DB51-T1828-2014-牦牛源沙門(mén)氏菌PCR檢測(cè)技術(shù)規(guī)范-四川省

ICS65.020.30DB51B41四川省地方標(biāo)準(zhǔn)DB51/T1828—2014牦牛源沙門(mén)氏菌PCR檢測(cè)技術(shù)規(guī)范四川省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布DB51/T1828—2014目次前言...............................................................................II范圍..............................................................................12規(guī)范性引用文件....................................................................113456術(shù)語(yǔ)和定義........................................................................1設(shè)備和試劑........................................................................1DNA提取...........................................................................2PCR擴(kuò)增...........................................................................37PCR產(chǎn)物的電泳檢測(cè).................................................................38結(jié)果判定..........................................................................39廢棄物處理........................................................................3附錄A（規(guī)范性附錄）相關(guān)試劑配制....................................................4IDB51/T1828—2014前言本標(biāo)準(zhǔn)附錄A為規(guī)范性附錄。本標(biāo)準(zhǔn)由四川省農(nóng)業(yè)廳提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)由四川省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局批準(zhǔn)。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：西南民族大學(xué)。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：張煥容、湯承、岳華、楊發(fā)龍、王永、張斌、任玉鵬、王遠(yuǎn)微。IIDB51/T1828—2014牦牛源沙門(mén)氏菌PCR檢測(cè)技術(shù)規(guī)范1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了牦牛源沙門(mén)氏菌的PCR檢測(cè)方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于牦牛源沙門(mén)氏菌的檢測(cè)與鑒定。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法。GB16548病害動(dòng)物和病害動(dòng)物產(chǎn)品生物安全處理規(guī)程?！东F醫(yī)實(shí)驗(yàn)室生物安全技術(shù)管理規(guī)范》（2003農(nóng)業(yè)部公告第302號(hào)）。3術(shù)語(yǔ)和定義是一群寄生于人和動(dòng)物腸道內(nèi)的革蘭陰性桿菌，生化特性和抗原結(jié)構(gòu)相似，兼性厭氧。絕大多數(shù)發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，也偶爾有不產(chǎn)氣的。在三糖鐵瓊脂上常產(chǎn)生H2S。是指從牦牛實(shí)質(zhì)器官、糞便和肉品中分離鑒定的沙門(mén)氏菌，包括致病性和非致病性沙門(mén)氏菌。致病性沙門(mén)氏菌常引起犢牦牛副傷寒，犢牦?；蚯嗄觋笈＜毙晕改c炎和敗血癥及其他組織局部炎癥。且為人類食物中毒的主要病原之一。1DB51/T1828—20144.1.7恒溫水浴鍋4.1.8移液器（0.1μL~10μL、2μL~20μL、20μL~200μL、200μL~1000μL）4.2主要試劑4.2.1引物（10μmol/L）上游引物：5’-GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA-3’；下游引物：5’-TCATCGCACCGTCAAAGGAACC-3’。引物擴(kuò)增片段大小為284bp。4.2.24.2.3DNA提取試劑：蛋白酶K、十二烷基硫酸鈉（SDS）、Tris飽和酚、氯仿、異戊醇、無(wú)水乙醇。PCR反應(yīng)試劑：TaqDNA聚合酶（5U/μL）、MgCl2（25mmol/L）、dNTP（每種濃度為2.5mmol/L）、10×PCRBuffer(無(wú)Mg2+)。4.2.44.2.54.2.64.2.74.2.84.2.94.2.10STE緩沖液（見(jiàn)附錄A）TAE電泳緩沖液（見(jiàn)附錄A）6×上樣緩沖液（6×LoadingBuffer）瓊脂糖（電泳級(jí)）核酸染料(Goldview)DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL600水：所用水應(yīng)符合GB/T6682中三級(jí)水（三蒸水）規(guī)格。4.2.11陽(yáng)性對(duì)照：標(biāo)準(zhǔn)參考菌株作為陽(yáng)性對(duì)照。4.2.12陰性對(duì)照：用GB/T6682中三級(jí)水代替PCR擴(kuò)增模板作為陰性對(duì)照。5.1.1糞便樣本：無(wú)菌取約1g糞便接種至10mL緩沖蛋白胨水（BPW）增菌液，37℃培養(yǎng)24h。取1mLBPW增菌液分別接種于10mL四硫磺酸鈉亮綠（TTB）增菌液，42℃培養(yǎng)24h。1mL增菌液12000r/min離心20min,棄上清，收集沉淀用于DNA提取。5.1.2組織樣本：按1g加入1mL的STE緩沖液進(jìn)行研磨，3000r/min進(jìn)行離心10min，取上清液，12000r/min進(jìn)行離心20min，棄上清，沉淀用于DNA提取。5.2.2加入10%SDS溶液20μL，20mg/mL蛋白酶K10μL，混勻，在56℃水浴60min。5.2.3加入等體積的酚/氯仿/異戊醇（25:24:1），混勻，12000r/min離心5min。5.2.4轉(zhuǎn)移上清到另一離心管中，加入等體積的氯仿/異戊醇（24:1），顛倒混勻，12000r/min離心5min。5.2.5取上清，加入2.5倍體積的預(yù)冷無(wú)水乙醇，-20℃沉淀30min，12000r/min離心5min，棄去上清液。2DB51/T1828—20145.2.7室溫干燥，DNA沉淀用25μL無(wú)菌三蒸水溶解作為模板，-20℃保存?zhèn)溆谩?PCR擴(kuò)增6.16.2每次進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，除檢測(cè)樣品外，均需設(shè)置陽(yáng)性和陰性對(duì)照。PCR反應(yīng)體系：10×PCRBuffer2.0μL，10mmol/LdNTPs2.5μL，Taq酶0.5μL，模板DNA（空白對(duì)照用水代替）1μL，上游引物1μL，下游引物1μL，水17μL，總體積25μL。6.3PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min；94℃變性45s；60℃退火45s；72℃延伸10min，依次進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。7PCR產(chǎn)物的電泳檢測(cè)7.1用TAE電泳緩沖液配制成2%瓊脂糖凝膠（見(jiàn)附錄A）。7.2取5μLPCR產(chǎn)物與1μL6×上樣緩沖液混合，分別加入樣品孔，同時(shí)在一加樣孔中加入DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)（DL600），以5V/cm恒壓電泳，采用凝膠成像系統(tǒng)判定核酸片段大小。8結(jié)果判定8.1陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)一條284bp大小的條帶，且陰性對(duì)照不出現(xiàn)條帶。8.2在滿足8.1的條件下，被檢樣品的PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳后出現(xiàn)一條284bp的條帶判定為核酸陽(yáng)性（+）；被檢樣品的PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳后不出現(xiàn)284bp的條帶判定為核酸陰性（-）。3DB51/T1828—2014AA附錄A（規(guī)范性附錄）相關(guān)試劑配制A.1緩沖蛋白胨水（BPW）A.1.1成分蛋白胨10.0g5.0g9.0g1.5g氯化鈉磷酸氫二鈉（含12個(gè)結(jié)晶水）磷酸二氫鉀