DB36-T1654-2022-飲用菊花脫毒原種苗繁育技術(shù)規(guī)程-江西省

ICS65.020.20DB36CCSB35江西省地方標(biāo)準(zhǔn)DB36/T1654—2022飲用菊花脫毒原種苗繁育技術(shù)規(guī)程Technicalregulationsofbreedingofchrysanthemumvirus-freeseedseedlings江西省市場監(jiān)督管理局發(fā)布DB36/T1654—2022目次前言................................................................................II1范圍..............................................................................12規(guī)范性引用文件....................................................................13術(shù)語和定義........................................................................14基本要求..........................................................................25網(wǎng)室建造與隔離....................................................................26原原種繁殖........................................................................27原原種鑒定........................................................................38原種網(wǎng)室繁殖......................................................................39質(zhì)量檢測..........................................................................4附錄A（規(guī)范性）RNA病毒的反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）檢測方法......................5IDB36/T1654—2022前言本文件按照GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及本專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。本文件由江西省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出并歸口。本文件起草單位：江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所。本文件主要起草人：湯泳萍、葉艷英、胡文亭、張冰冰、周勁松、尹玉玲、程正新、謝啟鑫、羅紹春。IIDB36/T1654—2022飲用菊花脫毒原種苗繁育技術(shù)規(guī)程1范圍本文件規(guī)定了飲用菊花（Chrysanthemummorifolium(Ramat.)TzveL.）脫毒原種苗的范圍、規(guī)范性引用文件、術(shù)語和定義、基本要求、網(wǎng)室建造與隔離、原原種繁殖、原原種鑒定、原種網(wǎng)室繁殖、質(zhì)量檢測等要求。本文件適用于飲用菊花脫毒原種苗的生產(chǎn)。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T8321（所有部分）農(nóng)藥合理使用準(zhǔn)則GB/T51057種植塑料大棚工程技術(shù)規(guī)范GB/T51183農(nóng)業(yè)溫室結(jié)構(gòu)荷載規(guī)范NY/T391綠色食品產(chǎn)地環(huán)境質(zhì)量NY/T1224農(nóng)用塑料薄膜安全使用控制技術(shù)規(guī)范NY/T1591菊花切花種苗等級規(guī)格NY/T1657花卉脫毒種苗生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程香石竹、菊花、蘭花、補血草、滿天星3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1飲用菊花DrinkableChrysanthemum用于泡飲的多年生草本植物菊的頭狀花序。3.2脫毒種苗（virus-freeseedlings）經(jīng)RT-PCR檢測方法鑒定，確認脫除了菊花B病毒（CVB）、番茄不孕病毒（TAV）、黃瓜花葉病毒（CMV）等的脫毒核心材料（或脫毒苗）在隔離條件下生產(chǎn)的原原種、原種。1DB36/T1654—2022育種家選育的性狀穩(wěn)定純正的用于繁殖原種的材料或種苗。3.4原種（foundationseed）由原原種繁殖的用于繁育生產(chǎn)用種的材料或種苗。4基本要求4.1產(chǎn)地環(huán)境產(chǎn)地環(huán)境符合NY/T391的規(guī)定。4.2場地要求選擇排灌方便，地下水位較低，土層深厚、肥沃、疏松，3年內(nèi)未種過茄科作物、5年內(nèi)未種過菊科植物的中性或微酸性土壤地塊，且周圍800m范圍內(nèi)無其它菊科和茄科植物種植。4.3化學(xué)農(nóng)藥使用應(yīng)符合GB/T8321（所有部分）的要求。4.4肥料要求應(yīng)符合NY/T496和NY/T525的要求。5網(wǎng)室建造與隔離大棚所有通風(fēng)處安裝60目防蟲網(wǎng)。大棚搭建應(yīng)符合GB/T51057和GB/T51183要求，大棚覆蓋薄膜應(yīng)符合NY/T1224要求。大棚入口處宜配套緩沖間，田間操作人員進入防蟲大棚溫室、網(wǎng)室應(yīng)更換工作衣和鞋具。6原原種繁殖選具有繁育品種典型性狀、生長健壯的植株，至光照培養(yǎng)箱中采用變溫升溫的方式進行熱處理，在日溫/夜溫分別為26℃/20℃下培養(yǎng)2d，每2d晝/夜溫度分別升高2℃、直至38℃/30℃下培養(yǎng)40d，取高溫培養(yǎng)長出的莖段，剪去葉片，留取心葉或腋芽，放在燒杯中，用肥皂水沖洗干凈，再用自來水沖洗1h。濾干，移入無菌操作臺，用20%的次氯酸鈉滅菌8min～10min，取出后用無菌水沖洗3～5次待用。將制備好的MS+6-BA0.1mg/L培養(yǎng)基溶液分裝于培養(yǎng)瓶，每瓶30ml，瓶口蓋緊瓶蓋。在121℃，1.1MPa條件下滅菌20min，冷卻后放入無菌操作臺待用。在無菌條件下，在解剖鏡下剝?nèi)∫褱缇牧系纳L點0.3mm～0.5mm，接種到已滅菌的培養(yǎng)基上，置于26℃，光強2000lx～3000lx，光照時間16h/d條件下培養(yǎng)，一周左右莖尖轉(zhuǎn)綠并萌動，20d～30d形2DB36/T1654—2022在無菌條件下將已分化的帶芽莖段剪成小段，每段帶1～2個腋芽，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)基（MS+6-BA0.1mg/L）中進行增殖，3～4周后獲30～40個帶腋芽芽段。6.3病毒檢測取繼代培養(yǎng)壯芽或葉片提取RNA，經(jīng)RT-PCR檢測方法鑒定，沒有病毒宜繼續(xù)培養(yǎng)，脫毒不徹底應(yīng)棄之不用。具體操作見附錄A。6.4生根培養(yǎng)、煉苗及移栽管理6.4.1生根培養(yǎng)將繼代培養(yǎng)的莖段轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基（MS+6-BA0.1mg/L+NAA0.1mg/L）誘導(dǎo)生根，培養(yǎng)溫度25℃～26℃，3～4周后95%均生根。6.4.2煉苗瓶苗株高6cm～7cm，5～6片平展葉，生根5條以上3cm～4cm長的根時即可煉苗，幼苗煉苗1d～2d后，定植在營養(yǎng)缽或苗床，于具60目防蟲網(wǎng)的防蟲網(wǎng)室或防蟲溫室內(nèi)進行培育。6.4.3移栽管理原原種采用9cm×9cm營養(yǎng)缽或苗床移栽，珍珠巖+蛭石+泥炭按體積比1︰1︰1的比例混合做基質(zhì)，移栽前用廣譜保護性殺菌劑噴灑消毒。移栽后澆透定根水，以后保持基質(zhì)70%的持水量，空氣濕度保持在80%～90%。太陽光強時要注意采用遮陽網(wǎng)遮蔭。當(dāng)植株發(fā)新葉后，逐步恢復(fù)自然光照，并進行葉面施肥。氣溫不足時采取小拱棚膜和大棚相結(jié)合的雙膜覆蓋方式。白天保持25℃～26℃，夜間18℃～20℃。成活后白天保持25℃～27℃，夜間16℃～18℃，注意控水降溫，防止幼苗徒長。移栽前一周注意揭膜通風(fēng)煉苗。7原原種鑒定隨機抽取每批次脫毒苗5～10株，以其母株為對照種植至開花。觀察比較其主要生物性狀，與母株無差異者則可確認為原原種，有差異則淘汰。8原種繁育田要求育苗環(huán)境除應(yīng)符合NY/T391的規(guī)定外，要選擇排灌方便、地下水位較低，地勢高燥，土層深厚、肥沃、疏松，陽光充足，通風(fēng)條件好，3年內(nèi)未種過茄科植物、5年內(nèi)未種過菊科植物的中性或微酸性土壤地塊，且周圍800m范圍內(nèi)無其它菊科和茄科植物種植。育苗地于冬前深耕曬垡，每667平方米施入完全腐熟的農(nóng)家肥500kg，扦插前一周左右平整土地，清除雜草，畦面做到平、細、碎。育苗畦高25cm～30cm，畦面寬100cm，畦間距40cm。苗床四周開寬50cm的深溝，便于排水。3DB36/T1654—20228.2.2苗床消毒苗床先利用太陽光暴曬消毒，均勻噴灑廣譜殺菌劑和滅線劑至畦面上預(yù)防雜菌和根結(jié)線蟲病，再每平方米用茶枯餅0.03kg殺滅地下害蟲。在整平的畦面上均勻鋪上5cm～10cm厚的河沙。8.3剪頂扦插原種母株定植行株距應(yīng)為45cm×45cm，從煉苗移栽成活的原原種上取健壯枝條扦插于苗床上，于網(wǎng)室中擴繁。當(dāng)原種母株長到7～8片葉時，從基部留3～4片葉處剪下頂芽進行扦插。8.4田間管理在原種基地擴繁種苗應(yīng)周年進行，當(dāng)溫度低于0℃時，應(yīng)搭小拱棚，蓋上薄膜保溫。當(dāng)母株苗越冬后，要及時掀開薄膜，中耕除草，松土保墑。苗高7cm～8cm時，要開溝施1次復(fù)合肥。施用肥料應(yīng)符合NY/T496和NY/T525規(guī)定。具體田間管理參照NY/T1657操作，經(jīng)過一年生產(chǎn)和集中繁育，繁育出健壯原種苗。9質(zhì)量檢測脫毒原種苗質(zhì)量檢測參照NY/T1591中5.1.3進行抽樣檢查，并按照NY/T1591中5.2的內(nèi)容進行檢測，確定種苗的質(zhì)量等級。A4DB36/T1654—2022BA附錄A（規(guī)范性）RNA病毒的反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）檢測方法A.1主要儀器設(shè)備與試劑、耗材表A.1各步驟主要儀器設(shè)備與試劑、耗材主要試劑盒與試劑步驟/類別主要儀器設(shè)備主要耗材（試劑均使用分析純試劑）無RNA酶的離心管（1.5mL，2mL）、移液器配套槍頭、配套槍頭盒、研缽、研棒、PE手套、乳膠手套RNA提取試劑盒：TaKaRaMiniBESTPlant高壓滅菌鍋、電子天平、高速冷凍離心機、微量移液器、微量核酸測定儀RNAExtractionKitRNA提取試劑：無水乙醇、液氮第一鏈cDNA合成水浴鍋、制冰機、PCR擴增儀反轉(zhuǎn)錄試劑盒：PrimeScript?II1stStrand無RNA酶PCR管器PCR擴增儀器、制冰機PremixTaq?(TaKaRaTaq?Version2.0plus微量移液器、微量離心機dye)、引物、礦物油和槍頭、乳膠手套三角瓶、量筒、制膠板、梳子、乳膠手套RNA提取按照試劑盒（TaKaRaMiniBESTPlantRNAExtractionKit）Protocol-II的說明書進行。用1.0%的瓊脂糖凝膠對總RNA提取結(jié)果進行電泳檢測，利用微量核酸測定儀檢測RNA濃度，測量A260與A280值。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScript?II1stStrandcDNASynthesisKit）說明書進行。5DB36/T1654—2022A.2.3.1PCR反應(yīng)體系總體積10μL，其中0.4μL上游引物（10mM），0.4μL下游引物（10mM），5μLPremixTaq(TaKaRaTaq?Version2.0plusdye)（0.05U/μl），1μLcDNA模板（20ng/μL），3.2μLddH2O。A.2.3.2PCR反應(yīng)程序按照以下程序進行：1）94℃預(yù)變性4min；2）94℃變性45s；3）按表A.2推薦的引物退火溫度，退火45s；4）72℃延伸45s；5）重復(fù)步驟2）～4），共35個循環(huán)；6）72℃延伸7min；7）4℃保存