毒理學指標及實驗操作VIP

藥物毒性試驗指標1.急性毒性試驗一、半數致死量（LD50）的測定(一)目的:觀察受試物一次給予動物后，所產生的毒性反應和死亡情況。(二)動物分組和劑量1.動物:一般用小白鼠8周齡，體重18---22g(同次試驗體重相差不超過2g)大白鼠6~8周齡，體重120--150g，同次試驗體重相差不超過10g。2.受試物:溶于水的做成溶液，不溶于水的做成混懸液.(三)試驗方法1.劑量:一般選用3一5個劑量，各劑量間劑距根據受試物情況和預試結果而定。2.給藥途徑和容積:給藥途徑:應與臨床試驗的途徑相一致?？诜幬飸辔附o藥，一、二類新藥應采用兩種途徑給藥，其中一種應為推薦臨床研究的給藥途徑。水溶性好的藥物還應測定靜脈給藥的急性毒性。給藥容積:小白鼠禁食(12~16小時)，不禁水，按體重計算:灌胃(ig)不超過0.4ml/10g體重。大白鼠禁食(12~16小時)，不禁水、灌胃(ig)，不超過3ml/只。3.測定LD50:將動物按體重隨機分組，每組至少10只(雌雄各半)。給受試物后立即觀察動物反應情況，每天觀察一次連續(xù)觀察七天。詳細逐天記錄動物毒性反應情況及死亡分布，并用適當的統(tǒng)計學方法(申報時應說明方法名稱)計算出LD50值及95%可信限。4.觀察毒性反應:給受試物后應嚴密觀察反應情況，并記錄動物的外觀、行為活動、精神狀態(tài)、食欲(飼料消耗量)、大、小便及其顏色、被毛、膚色、呼吸、鼻、眼、口腔有無異常分泌物，體重變化以及死亡等情況。死亡動物應及時進行尸檢，發(fā)現(xiàn)病變器官應做病理組織學檢查。若發(fā)現(xiàn)中毒反應或死亡率一與動物的性別有明顯相關時，則應選擇性別敏感的動物進行復試。(四)試驗報告和結果評價應詳細具體，包括試驗日期、動物的規(guī)格、性別、數量、受試物來源及含量、試驗方法。LD50值及其95%可信限，以及各劑量組的死亡率，或最大耐受量的值及其相當于臨床劑量的倍數.詳細報告實驗過程中動物出現(xiàn)的中毒表現(xiàn)及致死癥狀，綜合評價受試物毒性大小。二、最大耐受量（MTD）的測定方法:受試物可用臨床試驗的給藥途徑，以動物能耐受的最大濃度，最大容積的劑量一次或一日內2~3次給予動物(小白鼠至少20只，雌雄各半)。連續(xù)觀察七天，記錄動物反應情況，以不產生死亡的最大劑量為最大耐受量。計算出總給予藥量g/Kg(合生藥量g/Kg表示)，推算出相當于臨床用藥量的倍數。測定最大耐受量，同樣也應嚴密觀察動物毒性反應情況，要求與觀察單次給藥的毒性反應相同。2.長期毒性試驗一、大鼠的長期毒性試驗(一)目的:觀察連續(xù)重復給予受試物對大鼠所產生的毒性反應，首先出現(xiàn)的癥狀和嚴重程度，毒副反應的靶器官及其恢復和發(fā)展情況。確定無毒反應劑量，為擬定人用安全劑量提供參考。(二)動物和材料1.動物健康大白鼠(參見總則要求)，每組至少20只。如試驗周期為三個月以上，應根據需要增加數量至每組30~40只。體重差異應不超過平均體重的20%。試驗期在三個月內用6~8周齡大鼠。超過三個月。宜用5~6周齡大鼠，雌雄各半、隨機分組，每籠不超過5只，雌雄分籠飼養(yǎng)，試驗前至少觀察一周，記錄食量和體重等。(三)試驗方法1.劑量和分組(1)一般設三個劑量組和一個對照組。高劑量組原則上要求使動物產生明顯的或嚴重的毒性反應，或個別動物死亡。中劑量組應相當于藥效學試驗的高劑量.低劑量組略高于動物的有效劑量而不出現(xiàn)毒性反應。(2)如果急性毒性試驗結果毒性很低，測不出LD50。也未見明顯毒性反應，可設高、低兩個劑量組，高劑量組一般為擬用于臨床劑量50倍以上(有困難時，可適當減少劑量)并應高于藥效學試驗之高劑量。(3)對照組的設置:如受試物為提取物(如浸膏)，對照物可考慮用常水;如含溶媒，對照物為溶媒;如含賦形劑，則對照物用賦形劑。如溶媒或賦形劑可能產生毒性時，則應另加一空白對服組(常水)。2.給藥途徑與方法(1)給藥途徑與推薦臨床的途徑一致。口服藥物應經口給藥。臨床用藥途徑為靜脈注射時，可用其它適宜的注射途徑代替。(2)口服藥大鼠一般用灌胃法，也可將受試物混在飼料、水中給予，但每只動物分籠飼養(yǎng)，采取適當措施，保證每只動物按規(guī)定劑量在一定時限內服入。(3)受試物最好是每周7天連續(xù)給予，如試驗周期在90天以上，可考慮每周給藥6天，每天定時給藥。(4)給藥容量一般為1~2ml/l100g體重，每周可根據體重情況調整給藥量，但總量不宜超過5ml/鼠/次。各劑量組用等容量不等濃度給藥。3.試驗周期(1)長毒試驗的給藥時間應為臨床試驗用藥期的二~三倍，最長半年。(2)若臨床用藥周期在1周以內者，長毒試驗應為2周;2周以內者，應為四周;四周以上者，長期毒性試驗的給藥期一般為臨床試驗用藥期的兩倍以上。(四)檢查項目1.一般觀察:進食量、體重、外觀體征和行為活動、糞便性狀等，發(fā)現(xiàn)有中毒反應的動物應取出單籠飼養(yǎng)，重點觀察。發(fā)現(xiàn)死亡或瀕死動物應及時尸檢。2.檢測項目;(1)血液學指標:紅細胞或網織紅細胞計數、血紅蛋白、白細胞計數、白細胞分類、血小板計數、凝血時間。(2)血液生化學指標:天門冬氨酸氨基轉換酶(AST)、丙氨酸氨基轉換酶(ALT),堿性磷酸酶(ALP)、尿素氮(BUN),總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、血澹(GLU)、總膽紅素(T-BIL)、肌醉(Grea)、總膽固醇(T-CHO)。(3)系統(tǒng)尸解和病理組織學檢查:①系統(tǒng)尸解:應全面細致，發(fā)現(xiàn)異常器官應重點進行病理組織學檢查。②臟器稱重和勝器系數;剖解后取出心、肝、腎、脾、肺、腎上腺、甲狀腺、攀丸、卵巢、子宮、腦、前列腺。③病理組織學檢查:高劑量組對照組動物及尸檢發(fā)現(xiàn)異常器官檢查要詳細。其他劑量組可取材保存。在高劑量組發(fā)現(xiàn)有異常病變時才進行檢查。檢查內容除一類其他各類新藥:心、肝、腎、脾、肺、腎上腺、甲狀腺、胃、胸腺、肇丸(和附肇)Y前列腺、卵巢和子宮和可能的靶器官。3.可逆性觀察最后一次給藥后24小時，每組活殺部分動物(2/3~1/2)，檢測各項指標，余下動物停藥，繼續(xù)觀察2~4周。如24小時后的病理學檢查發(fā)現(xiàn)有異常變化，應將余下動物活殺剖檢，重點觀察毒性反應器官，以了解毒性反應的可逆程度和可能出現(xiàn)的遲緩性毒性。4.指標觀察時間一般狀況和癥狀的觀察，每天觀察一次。每周記錄飼料消耗和體重一次。試驗周期在三個月以內的，一般在最后一次給藥后24小時和恢復期結束時各進行一次各項指標的全面檢測.必要時，在試驗中間檢測指標一次。試驗周期在三個月以上的，可在試驗中期活殺少量動物(高劑量組和對照組)全面檢測各項指標。對瀕死或死亡動物應及時檢查。二、犬的長期毒性試驗目的:觀察連續(xù)重復給予受試物對犬所產生的毒性反應，首先出現(xiàn)的癥狀和嚴重程度，提供毒副反應的靶器官及其恢復和發(fā)展情況，確定無毒反應劑量，為擬定人用安全劑量提供參考。3.皮膚用藥毒性試驗目的:觀察動物完整皮膚及破損皮膚短時期接觸受試物所產生的毒性反應。4.粘膜用藥的毒性試驗目的:觀察動物跟睛接觸受試物后所產生的刺激反應情況和恢復情況。5.特殊毒性試驗根據《新藥審批辦法》及《有關中藥部分的修訂和補充規(guī)定冷各類型中藥新藥在特殊毒性實驗方面應做項目如下:1.一類新藥必須進行特殊毒理研究。2.保胎藥與影響胎兒子代發(fā)育的藥物，除按一般毒理學要求進行實驗外，還應增做生殖毒性試驗。3.其它類新藥如在實驗中發(fā)現(xiàn)有影響生殖或致癌的可疑性時，應補做相應的特殊毒性試驗。一、致突變試驗中藥一類新藥，除按藥理、毒理學要求進行試驗外，還需做基因突變試驗，染色體畸變試驗及動物微核試驗。由于中藥制劑有其特殊性，如含有生藥粉的制劑，不溶物較多;或因成分復雜，溶解度較差，以及pH等間題的研究，難以進行體外試驗者，可只做體內試驗。(一)基因突變實驗基因突變試驗的目的是反映受試物在基因水平上的致突變作用。主要方法有三種:其中微生物回復突變試驗適合于化學純度高的藥物，較為常用;中藥粗制品不宜做微生物回復突變試驗，哺乳動物培養(yǎng)細胞突變試驗適用于受試物本身具有抗微生物作用的藥品;果蠅伴性隱性致死試驗是整體動物的基因突變試驗，準確性較高，在上述二法有某些陽性或可疑陽性時較為適用。果蠅伴性隱性致死試驗1.果蠅:Oregon一R雄蠅等和Muller一5雌蠅。2.給藥途徑:口服或其他接近臨床用藥的途徑。3.劑量:至少二個劑量。最高劑量為最大耐受劑量或產生某些毒性指征的劑量，通常以1/2LD50為基準，低劑量為1/4LD50，無毒物最大給藥量可用最大耐受量。對照馭用溶劑及陽性對照。4.試驗:(1)毒性試驗:求出半數致死量。(2)繁殖力試驗觀察受孕與不育情況。如有不育，可調低劑量。(3)樣本的大小:受試染色體總數實驗和陰性對照組6000以上，陽性對照組300以上，觀察給藥的雄果蠅和處女蠅交配，每2一3天更新處女蠅，記錄雌性子代的致死作用。5.報告將數據列成表，包括受試染色體數，給藥的和無生育力的雄性數，F(xiàn)2代培養(yǎng)群的數目，每一生殖細胞期檢測的帶有致死基因的染色體數。6.判定:(1)一支培養(yǎng)管中，F(xiàn):代合計有2(i只以上雌、雄蠅而末發(fā)現(xiàn)有野生型紅眼雄蠅者為陽性:反之，有2只以上雄蠅者為陰性。(2)在一支培養(yǎng)管中，F(xiàn):代雌、雄蠅合計少于}a只，或只有一只紅眼雄蠅者為可疑，需觀察F3代。(3)僅存雌、雄蠅親本而無仔蠅者為不育。7，統(tǒng)計處理及評價:致死突變率%=致死管數/受試染色體數×100%(1)致死突變率大于自發(fā)突變率的2倍并有劑量反應關系時記為陽性。(2)或將給藥組與對照組的致死突變率進行比較，如對照組與給藥組的突變總數小于1}},按}astenbaum-Bowman方法統(tǒng)計，總數大于iaa按}z統(tǒng)計。(二)染色體畸變試驗染色體畸變試驗的目的是反映受試物在染色體水平上的致突變作用，其中培養(yǎng)細胞染色體畸變試驗是體外實驗，對受試物的純度及理化性質要求較高，而精原細胞染色體畸變試驗及嚙齒動物顯性致死實驗均為體內實驗，前者需用小鼠數較少，實驗周性較短，后者雖然工作量較大，但同時可獲得受孕率，死胎數，含死胎孕鼠百分率等較多信息.嚙齒類動物顯性致死試驗:1甲動物;性成熟小鼠。每組至少15只雄鼠，孕鼠20只以上。2.劑量:一般采用3個劑量。受試物的最高劑量應導致毒性癥狀或減少繁殖力，低毒物最大劑量可用最大耐受量對照用溶劑及陽性對照。3.給藥途徑與方法盡可能和臨床擬用途徑相同。一般采用一天一次，連續(xù)五天給藥或其它適宜的給藥方式。4.交配方法:3.骨髓采樣時間:通過預試，在12-72h不同時間內，取5個作用點，找出合適采樣時間，如無差別一般采用24h采樣。4.劑量及劑量級:至少采用3個劑量，最高劑量以1/2LD50或最大耐受量為基準，否則應說明選定劑量的理由。對照組:用溶媒及陽性對照。5.標本制作:取骨髓、涂片、Giernsa或叮吮橙熒光染色鏡檢:每只動物至少計數100個多染紅細胞，Giemsa染色，觀察其微核出現(xiàn)的頻度及多染紅細胞和正常紅細胞的比率。吖啶橙熒光染色，則直接觀察微核出現(xiàn)的頻度。6.判定:(1)受試物所誘發(fā)的微核率的增加與劑量相關;(2)某一測試點微核增加呈現(xiàn)可重復的并有統(tǒng)計學意義的增加;符合上述一條即