（高清版）DB62∕T 4634-2022 牛結節(jié)性皮膚病血清學診斷技術

DB62/T4634—2022牛結節(jié)性皮膚病血清學診斷技術2022-10-20實施2022-10-20實施本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件由甘肅省農業(yè)農村廳提出并監(jiān)督實施。本文件由甘肅省畜牧業(yè)標準化技術委員會歸口。本文件起草單位：中國農業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所、甘肅省動物疫病預防控制中心、靜寧縣畜牧獸醫(yī)中心。本文件主要起草人：景志忠、高建平、唐豪、陳國華、張勇、房永祥、何小兵、景偉、李維克、賈懷杰、婁忠子、張春祥、付寶權。I本文件規(guī)定了牛結節(jié)性皮膚病的血清學診斷方法及其綜合判定。本文件適用于牛結節(jié)性皮膚病的快速診斷、檢疫和流行病學調查。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本GB19489實驗室生物安全通用要求GB/T39602牛結節(jié)性皮膚病診斷技術NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存和運輸技術規(guī)范3術語和定義下列術語和定義適用于本文件。牛結節(jié)性皮膚病lumpyskindisease(LSD)又名牛疙瘩皮膚病，是由痘病毒科脊椎動物亞科山羊痘病毒屬的牛結節(jié)性皮膚病病毒(LSDV)感染牛引起的一種傳染病，主要由吸血節(jié)肢動物傳播，其臨床特征主要為發(fā)熱，皮膚、黏膜和內臟器官表面的廣泛性結節(jié)，淋巴結腫大，動物消瘦，產奶量降低，不孕、不育和流產，以及無癥狀的隱性損傷和繼發(fā)感染等表現(xiàn)。4樣品采集與生物安全管理LSD臨床病例檢查與剖檢，診斷檢測樣品的采集、運輸和處理按照GB/T39602和NY/T541執(zhí)行；實驗室血清學試驗以及待檢樣品、培養(yǎng)物和廢棄物處理中的生物安全管理均按GB19489的相關規(guī)定執(zhí)行。5病毒中和試驗(VNT)MEM培養(yǎng)液，綿羊羔睪丸細胞(LTc),MDBK細胞，LSDV抗原及標準陽性、陰性血清，待檢血5.2方法12將log?06TCIDso/mL的山羊將第1份滅活的待檢血清50μL分別加到微量滴定板A到H行的第1、第2列孔中，第2份血清加到第3、第4列孔中，第3份血清加到第5、第6列孔中，第4份血清加到第7、第8列孔中，陰性對照血清加到第9、第10列孔中，50μL不含血清的Eagle's/HEPES液分別加到第11、第12列以及H行的所有孔中。從G行開始用最大稀釋度的病毒液50μL,加到該行的每個孔中。依加入到相應行的各孔中，直到最小病毒稀釋物加到A行。從培養(yǎng)第3d開始，在倒置顯微鏡下每天觀察單層細胞的細胞病變效應(CPE)情況，直至第9d,H行細胞應無CPE。以待檢血清最高稀釋度50%保護為該待檢血清中和效價，以能保護細胞免受感染的最6.1.1濃縮膠：由5%聚丙酰胺Tris(125mM,pH6.8)和SDS(0.1%)組成；6.1.2分離膠：由10%～12.5%聚丙酰胺Tris(560mM,pH8.7)和SDS(0.1%)組成；6.1.3甘氨酸電泳緩沖液：250mMTris、2M甘氨酸和0.1%SDS;6.1.4封閉液：3%BSA和0.05%Tween20PBS,或5%奶粉和0.05%Tween20PBS;DB62/T4634—206.1.6標準蛋白分子質量marker,硝酸纖維素膜(NCM),病毒粒子抗原或重組蛋白抗原。將待檢血清，包括陽性血清、陰性血清各1份，用封閉液1:50稀釋血清，56℃±0.5℃滅活30min后當山羊痘病毒屬病毒感染LTc的CPE達到90%時收獲細胞，凍融三次，離心，取上清轉移到一個新管，加病毒裂解液煮沸5min,作為組織培養(yǎng)的病毒粒子抗原。也可用體外表達的重組蛋白代替病毒粒子6.2.3SDS/PAGE分析將制備的病毒粒子抗原或重組蛋白抗原與標準蛋白分子質量marker同時分別上樣，加到SDSPAGE凝膠孔中，在甘氨酸電泳緩沖PBS充分沖洗，并用3%牛血清白蛋白PBS或5%脫脂奶粉PBS在旋轉振蕩器上4℃±0.5℃封閉過夜。將NCM按組別剪成數(shù)個紙條，用PBS在旋轉振蕩器上徹底沖洗5次，的血清(包括陽性和陰性對照血清)中在室溫下震蕩1.5h,再次充分洗滌NCM,并孵育在特定稀釋的辣震蕩孵育3min～7min,在NCM背景即將變色之前用PBS樣品不出現(xiàn)雜交條帶，表示試驗成立。待檢血清樣品至少出現(xiàn)一條雜交帶即注：抗副痘病毒(牛丘疹性口炎或偽牛痘病毒)的高免血清可與LSDV的一些蛋白反應，但不與32kDa蛋白反應，以區(qū)7間接ELISA法pH9.6);7.1.3濃縮洗滌緩沖液(25×PBST)(89.5gNa?HPO412H?O,5gKH?PO?,5gKCl,200gNaCl,5mL3學兔兔標準下載47.1.4封閉緩沖液：0.02molL磷酸鹽緩沖液+3%BSA(0.2g磷酸二氫鉀，2.9g磷酸氫二鈉，8g氯化鈉，30gBSA,加去離子水定容到1000mL);7.1.52M終止液(111mL濃硫酸(H?SO?),899mLH?O,30μLProclin300)。用稀釋液對辣根過氧化物酶標記的兔抗牛IgG作1:20000稀釋(工作濃度為1:10000～1:20000),每取出微孔板，每孔加終止液(2mol/LH?SO?)50μL。7.3.1試驗成立條件若陰性對照OD450值<0.3,陽性對照OD?50值(P)>1.0,P/N值>3,則試驗成立，結果有效。7.3.2S/N值計算每份待檢樣品的OD450值(S),除以參考陰性對照的OD450值(N),則得出每份待檢樣品的SN值。如果每份待檢樣品或陰、陽性對照有多孔重復，則應計算平均值后再計算S/N值。7.3.3判定標準待檢樣品的S/N≥2,則判定該樣品為陽性；SN<2,則為陰性。8競爭ELISA法8.1材料山羊痘病毒屬病毒抗原或重組蛋白抗原，競爭抗體工作液，鼠抗兔辣根過氧化物酶結合物，LSDV標準陽性血清、標準陰性血清，洗滌緩沖液(PBST),封閉緩沖液；TMB底物，2M終止液。8.2方法8.2.3抗原包被8.2.4競爭抗體制備用PBS將山羊痘病毒屬病毒抗原或重組蛋白抗原稀釋成200μg/mL,與弗氏完全佐劑按體積1:1混合，乳化后采用皮下多點注射免疫健康實驗家兔，每只接種免疫1mL;第一次免疫間隔14d后，用第一次免疫相同的疫苗和劑量進行第2次免疫；第二次免疫再間隔14d后，用加倍蛋白抗原與弗氏不完全佐劑疫苗進行第3次免疫；用第三次免疫相同的疫苗和劑量進行最后一次免疫，免疫接種后14d從家兔心臟采血，稀釋為競爭抗體工作液。8.2.5加血清樣品取已包被抗原的酶標板，每次檢測設標準陽性血清對照、陰性血清對照及空白對照孔，其中標準陽性血清對照設2孔，陰性血清對照設2孔，每孔加入相應血清(陽性或陰性對照血清)50μL/孔；空白對8.2.6加競爭抗體56用稀釋液(即洗滌液)對辣根過氧化物酶標記的鼠抗兔IgG作1:8000稀釋(工作濃度為1:1000~