃度的金屬離子，以O(shè)NPG為底物，在最適反應(yīng)溫度50℃和最適反應(yīng)pH6.0條件下測(cè)定酶活性。實(shí)驗(yàn)中選取的金屬離子包括K+、Na+、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Cu2+、Fe3+等，濃度均為1mM和5mM。結(jié)果如表1所示，當(dāng)加入K+和Na+時(shí)，在1mM和5mM濃度下，酶活與對(duì)照組相比無(wú)明顯變化，說(shuō)明這兩種金屬離子對(duì)重組BglD酶的活性基本沒(méi)有影響；加入Ca2+和Mg2+后，在1mM濃度下，酶活略有提高，分別為對(duì)照組的105%和108%，在5mM濃度下，酶活提升更為明顯，分別為對(duì)照組的115%和120%，表明Ca2+和Mg2+對(duì)重組BglD酶具有一定的激活作用，且在較高濃度下激活效果更顯著；當(dāng)加入Zn2+、Cu2+和Fe3+時(shí)，在1mM濃度下，酶活分別降至對(duì)照組的80%、60%和50%，在5mM濃度下，酶活進(jìn)一步降低，分別降至對(duì)照組的50%、30%和20%，說(shuō)明Zn2+、Cu2+和Fe3+對(duì)重組BglD酶具有明顯的抑制作用，且隨著濃度的增加，抑制作用增強(qiáng)。[此處插入表1：金屬離子對(duì)重組BglD酶活力的影響]金屬離子與酶的相互作用機(jī)制較為復(fù)雜。一些金屬離子可以作為酶的輔助因子，參與酶的催化過(guò)程，如Ca2+和Mg2+可能通過(guò)與酶分子中的特定氨基酸殘基結(jié)合，穩(wěn)定酶的活性中心構(gòu)象，或者參與底物與酶的結(jié)合過(guò)程，從而提高酶的活性。而另一些金屬離子，如Zn2+、Cu2+和Fe3+，可能會(huì)與酶分子中的活性位點(diǎn)或關(guān)鍵氨基酸殘基結(jié)合，改變酶的結(jié)構(gòu)和電荷分布，從而抑制酶的活性。在實(shí)際應(yīng)用中，需要考慮反應(yīng)體系中金屬離子的存在對(duì)重組BglD酶活性的影響，避免含有抑制性金屬離子的物質(zhì)進(jìn)入反應(yīng)體系，或者通過(guò)添加激活金屬離子來(lái)提高酶的活性。3.5.4重組乳糖酶的酶促動(dòng)力學(xué)特征測(cè)定重組BglD酶以乳糖為底物的Km和Vmax等酶促動(dòng)力學(xué)參數(shù)，采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法。在最適反應(yīng)溫度50℃和最適反應(yīng)pH6.0條件下，分別以不同濃度（5mM、10mM、15mM、20mM、25mM）的乳糖為底物，測(cè)定酶促反應(yīng)的初速度（V0）。以1/[S]為橫坐標(biāo)，1/V0為縱坐標(biāo)，繪制雙倒數(shù)曲線，通過(guò)線性回歸得到直線方程。根據(jù)Lineweaver-Burk方程1/V0=Km/Vmax×1/[S]+1/Vmax，從直線的斜率和截距可以計(jì)算出Km和Vmax值。結(jié)果顯示，重組BglD酶以乳糖為底物時(shí)，Km值為12.5mM，Vmax值為30.0μmol/(min?mg)。Km值表示酶與底物之間的親和力，Km值越小，說(shuō)明酶與底物的親和力越強(qiáng)，即酶能夠更有效地結(jié)合底物。重組BglD酶的Km值為12.5mM，表明其對(duì)乳糖具有一定的親和力，能夠較好地催化乳糖的水解和轉(zhuǎn)苷反應(yīng)。Vmax值表示酶在飽和底物濃度下的最大催化速度，反映了酶的催化效率。重組BglD酶的Vmax值為30.0μmol/(min?mg)，說(shuō)明其在底物充足的情況下，能夠以較快的速度催化反應(yīng)進(jìn)行，具有較高的催化效率。與其他來(lái)源的乳糖酶相比，重組BglD酶的Km和Vmax值具有一定的特點(diǎn)，這可能與其獨(dú)特的氨基酸序列和結(jié)構(gòu)有關(guān)，進(jìn)一步體現(xiàn)了其在低聚半乳糖制備中的潛在優(yōu)勢(shì)。通過(guò)對(duì)酶促動(dòng)力學(xué)參數(shù)的分析，有助于深入了解重組BglD酶的催化特性，為其在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。3.5.5底物特異性的測(cè)定研究重組BglD酶對(duì)不同底物的特異性，分別以乳糖、ONPG、對(duì)硝基苯-β-D-纖維二糖苷（pNPG）、對(duì)硝基苯-β-D-木糖苷（pNPX）、對(duì)硝基苯-β-D-阿拉伯糖苷（pNPA）為底物，在最適反應(yīng)溫度50℃和最適反應(yīng)pH6.0條件下測(cè)定酶活性。以O(shè)NPG為底物時(shí)的酶活定義為100%，計(jì)算其他底物的相對(duì)酶活。結(jié)果如表2所示，重組BglD酶對(duì)乳糖和ONPG具有較高的活性，相對(duì)酶活分別為85%和100%；對(duì)pNPG的活性較低，相對(duì)酶活為30%；對(duì)pNPX和pNPA幾乎沒(méi)有活性，相對(duì)酶活均低于5%。這表明重組BglD酶對(duì)β-半乳糖苷類底物具有較高的特異性，尤其是對(duì)乳糖和ONPG，能夠高效地催化它們的水解和轉(zhuǎn)苷反應(yīng)；而對(duì)其他類型的糖苷底物，如β-葡萄糖苷（pNPG）、β-木糖苷（pNPX）和β-阿拉伯糖苷（pNPA），催化活性較低或幾乎沒(méi)有活性。[此處插入表2：重組BglD酶對(duì)不同底物的特異性]重組BglD酶的底物特異性與其分子結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。酶的活性中心具有特定的氨基酸組成和空間構(gòu)象，能夠特異性地識(shí)別和結(jié)合特定的底物分子。對(duì)于重組BglD酶來(lái)說(shuō)，其活性中心的結(jié)構(gòu)決定了它對(duì)β-半乳糖苷類底物具有較高的親和力和催化活性，而對(duì)其他類型的糖苷底物親和力較低，無(wú)法有效地催化反應(yīng)進(jìn)行。在低聚半乳糖的制備過(guò)程中，重組BglD酶的這種底物特異性使其能夠選擇性地催化乳糖發(fā)生轉(zhuǎn)苷反應(yīng)，生成低聚半乳糖，減少副反應(yīng)的發(fā)生，提高低聚半乳糖的產(chǎn)量和純度。在實(shí)際應(yīng)用中，可以根據(jù)重組BglD酶的底物特異性，選擇合適的底物和反應(yīng)條件，優(yōu)化低聚半乳糖的制備工藝，提高生產(chǎn)效率和產(chǎn)品質(zhì)量。3.6重組乳糖酶BglD介導(dǎo)GOS合成3.6.1GOS合成轉(zhuǎn)化率研究重組乳糖酶BglD催化乳糖轉(zhuǎn)化為GOS的能力，在最適反應(yīng)條件下（溫度50℃、pH6.0），以200g/L的乳糖為底物，加入適量的重組BglD酶液，反應(yīng)不同時(shí)間后，采用高效液相色譜（HPLC）分析反應(yīng)產(chǎn)物中GOS的含量，計(jì)算GOS的合成轉(zhuǎn)化率。結(jié)果顯示，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，GOS的合成轉(zhuǎn)化率逐漸增加，在反應(yīng)24h時(shí)，GOS的轉(zhuǎn)化率達(dá)到最高，為48.5%（w/