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文檔簡介
《蜂蜜中氯霉素和甲硝唑殘留量的測定液相色譜-串聯(lián)
質(zhì)譜法》編制說明
一、工作簡況
1.1標準來源和起草單位
團體標準《蜂蜜中氯霉素和甲硝唑殘留量的測定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》，
來源于北京預防醫(yī)學會，于2023年2月由北京市通州區(qū)疾病預防控制中心向北
京預防醫(yī)學會提出申請，經(jīng)專家評審后獲得立項。起草單位包括：北京市通州區(qū)
疾病預防控制中心、北京市順義區(qū)疾病預防控制中心、北京市海淀區(qū)疾病預防控
制中心。
1.2主要工作過程
1.2.1標準立項
2023年1月，北京市預防醫(yī)學會發(fā)布了《關(guān)于開展2023年團體標準編制工
作的通知》。2023年2月，北京市通州區(qū)疾病預防控制中心、北京市順義區(qū)疾病
預防控制中心和海淀區(qū)疾病預防控制中心三家單位對蜂蜜中甲硝唑和氯霉素殘
留量檢測的相關(guān)技術(shù)成果進行整理，進行標準立項申報。2023年3月，該項目
經(jīng)北京預防醫(yī)學會專家評審立項。
1.2.2成立標準編制小組
2023年2月，北京市通州區(qū)疾病預防控制中心、北京市順義區(qū)疾病預防控
制中心、北京市海淀區(qū)疾病預防控制中心三家起草單位成立了標準編制小組。確
定了標準制定計劃，標準編制組成員及其主要工作為：
北京市通州區(qū)疾病預防控制中心：魏玉霞、王建國、王芳、左郡、楊文英、
王艷春、李曉輝、李亞、張子彤、籍術(shù)良：主要負責前期調(diào)研、成立編制組、檢
測方法的開發(fā)、建立、驗證和應用、標準申報、標準起草、征求意見和匯總、以
及后續(xù)的標準修改、標準解讀等相關(guān)事項等工作。
北京市順義區(qū)疾病預防控制中心：劉盛田、王靜、李秦：作為標準申報起草
單位，負責方法技術(shù)方案確認、方法驗證、驗證方案、驗證報告等相關(guān)事項。
北京市海淀區(qū)疾病預防控制中心：崔悅、曹冬、馬愛英：作為標準申報起草
單位，負責方法技術(shù)方案確認、進行標準申報、標準起草、征求意見和匯總、以
及后續(xù)的標準修改、標準解讀等相關(guān)事項。
1.2.3制定方案：
查閱相關(guān)文獻和資料，總結(jié)和分析目前相關(guān)檢測方法的優(yōu)缺點，提出《蜂蜜
中氯霉素和甲硝唑殘留量的測定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》團體標準的起草方案，
并擬定起草標準的具體方法和步驟。
1.2.4開展實驗工作進行方法建立和確認，組織方法驗證
2023年3月至8月標準編制組按照實驗方案，結(jié)合本單位實驗室條件，參
照相關(guān)標準，在前期技術(shù)基礎(chǔ)上，進一步進行優(yōu)化和確認相應的樣品前處理方法
和分析檢測方法。并進行了方法學參數(shù)的驗證。
2023年8月組織北京市順義區(qū)疾病預防控制中心和北京市疾病預防控制中
心進行了方法驗證。
1.2.5編寫標準征求意見稿和編制說明
2023年8-9月，標準編制組編制征求意見稿和編制說明。
二、標準編制的必要性和預期效果
2.1必要性
蜂蜜富含糖類、黃酮類、維生素等多種營養(yǎng)物質(zhì)，是一款老少皆宜的營養(yǎng)滋
補品。蜂蜜養(yǎng)殖中的某些蜜蜂疾病，可以采用抗生素治療。同時，抗生素的使用
會導致蜂蜜中抗生素的殘留和聚積。食用有抗生素殘留的蜂蜜會對人體健康產(chǎn)生
不同程度的影響和危害。
甲硝唑?qū)儆谙趸溥蝾惪股兀黄毡橛糜陬A防和控制蜜蜂孢子蟲病，對厭
氧細菌十分有效。近年來，一些研究和文獻報道，硝基咪唑類抗生素具有遺傳毒
性、致突變性和致癌性。氯霉素是一種酰氨醇類廣譜抗生素，對多種需氧和厭氧
微生物具有活性，它的蛋白質(zhì)抑制特性使其可有效治療蜂蜜養(yǎng)殖中的多種傳染病。
《GB14963-2011食品安全國家標準蜂蜜》中3.5獸藥殘留限量和農(nóng)藥殘留限
量中規(guī)定獸藥殘留限量獸藥殘留限量應符合相關(guān)標準的規(guī)定?！禛B31650-2019
食品安全國家標準食品中獸藥最大殘留限量》規(guī)定甲硝唑允許做治療用，但不
得在動物性食品中檢出。中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第250號公告中規(guī)定在
動物源性食品中氯霉素及其殘留物不得檢出。但有文獻報道蜂蜜中甲硝唑和氯霉
素仍有檢出，因此有必要進行蜂蜜中甲硝唑和氯霉素同時檢測的方法研究，并建
立蜂蜜中氯霉素和甲硝唑殘留量同時測定的標準方法，為蜂蜜中氯霉素和甲硝唑
的測定提供一種補充方法和技術(shù)支持，為食品監(jiān)管部門提供監(jiān)管和執(zhí)法依據(jù)，保
障食品安全。
現(xiàn)行國家標準和公告中已有蜂蜜中氯霉素殘留測定的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法
和氣相色譜質(zhì)譜法（GB/T20744-2006，農(nóng)業(yè)部781號公告-10-2006，GB/T
18932.19-2003，GB/T18932.20-2003，GB/T18932.21-2003）以及甲硝唑類化合
物檢測的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（GB/T20744-2006），但關(guān)于同時檢測蜂蜜中甲
硝唑和氯霉素的標準方法尚未頒布和實施。鑒于此，本項目擬申報適用于蜂蜜中
的甲硝唑和氯霉素殘留量同時測定的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。為蜂蜜中甲硝唑和
氯霉素殘留量的同時測定提供一種方法補充和技術(shù)支持。
2.2預期效果
本項目申報的是適用于蜂蜜中甲硝唑和氯霉素殘留量同時測定的液相色譜
質(zhì)譜方法。該項目的實施將提供快速同時測定蜂蜜中甲硝唑和氯霉素殘留量的方
法，為蜂蜜中甲硝唑和氯霉素殘留量的快速、準確、同時測定提供標準方法和技
術(shù)支持，是現(xiàn)行蜂蜜中甲硝唑和氯霉素檢測方法的補充。
三、標準編制的原則和依據(jù)
遵循統(tǒng)一性、協(xié)調(diào)性、適用性、一致性、規(guī)范性的原則，盡可能與通行標準
接軌，注重標準的可操作性。本標準依據(jù)《GB/T1.1-2020標準化工作導則第
1部分：標準的結(jié)構(gòu)和編寫規(guī)則》。文本中的計量、單位、公示、符號以及數(shù)據(jù)
分析均按照《GB/T20001.4-2015標準編寫規(guī)則：化學分析方法》中的要求進行。
保證標準的適用性；保持標準的先進性；注意標準的統(tǒng)一性和協(xié)調(diào)性；注意標準
的經(jīng)濟性和社會效益。
本次標準制訂的基本原則如下：方法靈敏度滿足實際樣品測定的要求；方法
準確可靠，滿足各項方法特性指標的要求；方法適用性強，易于推廣使用。
四、主要技術(shù)內(nèi)容的論據(jù)
本方法適用于蜂蜜中甲硝唑和氯霉素殘留量的測定。
本標準是新制訂標準，標準編制組收集了大量相關(guān)資料，查詢了相關(guān)法律法
規(guī)和標準方法，確定了通過式固相萃取進行樣品前處理，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜進
行分析檢測的技術(shù)路線。本項目適用于蜂蜜中的氯霉素和甲硝唑的同時測定。
本標準的主要技術(shù)路線包括樣品前處理條件的優(yōu)化和液相色譜分離條件和
質(zhì)檢測條件的優(yōu)化，以及方法學參數(shù)考察，包括檢出限、定量限、線性范圍、準
確度和精密度等。優(yōu)化后的技術(shù)路線為：蜂蜜樣品加水溶解，加乙腈渦旋混勻后，
超聲提取30min。上清液過C18和NH2復合小柱進行凈化，濾過液濃縮定容，
在優(yōu)化的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件下上機測定。保留時間和離子對定性，內(nèi)標法
定量。
五、主要試驗（或驗證）的分析、綜述報告
5.1方法研究目標
建立液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測蜂蜜中甲硝唑和氯霉素殘留量的樣品前處理
條件方法和分析檢測方法。
5.2方法原理
試樣經(jīng)乙腈提取、通過式固相萃取凈化，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測，保留時
間和離子對定性，內(nèi)標法定量。
5.3樣品制備條件的優(yōu)化
5.3.1提取溶劑的優(yōu)化
在現(xiàn)行有關(guān)氯霉素的色譜-質(zhì)譜檢測標準中，提取溶劑多采用乙酸乙酯進行
提取。農(nóng)業(yè)部781號公告-10-2006、GB/T18932.20-2003和GB/T18932.19-2003
在試樣制備中都采取了用水溶解蜂蜜試樣，蜂蜜中的氯霉素殘留用乙酸乙酯提取，
提取液濃縮后再用水溶解的樣品提取方法。在GB/T20744-2006中試樣制備用乙
酸乙酯提取蜂蜜中甲硝唑、洛硝噠唑、二甲硝咪唑殘留量的測定。
乙腈有優(yōu)良的溶劑性能，能溶解多種物質(zhì)，據(jù)文獻報道在液相色譜-串聯(lián)質(zhì)
譜分析檢測的樣品前處理和分析檢測中得到了廣泛的應用。團體標準
T/SDAA018-2021《雞肉中37種獸藥殘留量的測定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》和地
方標準DB12/T987—2020《鮮、凍畜禽肉中磺胺類、喹諾酮類和四環(huán)素類獸藥
殘留量的測定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》中采用酸化乙腈進行多種獸藥殘留的提取。
考慮到本實驗中氯霉素最后是在負離子模式下進行檢測，考察了用乙腈做提取溶
劑時的提取效果，同時考察了乙酸乙酯做提取溶劑時的提取效果，并進行了比較。
結(jié)果表明，用乙腈做提取液時甲硝唑的提取效率為87%，氯霉素的提取效率
為127%；用乙酸乙酯做提取溶液后吹干復溶，甲硝唑的提取效率為83%，氯霉
素的提取效率為112%。由此可見，乙腈做提取液和乙酸乙酯做提取液，效果相
當。且使用乙腈進行樣品提取，提取液可直接上樣固相萃取小柱，避免了在固相
萃取上樣前進行濃縮和復溶的操作，簡化了提取流程，避免了濃縮和復溶過程中
可能的損失。因此，本方法選擇用乙腈進行蜂蜜中甲硝唑和氯霉素殘留量的提取。
5.3.2提取條件的優(yōu)化
在蜂蜜中甲硝唑和氯霉素的相關(guān)檢測標準中，GB/T20744-2006，農(nóng)業(yè)部781
號公告-10-2006，GB/T18932.20-2003，GB/T18932.19-2003等現(xiàn)行標準中，提
取方式包括振蕩器震蕩、高速渦旋混合等提取方式，時間為5-20min。T/SDAA
018-2021和DB12/T987—2020中進行獸藥殘留的提取時采用了渦旋、渦旋超聲
和振蕩相結(jié)合的提取方式。
本方法結(jié)合現(xiàn)行標準提取方式，采用加入提取溶劑渦旋混勻后超聲提取的提
取方式，并考察了10min和30min的超聲時間對樣品提取的影響。結(jié)果表明，
超聲10min和30min時，甲硝唑和氯霉素的響應基本一致。為保證充分提取，
本方法選擇渦旋混勻后超聲提取30min。
5.3.3凈化條件的優(yōu)化
在本方法中選擇C18和NH2復合小柱，采用通過式固相萃取的方式進行樣
品凈化。通過式固相萃取的凈化方式，是直接將樣品上樣固相萃取小柱，濾過液
直接進行測定或者經(jīng)過濃縮后上機測定。與傳統(tǒng)的固相萃取中需要進行活化、上
樣、洗脫、濃縮等操作相比，操作簡單，尤其適用于大批量樣品的測定。
本方法在取樣量5.00g，0.10μg/kg加標水平，比較了不同品牌固相萃取小柱
中的凈化效果。結(jié)果表明，在0.10μg/kg的加標濃度，采用不同品牌的固相萃取
柱進行凈化，甲硝唑和氯霉素響應的信噪比均可實現(xiàn)準確檢出。
5.4儀器分析條件的選擇
5.4.1液相色譜條件
（1）色譜柱：BEHC18柱，100mm×2.1mm，粒徑1.7μm
（2）流速:0.3mL/min
（3）柱溫：40℃
（4）進樣量：5μL
（5）流動相：A=5mmol/L乙酸銨水溶液，B=乙腈溶液，梯度洗脫條件見表1。
表1液相梯度洗脫程序
時間（min)5mmol/L乙酸銨水溶液%乙腈%
初始955.0
0.5955.0
3.00100
4.00100
5.0955.0
5.4.2甲硝唑質(zhì)譜條件
（1）電離方式：電噴霧電離，正離子模式（ESI+）。
（2）毛細管電壓：3?KV。
（3）離子源溫度：500?℃。
（4）脫溶劑氣流量：1000?L/Hr。
（5）錐孔反吹氣流量：150?L/Hr。
（6）霧化器壓力：7?bar。
（7）檢測方式：多反應監(jiān)測模式（MRM），離子對、錐孔電壓、碰撞電壓見表2。
5.4.3氯霉素質(zhì)譜參考條件
（1）電離方式：電噴霧電離，負離子模式（ESI-）。
（2）毛細管電壓：2.8?KV。
（3）離子源溫度：500?℃。
（4）脫溶劑氣流量：1000?L/Hr。
（5）錐孔反吹氣流量：150?L/Hr。
（6）霧化器壓力：7?bar。
（7）檢測方式：多反應監(jiān)測模式（MRM），離子對、錐孔電壓、碰撞電壓見表2。在優(yōu)
化的液相色譜-質(zhì)譜條件下甲硝唑、氯霉素及其內(nèi)標的色譜圖見圖1。
表2甲硝唑和氯霉素及其內(nèi)標的MRM參數(shù)
化合物模式母離子（m/z）子離子（m/z）錐孔電壓（v）碰撞電壓（v）
ES-321.0152.0*4020
氯霉素
321.0257.04015
326.1157.0*4020
氯霉素-D5
326.1262.14015
ES+172.182.12020
甲硝唑
172.1128.1*2015
176.182.12020
甲硝唑-D4
176.1128.1*2015
備注：*為定量離子
5.5方法學參數(shù)
5.5.1標準曲線及靈敏度
用乙腈/水溶液（體積比1:9）配制以下濃度的標準曲線系列：0.10?μg/L、0.25
?μg/L、0.5?μg/L、1.0?μg/L、2.0?μg/L、5.0?μg/L、10.0?μg/L、20.0?μg/L、50.0?μg/L。
以待測物峰面積與內(nèi)標峰面積比值為縱坐標、待測物濃度為橫坐標繪制標準曲線。
甲硝唑和氯霉素在0.1~50μg/L范圍內(nèi)，線性方程分別為：y=0.5674x-0.4324和y=0.7594x
+0.2465，線性相關(guān)系數(shù)分別為0.994和0.999，線性良好。取樣量按5.00g計算，以定
性離子通道中大于3倍信噪比（S/N）對應的濃度為方法檢出限，甲硝唑和氯霉
素的檢出限均為0.10?μg/kg，大于10倍信噪比（S/N）對應的濃度為方法定量限，
甲硝唑和氯霉素的檢出限均為0.30?μg/kg。
5.5.2準確度和精密度
用空白蜂蜜樣品，在低（0.3μg/kg）、中（0.6μg/kg）、高（5.0μg/kg）三個濃
度水平進行加標實驗，計算加標回收率和相對標準偏差（RSD），結(jié)果見表3。
由表可見，回收率在71.0~118.8%之間，相對標準偏差在4.3~8.0%之間，方法學
驗證參數(shù)，滿足《GB/T27404-2008實驗室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測》中檢
測方法確認的技術(shù)要求中的規(guī)定。
圖1a標準溶液中甲硝唑和甲硝唑-D4的提取離子流色譜圖（EIC）
圖1b標準
溶液中氯霉素和氯霉素-D5的提取離子流色譜圖（EIC）
圖1標準溶液中甲硝唑和氯霉素及其內(nèi)標的提取離子流色譜圖（EIC）
表3空白蜂蜜加標樣品中的準確度和精密度（n=6）
化合物名稱本底值(μg/kg)加標量(μg/kg)回收率范圍（%）平均回收率%)RSD（%）
甲硝唑<0.10.383.5~100.992.56.2
0.671.0~98.586.56.9
5.073.7~94.980.34.7
氯霉素<0.10.393.3~118.0105.97.5
0.678.9~112.9100.98.0
5.093.7~118.8108.15.7
5.6樣品測定
5.6.1定性：液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對樣品定性確證須滿足以下要求：
（1）待測樣品的保留時間在標準樣品的保留時間的±2.5%之內(nèi)；
（2）定性離子的信噪比大于3（S/N>3）；
（3）與標準品相比，樣品的兩個特征離子相對豐度在表4規(guī)定的許可范圍內(nèi)。
表4定性確證時相對離子豐度的最大允許偏差
相對離子豐度（%）≤10＞10～20＞20～50＞50
允許相對偏差（%）±50±30±25±20
5.6.2定量：內(nèi)標法定量
5.6.3結(jié)果計算
結(jié)果按式（1）計算：
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