（高清版）DB62∕T 4758-2023 真菌性玉米頂腐病鑒定技術(shù)規(guī)程

真菌性玉米頂腐病鑒定技術(shù)規(guī)程2023-09-25實施2023-09-25實施 1范圍 12規(guī)范性引用文件 13術(shù)語和定義 14原理 15試劑與材料 26儀器及用具 27取樣方法 38田間癥狀表現(xiàn)型 3 410結(jié)果判定 511樣品保存與處理 5 6附錄B(規(guī)范性)玉米頂腐病菌菌體形態(tài)特征 7I本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件由甘肅省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出并監(jiān)督實施。本文件由甘肅省糧食油料作物栽培標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會歸口。本文件起草單位：河西學(xué)院、甘肅前進(jìn)生物科技發(fā)展有限公司、甘肅省農(nóng)業(yè)信息中心、泉州師范學(xué)院、德農(nóng)種業(yè)股份公司、高臺縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心、臨澤縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心、張掖國家級玉米種子生產(chǎn)基地種子質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心、張掖市建國作物種質(zhì)創(chuàng)新育種工作室、酒泉市通盈種苗有限公司。本文件主要起草人：雷玉明、馬金、趙婧、雷鑫、鄭天翔、楊國振、王偉、濮超、吳堯、劉曉剛、張琪、公曉佳、孫志、馬麗娟、李自峰、李濤、石建國。本文件由河西學(xué)院負(fù)責(zé)解釋。本文件規(guī)定了真菌性玉米頂腐病檢驗取樣方法、田間癥狀識別、實驗室檢驗、結(jié)果判斷及樣品保存與處理的技術(shù)要求。本文件適用于玉米種子繁育田、雜交種真菌性頂腐病的鑒定。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB1886.239食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑瓊脂GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法HG/T3462化學(xué)試劑蔗糖3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。玉米頂腐病一種由亞粘團(tuán)鐮孢霉引起的玉米葉部、莖部的真菌性病害。亞粘團(tuán)鐮孢霉真菌、絲孢綱、叢梗孢目、瘤座孢科、鐮孢霉屬的一種真菌。菌落篩選需要從分離培養(yǎng)基培養(yǎng)生長出的大量菌落中，根據(jù)菌落形狀、顏色、大小、菌絲形態(tài)等的各種特征，從中挑選出具有明顯表型特征的目標(biāo)菌落的過程。轉(zhuǎn)接在無菌條件下，將目標(biāo)菌落轉(zhuǎn)移到適宜其生長的人工合成培養(yǎng)基而形成單一菌株的過程。4原理玉米頂腐病是一種土壤、種子傳播的真菌性病害，以亞粘團(tuán)鐮孢霉在土壤、病殘體、種子中越冬。以玉米幼苗、葉片、葉鞘、莖稈、果穗的田間癥狀表現(xiàn)型為初步診斷依據(jù)，結(jié)合室內(nèi)種子、土壤、病組織的病原菌分離培養(yǎng)特性與顯微鏡的形態(tài)特征，綜合評價，判定真菌性玉米頂腐病。125.10.1%升汞(HgCl?)稱取升汞1.0g,用75%酒精5mL溶解，再加蒸餾水995mL稀釋，加入1%酸性品紅溶液0.1mL,配制5.2乳酚油(C?H??O?)將苯酚結(jié)晶加熱熔化后取20mL加入20mL乳酸中攪拌均勻，再先后加入20%甘油40mL和蒸餾水稱取0.1g醫(yī)用硫酸鏈霉素粉劑，用70%酒精5mL溶解，無菌水5.7試驗用水6.1.2高壓滅菌鍋：容積50L,電源220V/50hz,最高工作/設(shè)計溫度135℃/138℃,最高工作/設(shè)計壓力0.22Mpa/0.25Mpa,滅菌定時4min～120min,干燥定時30min～240min;6.1.3超凈工作臺：潔凈等級100級，噪聲≤58db,平均面風(fēng)速0.3m/s～0.6m/s,電源220V/50hz,光6.1.4培養(yǎng)箱：控溫范圍0℃~50℃,溫度分辨0.1℃,溫度均勻性≤±1℃;6.1.5生物顯微鏡；雙目鏡10x/20x,≥5孔物鏡轉(zhuǎn)換器，物鏡4x/10x/40x/100x;6.1.6低溫冰箱：控溫范圍-10℃~-40℃,控溫精度±1℃;6.1.7單道移液器：分液范圍2mL～10mL、100μL～1000μL。選擇具有玉米頂腐病典型癥狀或疑似癥狀的植株，在植株根部周圍0.2m2~0.3m2范圍內(nèi)取5cm深的選擇玉米頂腐病普發(fā)田，對角線5點取樣，每點在2m2范圍內(nèi)取5cm深的表土1000g,將各點土樣混34本法適用于玉米種子表面病原菌檢驗。在超凈工作臺上，將待檢玉米樣品的種子先用蒸餾水沖洗2璃培養(yǎng)皿內(nèi)，每皿放入5～10粒，重復(fù)5次，每個樣品測定種子50粒。培養(yǎng)皿放在25℃±1℃恒溫箱黑暗將待檢葉片、葉鞘材料，剪取大小為(0.1cm～0.2cm)×(0.1cm～0.2cm)病健交界處組織。待檢在超凈工作臺上，將植株組織樣品分別在70%酒精中浸15s～20s,移入0.1%升汞液中消毒30s,用無菌水沖洗3次后，消毒組織置于PSA平板培養(yǎng)基上，每個平板放置5～10在超凈工作臺上，將土壤樣品在PSA平板培養(yǎng)基表面培養(yǎng)出符合第8章中規(guī)定的任何一種田間癥狀表現(xiàn)型，且顯微鏡檢病原形態(tài)特征符合附錄B描述的亞粘團(tuán)完成檢驗后，分離物制成斜面試驗菌種保存于-20℃低溫冰箱，植物組織樣品和病原菌分別制成浸漬標(biāo)本、玻片標(biāo)本室溫保存。使用的材料和用具，在使用完畢56(規(guī)范性)A.1配方A.2制作方法A.2.1配制分別稱取200g馬鈴薯方塊、蔗糖15g、瓊脂18g。將200g馬鈴薯方塊放入2000mL燒杯中，加入水1000mL煮沸20min～25min,用4層紗布過濾，濾液用水補(bǔ)足1000mL,加入蔗糖15g、瓊脂18g,加熱使分裝培養(yǎng)基溶液150mL,錐形三角瓶口加棉花塞或耐高溫組培封口膜，將入高壓滅菌鍋中，在115℃~120℃條件下高壓滅菌30min。當(dāng)滅菌培養(yǎng)基冷卻至45℃~50℃時，在無菌條件下，用單道移液器取10mg/mL硫酸鏈霉素溶液450uL加入150mL培養(yǎng)基中，搖均后倒入無菌Φ90mm或Φ120mm培養(yǎng)皿和裝入無菌18mm×(規(guī)范性)玉米頂腐病菌菌體形態(tài)特征B.1PSA培養(yǎng)基菌落特征B.1.1菌落形態(tài)氣生菌絲絨毛狀至粉末狀。B.1.2菌落顏色菌落2d～3d為粉白，4d～5d漸變?yōu)榈仙?，中部淡紫色，背面菌落淡黃色，邊緣略呈淡紫色。B.2產(chǎn)孢方式產(chǎn)孢細(xì)胞內(nèi)壁芽生，單、復(fù)瓶梗式產(chǎn)孢，以單瓶梗居多。B.3小型分生孢子特征B.3.1形狀特征小型分生孢子長橢圓形或擬紡錘形，較小，呈假頭狀不呈串珠狀著生。B.3.2大小B.4大型分生孢子特征B.4.1形狀特征鐮刀形，較直而細(xì)長，腳胞足跟不十分明顯，頂端漸尖。B.4.2大小B.5生物學(xué)特性B.5.1溫