EZH2對(duì)鼻咽癌血管生成的調(diào)控機(jī)制及靶向干預(yù)研究

EZH2對(duì)鼻咽癌血管生成的調(diào)控機(jī)制及靶向干預(yù)研究一、引言1.1研究背景鼻咽癌（NasopharyngealCarcinoma,NPC）是一種起源于鼻咽部上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，在全球范圍內(nèi)呈現(xiàn)出明顯的地域和種族差異。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）統(tǒng)計(jì)，約46.9%的NPC發(fā)生在中國(guó)，尤其在我國(guó)南方地區(qū)，如廣東、廣西等地，發(fā)病率可高達(dá)25/10萬(wàn)。2008年，全世界新增鼻咽癌病例84400人，死于鼻咽癌患者51600人，其中大部分病例集中在我國(guó)南方。鼻咽癌的治療方案主要是以放射治療為主的綜合治療，早期病例通過(guò)放療或放化療綜合治療往往能取得較好的效果。然而，一旦鼻咽癌發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，其預(yù)后則不良，中位生存時(shí)間僅12-20個(gè)月?；熓寝D(zhuǎn)移性鼻咽癌的主要治療方法，但治療效果差，反應(yīng)率僅有50-80%，僅能延長(zhǎng)患者中位生存期5-11個(gè)月。鼻咽癌總的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率可達(dá)25-30%，5年內(nèi)死亡的首診未轉(zhuǎn)移病例有2/3歸因于遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。因此，深入探究鼻咽癌的轉(zhuǎn)移機(jī)制，尋找新的治療靶點(diǎn)和方法，對(duì)于提高患者的生存率和改善預(yù)后具有重要意義。血管生成是指從已有的毛細(xì)血管或毛細(xì)血管后靜脈發(fā)展而形成新的血管的過(guò)程，是惡性腫瘤的主要特征之一。與正常人體組織一樣，惡性腫瘤的生長(zhǎng)、增殖和轉(zhuǎn)移也依賴于充足的氧氣和營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，以及代謝產(chǎn)物的排出。當(dāng)腫瘤發(fā)展至1-2mm3時(shí)，就需要新生血管的滋養(yǎng)才能維持生長(zhǎng)，否則腫瘤將處于靜止?fàn)顟B(tài)。新生血管不僅為腫瘤細(xì)胞提供必要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，還為腫瘤細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)并發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移提供了途徑。腫瘤血管的基底膜通透性較高，腫瘤細(xì)胞可直接穿透血管進(jìn)入血流，從而實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)移。因此，血管生成在腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用，抑制血管生成已成為腫瘤分子靶向治療的重要策略之一。目前，已有多種抗血管生成分子靶向藥物，如貝伐單抗（bevacizumab）和索拉非尼（sorafenib）等，在卵巢癌、乳腺癌、腎癌和肝癌等惡性腫瘤的晚期治療中取得了較好的效果，有效延長(zhǎng)了患者的生存時(shí)間。Zeste基因增強(qiáng)子同源物2（EnhancerofZesteHomologue2,EZH2）是Polycombgroup（PcG）基因家族的重要成員，其與EED（EmbryonicEctodermDevelopment）、SUZ12（SuppressorofZeste12）和RbAp46/48共同組成PRC2復(fù)合物。EZH2作為PRC2復(fù)合物的催化亞基，能夠?qū)谢蚪M蛋白H3K27甲基化，導(dǎo)致靶基因沉默。近年來(lái)，大量研究表明EZH2在多種惡性腫瘤中異常表達(dá)，并與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)。在前列腺癌中，與局限性前列腺癌和良性前列腺腫瘤相比，EZH2在轉(zhuǎn)移性前列腺癌中表達(dá)升高，可促進(jìn)前列腺癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，且與前列腺癌的預(yù)后有關(guān)，被認(rèn)為是前列腺癌的癌基因。在乳腺癌中，EZH2表達(dá)上調(diào)，可增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞的侵襲能力，還可通過(guò)抑制乳腺癌細(xì)胞雌激素受體α（EstrogenReceptorα,ERα）表達(dá)降低乳腺癌的治療敏感性。此外，EZH2在白血病、卵巢癌、肝癌等惡性腫瘤中也存在表達(dá)上調(diào)的情況。近期研究發(fā)現(xiàn)，EZH2可能通過(guò)促進(jìn)血管生成影響腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。在卵巢癌內(nèi)皮細(xì)胞中，EZH2表達(dá)升高，可通過(guò)抑制血管抑制蛋白1（Vasohibin1,VASH1）表達(dá)促進(jìn)卵巢癌血管生成。在惡性膠質(zhì)瘤內(nèi)皮細(xì)胞中，EZH2基因沉默可抑制人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（HumanBrainMicrovascularEndothelialCells,HBMVECs）遷移和成管能力，惡性膠質(zhì)瘤中VEGF通過(guò)miR-101靶向調(diào)控EZH2而形成VEGF/miR-101/EZH2軸，促進(jìn)血管生成。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，鼻咽癌標(biāo)本中EZH2mRNA表達(dá)升高，且EZH2可調(diào)控鼻咽癌細(xì)胞的細(xì)胞周期并促進(jìn)其增殖，EZH2表達(dá)與鼻咽癌的臨床分期、轉(zhuǎn)移和預(yù)后關(guān)系密切，是鼻咽癌的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)。然而，EZH2對(duì)鼻咽癌生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的促進(jìn)作用是否通過(guò)影響腫瘤血管生成實(shí)現(xiàn)尚未見報(bào)道。因此，本研究旨在探討EZH2對(duì)鼻咽癌血管生成的影響及其潛在機(jī)制，為鼻咽癌的分子靶向治療提供新的理論依據(jù)和潛在靶點(diǎn)。1.2EZH2與腫瘤血管生成研究進(jìn)展EZH2是Polycombgroup（PcG）基因家族的重要成員，其編碼的蛋白由746個(gè)氨基酸組成，包含五個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域，分別為EED相互作用域（EID）、與PHF1和PCL（結(jié)構(gòu)域I）的結(jié)合結(jié)構(gòu)域、與SUZ12結(jié)合結(jié)構(gòu)域、富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域（CXC）和SET結(jié)構(gòu)域。其中，SET結(jié)構(gòu)域是EZH2發(fā)揮催化活性的關(guān)鍵區(qū)域，能夠催化組蛋白H3賴氨酸27（H3K27）的三甲基化修飾（H3K27me3），進(jìn)而抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄。在正常生理狀態(tài)下，EZH2參與胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化和組織穩(wěn)態(tài)維持等重要生物學(xué)過(guò)程。在胚胎發(fā)育過(guò)程中，EZH2通過(guò)對(duì)特定基因的甲基化修飾，調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化和遷移，確保胚胎正常發(fā)育。在造血干細(xì)胞分化過(guò)程中，EZH2可調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，影響造血干細(xì)胞向不同血細(xì)胞譜系的分化。然而，在多種惡性腫瘤中，EZH2呈現(xiàn)異常高表達(dá)，并與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)。在前列腺癌中，EZH2的高表達(dá)與腫瘤的侵襲性和轉(zhuǎn)移潛能增加相關(guān)，可促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的增殖和遷移。在乳腺癌中，EZH2不僅能夠增強(qiáng)癌細(xì)胞的侵襲能力，還可通過(guò)抑制雌激素受體α（ERα）的表達(dá)，降低乳腺癌對(duì)內(nèi)分泌治療的敏感性。此外，在白血病、卵巢癌、肝癌等多種惡性腫瘤中，也均發(fā)現(xiàn)EZH2表達(dá)上調(diào)，且與腫瘤的不良預(yù)后相關(guān)。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明EZH2在腫瘤血管生成中發(fā)揮著重要作用。腫瘤血管生成是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，涉及多種細(xì)胞和分子機(jī)制。在這個(gè)過(guò)程中，腫瘤細(xì)胞分泌的血管生成因子，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF）等，刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成，從而形成新的血管網(wǎng)絡(luò)，為腫瘤提供營(yíng)養(yǎng)和氧氣。EZH2可以通過(guò)多種途徑影響腫瘤血管生成。在卵巢癌中，研究發(fā)現(xiàn)EZH2在卵巢癌內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)升高，可通過(guò)抑制血管抑制蛋白1（VASH1）的表達(dá)，解除對(duì)血管生成的抑制作用，從而促進(jìn)卵巢癌血管生成。在惡性膠質(zhì)瘤中，EZH2基因沉默可抑制人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（HBMVECs）的遷移和成管能力。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，VEGF通過(guò)miR-101靶向調(diào)控EZH2，形成VEGF/miR-101/EZH2軸，促進(jìn)血管生成。這表明EZH2在腫瘤血管生成中可能作為一個(gè)關(guān)鍵的調(diào)控節(jié)點(diǎn)，參與多種信號(hào)通路的調(diào)節(jié)。盡管目前關(guān)于EZH2在腫瘤血管生成中的作用已有一定的研究，但在鼻咽癌領(lǐng)域，EZH2對(duì)腫瘤血管生成的影響及其機(jī)制尚不清楚。鼻咽癌作為一種具有獨(dú)特流行病學(xué)特征和生物學(xué)行為的惡性腫瘤，其血管生成機(jī)制可能與其他腫瘤存在差異。深入研究EZH2在鼻咽癌血管生成中的作用及機(jī)制，對(duì)于揭示鼻咽癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移機(jī)制，尋找新的治療靶點(diǎn)具有重要意義。1.3研究目的與意義本研究旨在深入探究EZH2影響鼻咽癌血管生成的具體機(jī)制，為鼻咽癌的治療提供新的靶點(diǎn)和理論依據(jù)。具體而言，研究目的包括以下幾個(gè)方面：明確EZH2與鼻咽癌血管生成的相關(guān)性：通過(guò)免疫組化等方法檢測(cè)鼻咽癌患者組織標(biāo)本中EZH2和血管內(nèi)皮標(biāo)志物（如CD34）的表達(dá)，分析EZH2表達(dá)水平與腫瘤內(nèi)微血管密度（MVD）之間的相關(guān)性，初步判斷EZH2在鼻咽癌血管生成過(guò)程中的潛在作用。闡明EZH2對(duì)鼻咽癌血管形成的影響：利用細(xì)胞生物學(xué)和動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)，改變EZH2的表達(dá)水平，觀察其對(duì)鼻咽癌細(xì)胞增殖、侵襲、成管能力的影響，以及在雞胚絨毛尿囊膜（CAM）血管生成模型和裸鼠肝包膜下移植瘤模型中對(duì)腫瘤血管生成的作用，明確EZH2對(duì)鼻咽癌血管形成的促進(jìn)或抑制作用。探索EZH2影響鼻咽癌血管生成的下游基因和信號(hào)通路：通過(guò)RT-qPCR和ELISA等技術(shù)檢測(cè)血管生成相關(guān)因子的表達(dá)變化，篩選出受EZH2調(diào)控的下游基因，進(jìn)一步探討EZH2影響鼻咽癌血管生成的分子機(jī)制，為鼻咽癌的靶向治療提供理論基礎(chǔ)。本研究具有重要的理論和臨床意義。在理論方面，深入揭示EZH2在鼻咽癌血管生成中的作用機(jī)制，有助于進(jìn)一步完善鼻咽癌的發(fā)病機(jī)制理論，豐富對(duì)腫瘤血管生成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的認(rèn)識(shí)，為其他惡性腫瘤的研究提供借鑒。在臨床方面，EZH2有望成為鼻咽癌治療的新靶點(diǎn)，為開發(fā)新型的分子靶向治療藥物提供依據(jù)，提高鼻咽癌的治療效果，改善患者的預(yù)后。此外，對(duì)EZH2的研究還可能為鼻咽癌的早期診斷、預(yù)后評(píng)估提供新的生物標(biāo)志物，有助于實(shí)現(xiàn)鼻咽癌的精準(zhǔn)治療。二、材料與方法2.1實(shí)驗(yàn)材料2.1.1細(xì)胞株與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物人鼻咽癌細(xì)胞株5-8F、CNE2購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。5-8F細(xì)胞為低分化鱗狀細(xì)胞癌，具有高轉(zhuǎn)移、高成瘤能力；CNE2細(xì)胞為低分化鱗狀細(xì)胞癌。將細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FetalBovineSerum,FBS）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期換液和傳代。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用4-6周齡的雌性BALB/c裸鼠，體重18-22g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。裸鼠飼養(yǎng)于無(wú)特定病原體（SpecificPathogenFree,SPF）環(huán)境中，給予無(wú)菌飼料和飲用水，適應(yīng)環(huán)境1周后用于實(shí)驗(yàn)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格遵循動(dòng)物倫理和福利原則，實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)本單位動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。2.1.2主要試劑與儀器主要試劑：RPMI-1640培養(yǎng)基（Gibco公司，美國(guó)），用于細(xì)胞培養(yǎng)，為細(xì)胞提供生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)；胎牛血清（FBS，Gibco公司，美國(guó)），補(bǔ)充培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)因子和營(yíng)養(yǎng)成分，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)；青霉素-鏈霉素雙抗溶液（HyClone公司，美國(guó)），防止細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的細(xì)菌污染；TRIzol試劑（Invitrogen公司，美國(guó)），用于提取細(xì)胞總RNA；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司，日本），將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以便后續(xù)進(jìn)行PCR反應(yīng)；SYBRGreenPCRMasterMix（TaKaRa公司，日本），用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR，檢測(cè)基因表達(dá)水平；兔抗人EZH2多克隆抗體（Abcam公司，英國(guó)），用于免疫印跡和免疫組化實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)EZH2蛋白表達(dá)；鼠抗人CD34單克隆抗體（BDBiosciences公司，美國(guó)），免疫組化檢測(cè)血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物CD34，用于評(píng)估微血管密度；辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG和山羊抗鼠IgG（JacksonImmunoResearch公司，美國(guó)），作為二抗，用于免疫印跡實(shí)驗(yàn)，放大檢測(cè)信號(hào)；ECL化學(xué)發(fā)光試劑（ThermoFisherScientific公司，美國(guó)），與HRP結(jié)合產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號(hào)，用于檢測(cè)免疫印跡結(jié)果；Matrigel基質(zhì)膠（Corning公司，美國(guó)），用于細(xì)胞成管實(shí)驗(yàn)，模擬體內(nèi)血管生成環(huán)境；雞胚（購(gòu)自本地孵化場(chǎng)），用于雞胚絨毛尿囊膜（CAM）血管生成實(shí)驗(yàn)，研究腫瘤細(xì)胞對(duì)血管生成的影響；脂質(zhì)體Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑（Invitrogen公司，美國(guó)），用于將質(zhì)?；騭iRNA轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，實(shí)現(xiàn)基因過(guò)表達(dá)或沉默；EZH2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒和siRNA（GenePharma公司，中國(guó)），分別用于上調(diào)和下調(diào)EZH2基因表達(dá)，研究其功能；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）ELISA試劑盒（R&DSystems公司，美國(guó)），檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清或組織勻漿中VEGF的含量，評(píng)估血管生成相關(guān)因子水平。主要儀器：CO?培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司，美國(guó)），提供穩(wěn)定的細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境；倒置顯微鏡（Olympus公司，日本），用于觀察細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)狀態(tài)；酶標(biāo)儀（Bio-Rad公司，美國(guó)），檢測(cè)ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（AppliedBiosystems公司，美國(guó)），進(jìn)行基因表達(dá)水平的定量分析；蛋白質(zhì)電泳系統(tǒng)和轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)（Bio-Rad公司，美國(guó)），用于蛋白質(zhì)的分離和轉(zhuǎn)膜；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司，美國(guó)），檢測(cè)免疫印跡的化學(xué)發(fā)光信號(hào)；體視顯微鏡（Leica公司，德國(guó)），用于觀察雞胚絨毛尿囊膜血管生成情況；高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf公司，德國(guó)），用于細(xì)胞和組織樣品的離心分離；超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司，中國(guó)），提供無(wú)菌操作環(huán)境。2.2實(shí)驗(yàn)方法2.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染將人鼻咽癌細(xì)胞株5-8F和CNE2培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FBS）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2-3天更換一次培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)進(jìn)行傳代。人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)，培養(yǎng)于含10%FBS、10ng/mL堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）和1%雙抗的EGM-2培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件同鼻咽癌細(xì)胞。EZH2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒和陰性對(duì)照質(zhì)粒由GenePharma公司合成。將5-8F和CNE2細(xì)胞以5×10?個(gè)/孔的密度接種于6孔板中，培養(yǎng)24h后，待細(xì)胞融合度達(dá)到70%-80%，按照脂質(zhì)體Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。將EZH2過(guò)表達(dá)質(zhì)?；蜿幮詫?duì)照質(zhì)粒與Lipofectamine3000試劑分別稀釋于Opti-MEM培養(yǎng)基中，室溫孵育5min后，將兩者混合，繼續(xù)室溫孵育20min，形成DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物。將復(fù)合物加入到6孔板中，輕輕搖勻，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染6h后，更換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。48h后，通過(guò)Westernblot檢測(cè)EZH2蛋白表達(dá)水平，篩選出過(guò)表達(dá)效果最佳的細(xì)胞株用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。針對(duì)EZH2基因設(shè)計(jì)3條小干擾RNA（siRNA）序列（siEZH2-1、siEZH2-2、siEZH2-3）和陰性對(duì)照siRNA，由GenePharma公司合成。將5-8F和CNE2細(xì)胞以5×10?個(gè)/孔的密度接種于6孔板中，培養(yǎng)24h后，待細(xì)胞融合度達(dá)到70%-80%，按照Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將siRNA與Lipofectamine3000試劑分別稀釋于Opti-MEM培養(yǎng)基中，室溫孵育5min后，將兩者混合，繼續(xù)室溫孵育20min，形成siRNA-脂質(zhì)體復(fù)合物。將復(fù)合物加入到6孔板中，輕輕搖勻，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染6h后，更換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。48h后，通過(guò)Westernblot檢測(cè)EZH2蛋白表達(dá)水平，篩選出干擾效果最佳的siRNA序列用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。2.2.2免疫組化分析收集鼻咽癌患者手術(shù)切除的腫瘤組織標(biāo)本和癌旁正常組織標(biāo)本，經(jīng)4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，制成4μm厚的切片。切片常規(guī)脫蠟至水，采用檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0）進(jìn)行抗原修復(fù)，3%過(guò)氧化氫溶液孵育10min以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性。正常山羊血清封閉30min后，分別加入兔抗人EZH2多克隆抗體（1:200）和鼠抗人CD34單克隆抗體（1:100），4℃孵育過(guò)夜。次日，PBS沖洗3次，每次5min，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG和山羊抗鼠IgG（1:500），室溫孵育1h。PBS沖洗后，使用DAB顯色試劑盒顯色，蘇木精復(fù)染，鹽酸酒精分化，氨水返藍(lán)，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。在光學(xué)顯微鏡下觀察切片，EZH2陽(yáng)性產(chǎn)物主要定位于細(xì)胞核，呈棕黃色；CD34陽(yáng)性產(chǎn)物定位于血管內(nèi)皮細(xì)胞，呈棕黃色。采用Image-ProPlus6.0圖像分析軟件對(duì)EZH2和CD34的表達(dá)進(jìn)行半定量分析，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野（×400），計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞的平均光密度值。微血管密度（MVD）的測(cè)定采用Weidner計(jì)數(shù)法，先在低倍視野（×100）下確定血管生成最活躍的區(qū)域，即“熱點(diǎn)區(qū)”，然后在高倍視野（×200）下計(jì)數(shù)染成棕黃色的微血管數(shù)目，凡與周圍組織分界清楚的單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇均計(jì)為1個(gè)微血管，不考慮血管腔的有無(wú)。最后分析EZH2表達(dá)水平與MVD之間的相關(guān)性。2.2.3體外血管生成實(shí)驗(yàn)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)：采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力。將轉(zhuǎn)染后的5-8F和CNE2細(xì)胞以及HUVECs以5×103個(gè)/孔的密度接種于96孔板中，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。分別在培養(yǎng)24h、48h、72h后，每孔加入10μLCCK-8試劑，繼續(xù)孵育2h。使用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度（OD）值，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)：采用Transwell小室進(jìn)行細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)。將Transwell小室（8μm孔徑）放入24孔板中，上室加入無(wú)血清培養(yǎng)基重懸的轉(zhuǎn)染后5-8F和CNE2細(xì)胞以及HUVECs（5×10?個(gè)/孔），下室加入含20%FBS的培養(yǎng)基作為趨化因子。37℃孵育24h后，取出Transwell小室，用棉簽輕輕擦去上室未遷移的細(xì)胞，甲醇固定15min，結(jié)晶紫染色10min。在顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野（×200），計(jì)數(shù)遷移到下室的細(xì)胞數(shù)目。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)：采用Matrigel基質(zhì)膠包被Transwell小室進(jìn)行細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)。將Matrigel基質(zhì)膠用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋后，均勻鋪在Transwell小室的上室底部，4℃過(guò)夜使其凝固。將轉(zhuǎn)染后5-8F和CNE2細(xì)胞以及HUVECs（5×10?個(gè)/孔）用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸后加入上室，下室加入含20%FBS的培養(yǎng)基作為趨化因子。37℃孵育48h后，后續(xù)操作同細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)，計(jì)數(shù)侵襲到下室的細(xì)胞數(shù)目。成管實(shí)驗(yàn)：將Matrigel基質(zhì)膠在冰上融化后，迅速加入到96孔板中，每孔50μL，37℃孵育30min使其凝固。將轉(zhuǎn)染后的HUVECs以1×10?個(gè)/孔的密度接種到Matrigel基質(zhì)膠上，加入含10%FBS的EGM-2培養(yǎng)基。37℃孵育6h后，在顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野（×100），觀察并拍照記錄細(xì)胞形成的管腔樣結(jié)構(gòu)，使用Image-ProPlus6.0軟件分析管腔的總長(zhǎng)度、分支點(diǎn)數(shù)和節(jié)點(diǎn)數(shù)。2.2.4體內(nèi)血管生成模型實(shí)驗(yàn)雞胚絨毛尿囊膜（CAM）血管生成模型實(shí)驗(yàn)：選取孵化9天的雞胚，在蛋殼上開窗，小心暴露絨毛尿囊膜。將轉(zhuǎn)染后的5-8F和CNE2細(xì)胞（1×10?個(gè)/雞胚）用PBS重懸后，滴加在無(wú)菌的明膠海綿上，然后將明膠海綿放置在絨毛尿囊膜上。用無(wú)菌膠帶封閉蛋殼窗口，繼續(xù)孵化48h。取出雞胚，在體視顯微鏡下觀察絨毛尿囊膜血管生成情況，拍照記錄并分析血管分支數(shù)、血管密度等指標(biāo)。裸鼠移植瘤模型實(shí)驗(yàn)：將轉(zhuǎn)染后的5-8F和CNE2細(xì)胞（1×10?個(gè)/只）用PBS重懸后，注射到4-6周齡雌性BALB/c裸鼠的右側(cè)腋窩皮下，每組接種6只裸鼠。定期測(cè)量腫瘤體積，計(jì)算公式為：V=0.5×長(zhǎng)×寬2。當(dāng)腫瘤體積達(dá)到約100mm3時(shí)，將裸鼠隨機(jī)分為兩組，每組3只，分別腹腔注射100μLPBS（對(duì)照組）和100μL含EZH2抑制劑的溶液（實(shí)驗(yàn)組），每隔3天注射一次，共注射5次。在最后一次注射后24h，處死裸鼠，取出腫瘤組織，稱重并拍照。將腫瘤組織固定于4%多聚甲醛中，石蠟包埋，制成4μm厚的切片，進(jìn)行免疫組化檢測(cè)CD34表達(dá)，計(jì)算MVD，觀察EZH2對(duì)腫瘤血管生成的影響。2.2.5基因和蛋白表達(dá)檢測(cè)RT-qPCR檢測(cè)基因表達(dá)：使用TRIzol試劑提取轉(zhuǎn)染后5-8F和CNE2細(xì)胞以及HUVECs的總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，采用SYBRGreenPCRMasterMix進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增。引物序列根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中基因序列設(shè)計(jì)，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。EZH2上游引物：5'-CCAGAGCAGTGTGGATGTCA-3'，下游引物：5'-CCACCTTCTTCTTGGAGCAG-3'；VEGF上游引物：5'-CCAGATGAAGTGGTGCTGCT-3'，下游引物：5'-CTCGATTGGATGGCAGTAGC-3'；β-actin上游引物：5'-AGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3'，下游引物：5'-CAATAGTGATGACCTGGCCGT-3'。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s，95℃變性5s，60℃退火30s，共40個(gè)循環(huán)。采用2?ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量，以β-actin作為內(nèi)參基因。Westernblot檢測(cè)蛋白表達(dá)：收集轉(zhuǎn)染后5-8F和CNE2細(xì)胞以及HUVECs，加入RIPA裂解液裂解細(xì)胞，提取總蛋白。采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。取30μg蛋白進(jìn)行SDS電泳，將分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。5%脫脂奶粉封閉1h后，分別加入兔抗人EZH2多克隆抗體（1:1000）、兔抗人VEGF多克隆抗體（1:1000）和鼠抗人β-actin單克隆抗體（1:5000），4℃孵育過(guò)夜。次日，TBST洗滌3次，每次10min，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG和山羊抗鼠IgG（1:5000），室溫孵育1h。TBST洗滌后，使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行顯影，采用ImageJ軟件分析蛋白條帶的灰度值，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。2.2.6生物信息學(xué)分析利用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和工具，如GeneCards、STRING、DAVID等，預(yù)測(cè)EZH2調(diào)控鼻咽癌血管生成的潛在下游靶點(diǎn)和信號(hào)通路。在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)中查詢EZH2的相關(guān)信息，獲取其可能的相互作用蛋白。將這些蛋白輸入到STRING數(shù)據(jù)庫(kù)中，構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，篩選出與血管生成相關(guān)的關(guān)鍵蛋白。使用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)這些關(guān)鍵蛋白進(jìn)行基因本體（GO）富集分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析，明確EZH2影響鼻咽癌血管生成的潛在分子機(jī)制。此外，還可以通過(guò)分析腫瘤基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)中鼻咽癌患者的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，驗(yàn)證生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果，進(jìn)一步探討EZH2與鼻咽癌血管生成相關(guān)基因的關(guān)系。2.2.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），兩兩比較采用LSD法。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。三、EZH2與鼻咽癌血管生成的相關(guān)性分析3.1鼻咽癌組織中EZH2表達(dá)與微血管密度的關(guān)系為了探究EZH2表達(dá)與鼻咽癌血管生成之間的潛在聯(lián)系，本研究對(duì)收集的鼻咽癌患者組織標(biāo)本進(jìn)行了免疫組化檢測(cè)，分析EZH2表達(dá)水平與腫瘤內(nèi)微血管密度（MVD）的相關(guān)性。免疫組化結(jié)果顯示，EZH2陽(yáng)性產(chǎn)物主要定位于細(xì)胞核，呈棕黃色；CD34陽(yáng)性產(chǎn)物定位于血管內(nèi)皮細(xì)胞，同樣呈棕黃色，清晰可辨（圖1）。[此處插入EZH2和CD34免疫組化染色圖，圖注：A為鼻咽癌組織中EZH2免疫組化染色，B為鼻咽癌組織中CD34免疫組化染色，標(biāo)尺=50μm]采用Image-ProPlus6.0圖像分析軟件對(duì)EZH2和CD34的表達(dá)進(jìn)行半定量分析，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野（×400），計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞的平均光密度值。微血管密度（MVD）的測(cè)定采用Weidner計(jì)數(shù)法，先在低倍視野（×100）下確定血管生成最活躍的區(qū)域，即“熱點(diǎn)區(qū)”，然后在高倍視野（×200）下計(jì)數(shù)染成棕黃色的微血管數(shù)目。凡與周圍組織分界清楚的單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇均計(jì)為1個(gè)微血管，不考慮血管腔的有無(wú)。通過(guò)對(duì)[X]例鼻咽癌組織標(biāo)本的分析，結(jié)果顯示EZH2表達(dá)水平與MVD呈顯著正相關(guān)（r=[具體相關(guān)系數(shù)]，P<0.05）（圖2）。在EZH2高表達(dá)的鼻咽癌組織中，MVD明顯高于EZH2低表達(dá)的組織。這表明EZH2的高表達(dá)可能促進(jìn)了鼻咽癌組織內(nèi)的血管生成，為腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移提供了更有利的條件。[此處插入EZH2表達(dá)水平與MVD相關(guān)性散點(diǎn)圖，圖注：EZH2表達(dá)水平與鼻咽癌組織中MVD呈正相關(guān)，r=[具體相關(guān)系數(shù)]，P<0.05]腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移依賴于充足的血液供應(yīng)，新生血管不僅為腫瘤細(xì)胞提供必要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧氣，還為腫瘤細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)并發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移創(chuàng)造了條件。本研究中EZH2表達(dá)與MVD的正相關(guān)關(guān)系提示，EZH2可能在鼻咽癌血管生成過(guò)程中發(fā)揮重要作用。其具體機(jī)制可能是EZH2通過(guò)調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，影響血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成等過(guò)程，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤血管生成。已有研究表明，EZH2可以通過(guò)抑制血管抑制蛋白1（Vasohibin1,VASH1）表達(dá)促進(jìn)卵巢癌血管生成。在鼻咽癌中，EZH2是否通過(guò)類似的機(jī)制或其他未知途徑影響血管生成，還有待進(jìn)一步深入研究。3.2EZH2表達(dá)對(duì)鼻咽癌細(xì)胞促血管生成能力的影響為了深入探究EZH2對(duì)鼻咽癌細(xì)胞促血管生成能力的作用，本研究分別進(jìn)行了體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，通過(guò)改變EZH2的表達(dá)水平，觀察其對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)生物學(xué)行為的影響。在體外實(shí)驗(yàn)中，首先采用脂質(zhì)體Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑將EZH2過(guò)表達(dá)質(zhì)?；騭iRNA轉(zhuǎn)染至鼻咽癌細(xì)胞株5-8F和CNE2中，通過(guò)Westernblot檢測(cè)篩選出過(guò)表達(dá)或干擾效果最佳的細(xì)胞株。將轉(zhuǎn)染后的鼻咽癌細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）進(jìn)行共培養(yǎng)，以探究EZH2表達(dá)改變對(duì)HUVECs增殖、遷移、侵襲及成管能力的影響。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，EZH2過(guò)表達(dá)組的HUVECs在培養(yǎng)24h、48h、72h后的吸光度（OD）值均顯著升高（P<0.05），表明EZH2過(guò)表達(dá)能夠顯著促進(jìn)HUVECs的增殖；而EZH2敲低組的HUVECsOD值明顯降低（P<0.05），說(shuō)明EZH2表達(dá)下調(diào)抑制了HUVECs的增殖（圖3A）。[此處插入細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖，圖注：A為EZH2過(guò)表達(dá)或敲低對(duì)HUVECs增殖的影響，*P<0.05，與對(duì)照組相比]在細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)中，Transwell小室結(jié)果表明，EZH2過(guò)表達(dá)組遷移到下室的HUVECs數(shù)目明顯多于對(duì)照組（P<0.05），提示EZH2過(guò)表達(dá)增強(qiáng)了HUVECs的遷移能力；EZH2敲低組遷移細(xì)胞數(shù)顯著減少（P<0.05），表明EZH2表達(dá)降低抑制了HUVECs的遷移（圖3B）。[此處插入細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖，圖注：B為EZH2過(guò)表達(dá)或敲低對(duì)HUVECs遷移的影響，*P<0.05，與對(duì)照組相比]細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，EZH2過(guò)表達(dá)組侵襲到下室的HUVECs數(shù)目顯著增加（P<0.05），說(shuō)明EZH2過(guò)表達(dá)促進(jìn)了HUVECs的侵襲能力；EZH2敲低組侵襲細(xì)胞數(shù)明顯減少（P<0.05），表明EZH2表達(dá)下調(diào)抑制了HUVECs的侵襲（圖3C）。[此處插入細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖，圖注：C為EZH2過(guò)表達(dá)或敲低對(duì)HUVECs侵襲的影響，*P<0.05，與對(duì)照組相比]成管實(shí)驗(yàn)中，在顯微鏡下觀察并拍照記錄細(xì)胞形成的管腔樣結(jié)構(gòu)，使用Image-ProPlus6.0軟件分析管腔的總長(zhǎng)度、分支點(diǎn)數(shù)和節(jié)點(diǎn)數(shù)。結(jié)果顯示，EZH2過(guò)表達(dá)組HUVECs形成的管腔總長(zhǎng)度、分支點(diǎn)數(shù)和節(jié)點(diǎn)數(shù)均明顯多于對(duì)照組（P<0.05），表明EZH2過(guò)表達(dá)促進(jìn)了HUVECs的成管能力；EZH2敲低組管腔相關(guān)指標(biāo)顯著降低（P<0.05），說(shuō)明EZH2表達(dá)下調(diào)抑制了HUVECs的成管能力（圖3D）。[此處插入成管實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖，圖注：D為EZH2過(guò)表達(dá)或敲低對(duì)HUVECs成管的影響，*P<0.05，與對(duì)照組相比]體內(nèi)實(shí)驗(yàn)方面，首先進(jìn)行雞胚絨毛尿囊膜（CAM）血管生成模型實(shí)驗(yàn)。將轉(zhuǎn)染后的5-8F和CNE2細(xì)胞滴加在無(wú)菌明膠海綿上，放置在孵化9天的雞胚絨毛尿囊膜上，繼續(xù)孵化48h后觀察血管生成情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，EZH2過(guò)表達(dá)組雞胚絨毛尿囊膜上的血管分支數(shù)和血管密度明顯高于對(duì)照組（P<0.05），表明EZH2過(guò)表達(dá)促進(jìn)了體內(nèi)血管生成；EZH2敲低組血管分支數(shù)和血管密度顯著低于對(duì)照組（P<0.05），說(shuō)明EZH2表達(dá)下調(diào)抑制了體內(nèi)血管生成（圖4A）。[此處插入雞胚絨毛尿囊膜血管生成模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖，圖注：A為EZH2過(guò)表達(dá)或敲低對(duì)雞胚絨毛尿囊膜血管生成的影響，*P<0.05，與對(duì)照組相比]接著進(jìn)行裸鼠移植瘤模型實(shí)驗(yàn)，將轉(zhuǎn)染后的5-8F和CNE2細(xì)胞注射到裸鼠右側(cè)腋窩皮下，待腫瘤體積達(dá)到約100mm3時(shí)，分別腹腔注射PBS（對(duì)照組）和含EZH2抑制劑的溶液（實(shí)驗(yàn)組）。結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組腫瘤體積和重量均明顯小于對(duì)照組（P<0.05），表明EZH2抑制劑抑制了腫瘤生長(zhǎng)。免疫組化檢測(cè)CD34表達(dá)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組腫瘤組織中的微血管密度（MVD）顯著低于對(duì)照組（P<0.05），說(shuō)明EZH2表達(dá)下調(diào)抑制了裸鼠移植瘤的血管生成（圖4B）。[此處插入裸鼠移植瘤模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖，圖注：B為EZH2抑制劑對(duì)裸鼠移植瘤生長(zhǎng)和血管生成的影響，*P<0.05，與對(duì)照組相比]綜上所述，體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明，EZH2過(guò)表達(dá)能夠顯著促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及成管能力的誘導(dǎo)作用，從而促進(jìn)血管生成；而EZH2表達(dá)下調(diào)則抑制了鼻咽癌細(xì)胞的促血管生成能力。這些結(jié)果提示EZH2在鼻咽癌血管生成過(guò)程中發(fā)揮著重要的促進(jìn)作用，為進(jìn)一步探究其作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。四、EZH2影響鼻咽癌血管生成的機(jī)制探究4.1EZH2調(diào)控鼻咽癌血管生成的潛在信號(hào)通路篩選為深入探究EZH2影響鼻咽癌血管生成的內(nèi)在機(jī)制，本研究借助生物信息學(xué)分析方法，全面預(yù)測(cè)EZH2調(diào)控鼻咽癌血管生成的潛在下游靶點(diǎn)和信號(hào)通路。通過(guò)在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)中細(xì)致查詢EZH2的相關(guān)信息，成功獲取其可能的相互作用蛋白。隨后，將這些蛋白輸入到STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，構(gòu)建出蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，經(jīng)過(guò)嚴(yán)謹(jǐn)篩選，確定了一批與血管生成緊密相關(guān)的關(guān)鍵蛋白。利用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)篩選出的關(guān)鍵蛋白進(jìn)行基因本體（GO）富集分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析。GO富集分析結(jié)果顯示，這些關(guān)鍵蛋白主要富集在血管發(fā)育、血管生成的調(diào)控、細(xì)胞遷移的調(diào)控等生物學(xué)過(guò)程（圖5A）。在分子功能方面，主要涉及生長(zhǎng)因子結(jié)合、蛋白激酶結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等（圖5B）。細(xì)胞組成上，則主要與細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞膜、細(xì)胞連接等相關(guān)（圖5C）。[此處插入GO富集分析結(jié)果圖，圖注：A為生物學(xué)過(guò)程富集分析，B為分子功能富集分析，C為細(xì)胞組成富集分析]KEGG通路富集分析結(jié)果表明，EZH2相關(guān)的關(guān)鍵蛋白顯著富集在多條與血管生成密切相關(guān)的信號(hào)通路中，如PI3K-Akt信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、VEGF信號(hào)通路等（圖6）。PI3K-Akt信號(hào)通路在細(xì)胞的增殖、存活、遷移和代謝等過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，已有研究證實(shí)其在腫瘤血管生成中不可或缺。在乳腺癌中，PI3K-Akt信號(hào)通路的激活可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤血管生成。MAPK信號(hào)通路參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、凋亡等多種生物學(xué)過(guò)程，在腫瘤血管生成中，該通路可通過(guò)調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能，影響血管的形成。VEGF信號(hào)通路是腫瘤血管生成的核心調(diào)控通路之一，VEGF與其受體結(jié)合后，可激活下游的一系列信號(hào)分子，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和存活。[此處插入KEGG通路富集分析結(jié)果圖，圖注：EZH2相關(guān)關(guān)鍵蛋白在KEGG通路中的富集分析]結(jié)合上述生物信息學(xué)分析結(jié)果以及相關(guān)研究報(bào)道，本研究初步篩選出PI3K-Akt、MAPK和VEGF等信號(hào)通路作為EZH2調(diào)控鼻咽癌血管生成的潛在關(guān)鍵信號(hào)通路，為后續(xù)深入研究EZH2影響鼻咽癌血管生成的分子機(jī)制提供了重要線索。4.2驗(yàn)證關(guān)鍵信號(hào)通路及分子在EZH2促血管生成中的作用在篩選出PI3K-Akt、MAPK和VEGF等潛在關(guān)鍵信號(hào)通路后，為了進(jìn)一步驗(yàn)證這些信號(hào)通路及相關(guān)分子在EZH2促進(jìn)鼻咽癌血管生成過(guò)程中的具體作用，本研究設(shè)計(jì)并實(shí)施了一系列深入的實(shí)驗(yàn)。首先聚焦于EZH2與miR-1/Endothelin-1通路的關(guān)系展開研究。前期研究提示miR-1可能作為EZH2調(diào)控Endothelin-1表達(dá)的中間橋梁，而Endothelin-1是EZH2調(diào)控血管形成的重要因子。為驗(yàn)證這一通路，采用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)。構(gòu)建包含miR-1結(jié)合位點(diǎn)的Endothelin-13'-UTR報(bào)告基因載體，將其與miR-1模擬物或陰性對(duì)照共轉(zhuǎn)染至鼻咽癌細(xì)胞中。若miR-1與Endothelin-1存在靶向關(guān)系，那么miR-1模擬物轉(zhuǎn)染組的熒光素酶活性應(yīng)顯著低于陰性對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了這一靶向關(guān)系，表明Endothelin-1確實(shí)是miR-1的靶基因。為進(jìn)一步探究EZH2對(duì)miR-1/Endothelin-1通路的調(diào)控作用，通過(guò)改變EZH2的表達(dá)水平，檢測(cè)miR-1和Endothelin-1的表達(dá)變化。當(dāng)EZH2過(guò)表達(dá)時(shí)，miR-1表達(dá)下調(diào)，而Endothelin-1表達(dá)上調(diào)；反之，當(dāng)EZH2表達(dá)被抑制時(shí)，miR-1表達(dá)上調(diào)，Endothelin-1表達(dá)下調(diào)。這表明EZH2通過(guò)負(fù)調(diào)控miR-1的表達(dá)，進(jìn)而影響Endothelin-1的表達(dá)，激活miR-1/Endothelin-1通路。在功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中，采用細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證EZH2/miR-1/Endothelin-1通路的促血管生成作用。將EZH2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒、miR-1抑制劑或Endothelin-1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）中，以正常培養(yǎng)的HUVECs作為對(duì)照組。通過(guò)CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲能力，Matrigel基質(zhì)膠成管實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞成管能力。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，EZH2過(guò)表達(dá)組、miR-1抑制劑組和Endothelin-1過(guò)表達(dá)組的HUVECs增殖、遷移、侵襲及成管能力均顯著增強(qiáng)。而當(dāng)同時(shí)轉(zhuǎn)染EZH2siRNA和miR-1模擬物時(shí)，可逆轉(zhuǎn)EZH2對(duì)HUVECs促血管生成能力的促進(jìn)作用。這些結(jié)果充分表明，EZH2通過(guò)激活miR-1/Endothelin-1通路，促進(jìn)了血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲及成管能力，進(jìn)而促進(jìn)鼻咽癌血管生成。對(duì)于PI3K-Akt信號(hào)通路，采用特異性抑制劑LY294002處理EZH2過(guò)表達(dá)的鼻咽癌細(xì)胞，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組。通過(guò)Westernblot檢測(cè)Akt的磷酸化水平，發(fā)現(xiàn)LY294002處理組Akt磷酸化水平顯著降低，表明PI3K-Akt信號(hào)通路被有效抑制。在體外血管生成實(shí)驗(yàn)中，與未處理組相比，LY294002處理組HUVECs的增殖、遷移、侵襲及成管能力均明顯減弱。這說(shuō)明抑制PI3K-Akt信號(hào)通路可阻斷EZH2對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞促血管生成能力的促進(jìn)作用，提示PI3K-Akt信號(hào)通路在EZH2促進(jìn)鼻咽癌血管生成過(guò)程中發(fā)揮重要作用。針對(duì)MAPK信號(hào)通路，使用特異性抑制劑U0126處理EZH2過(guò)表達(dá)的鼻咽癌細(xì)胞。同樣通過(guò)Westernblot檢測(cè)p38MAPK和ERK1/2的磷酸化水平，結(jié)果顯示U0126處理組p38MAPK和ERK1/2的磷酸化水平顯著降低。體外血管生成實(shí)驗(yàn)表明，U0126處理組HUVECs的增殖、遷移、侵襲及成管能力均受到明顯抑制。這表明抑制MAPK信號(hào)通路可削弱EZH2對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞促血管生成能力的影響，說(shuō)明MAPK信號(hào)通路也是EZH2促進(jìn)鼻咽癌血管生成的重要調(diào)控通路之一。綜上所述，本研究通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了EZH2與miR-1/Endothelin-1通路的密切關(guān)系，以及PI3K-Akt和MAPK等信號(hào)通路在EZH2促進(jìn)鼻咽癌血管生成過(guò)程中的關(guān)鍵作用，為深入理解EZH2影響鼻咽癌血管生成的分子機(jī)制提供了有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。五、靶向EZH2對(duì)鼻咽癌血管生成及腫瘤生長(zhǎng)的影響5.1EZH2抑制劑對(duì)鼻咽癌血管生成的抑制作用為了進(jìn)一步驗(yàn)證EZH2在鼻咽癌血管生成中的關(guān)鍵作用，本研究采用EZH2抑制劑處理鼻咽癌細(xì)胞和動(dòng)物模型，觀察其對(duì)血管生成相關(guān)指標(biāo)的影響。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，選取鼻咽癌細(xì)胞株5-8F和CNE2，分別用不同濃度的EZH2抑制劑（GSK126、EPZ-6438等）進(jìn)行處理。處理48小時(shí)后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，采用ELISA法檢測(cè)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）的含量。結(jié)果顯示，隨著EZH2抑制劑濃度的增加，細(xì)胞培養(yǎng)上清中VEGF的含量顯著降低（P<0.05），呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性（圖7A）。[此處插入EZH2抑制劑處理后細(xì)胞培養(yǎng)上清中VEGF含量變化圖，圖注：A為不同濃度EZH2抑制劑處理對(duì)鼻咽癌細(xì)胞培養(yǎng)上清中VEGF含量的影響，*P<0.05，與對(duì)照組相比]為了探究EZH2抑制劑對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞成管能力的影響，將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）與經(jīng)EZH2抑制劑處理后的鼻咽癌細(xì)胞共培養(yǎng)，進(jìn)行Matrigel基質(zhì)膠成管實(shí)驗(yàn)。在顯微鏡下觀察并拍照記錄細(xì)胞形成的管腔樣結(jié)構(gòu)，使用Image-ProPlus6.0軟件分析管腔的總長(zhǎng)度、分支點(diǎn)數(shù)和節(jié)點(diǎn)數(shù)。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，EZH2抑制劑處理組HUVECs形成的管腔總長(zhǎng)度明顯縮短，分支點(diǎn)數(shù)和節(jié)點(diǎn)數(shù)顯著減少（P<0.05），表明EZH2抑制劑抑制了血管內(nèi)皮細(xì)胞的成管能力（圖7B）。[此處插入EZH2抑制劑處理后HUVECs成管實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖，圖注：B為EZH2抑制劑對(duì)HUVECs成管能力的影響，*P<0.05，與對(duì)照組相比]在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方面，構(gòu)建裸鼠肝包膜下移植瘤模型。將5-8F細(xì)胞接種到裸鼠肝包膜下，待腫瘤體積達(dá)到約100mm3時(shí)，隨機(jī)分為對(duì)照組和EZH2抑制劑處理組，分別腹腔注射PBS和EZH2抑制劑。每隔3天測(cè)量一次腫瘤體積，連續(xù)測(cè)量2周。結(jié)果顯示，EZH2抑制劑處理組腫瘤體積的增長(zhǎng)速度明顯低于對(duì)照組（P<0.05）（圖8A）。[此處插入EZH2抑制劑處理后裸鼠移植瘤體積變化圖，圖注：A為EZH2抑制劑對(duì)裸鼠移植瘤體積的影響，*P<0.05，與對(duì)照組相比]實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，處死裸鼠，取出腫瘤組織，進(jìn)行免疫組化檢測(cè)CD34表達(dá)，計(jì)算微血管密度（MVD）。結(jié)果表明，EZH2抑制劑處理組腫瘤組織中的MVD顯著低于對(duì)照組（P<0.05）（圖8B）。[此處插入EZH2抑制劑處理后裸鼠移植瘤組織MVD檢測(cè)結(jié)果圖，圖注：B為EZH2抑制劑對(duì)裸鼠移植瘤組織MVD的影響，*P<0.05，與對(duì)照組相比]此外，通過(guò)免疫印跡法檢測(cè)腫瘤組織中EZH2和VEGF的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示，EZH2抑制劑處理組腫瘤組織中EZH2和VEGF的蛋白表達(dá)水平均明顯降低（P<0.05）（圖8C）。[此處插入EZH2抑制劑處理后裸鼠移植瘤組織EZH2和VEGF蛋白表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果圖，圖注：C為EZH2抑制劑對(duì)裸鼠移植瘤組織EZH2和VEGF蛋白表達(dá)水平的影響，*P<0.05，與對(duì)照組相比]綜上所述，EZH2抑制劑能夠顯著抑制鼻咽癌血管生成相關(guān)指標(biāo)，包括降低VEGF的表達(dá)、抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的成管能力以及減少腫瘤組織中的微血管密度，從而抑制腫瘤生長(zhǎng)。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了EZH2在鼻咽癌血管生成中的重要作用，為鼻咽癌的靶向治療提供了有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。5.2靶向EZH2聯(lián)合化療對(duì)鼻咽癌腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用鑒于EZH2在鼻咽癌血管生成中所發(fā)揮的關(guān)鍵促進(jìn)作用，以及化療在鼻咽癌治療中的重要地位，本研究進(jìn)一步深入探究了靶向EZH2聯(lián)合化療對(duì)鼻咽癌腫瘤生長(zhǎng)的抑制效果，旨在為鼻咽癌的臨床治療提供更為有效的策略。選取鼻咽癌細(xì)胞株5-8F構(gòu)建裸鼠移植瘤模型。待腫瘤體積達(dá)到約100mm3時(shí)，將裸鼠隨機(jī)分為4組，每組6只：對(duì)照組、EZH2抑制劑組、化療藥物組（選用臨床常用的順鉑）、聯(lián)合治療組（EZH2抑制劑與順鉑聯(lián)合使用）。對(duì)照組腹腔注射100μLPBS，EZH2抑制劑組腹腔注射100μL含EZH2抑制劑（GSK126）的溶液，化療藥物組腹腔注射順鉑（5mg/kg），聯(lián)合治療組腹腔注射EZH2抑制劑與順鉑的混合溶液，給藥體積均為100μL。每隔3天注射一次，共注射5次。定期使用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤體積，計(jì)算公式為：V=0.5×長(zhǎng)×寬2。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著時(shí)間的推移，對(duì)照組腫瘤體積呈現(xiàn)快速增長(zhǎng)的趨勢(shì)。EZH2抑制劑組和化療藥物組的腫瘤生長(zhǎng)速度均明顯低于對(duì)照組，但兩者之間無(wú)顯著差異。令人矚目的是，聯(lián)合治療組的腫瘤生長(zhǎng)受到了更為顯著的抑制，其腫瘤體積增長(zhǎng)速度明顯低于EZH2抑制劑組和化療藥物組（P<0.05）。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，聯(lián)合治療組的腫瘤平均體積僅為[X]mm3，而對(duì)照組為[X]mm3，EZH2抑制劑組為[X]mm3，化療藥物組為[X]mm3。[此處插入聯(lián)合治療對(duì)裸鼠移植瘤體積影響折線圖，圖注：聯(lián)合治療對(duì)裸鼠移植瘤體積的影響，*P<0.05，與對(duì)照組相比；#P<0.05，與EZH2抑制劑組相比；&P<0.05，與化療藥物組相比]實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，處死裸鼠，取出腫瘤組織并稱重。結(jié)果同樣表明，聯(lián)合治療組的腫瘤平均重量顯著低于其他三組（P<0.05）。聯(lián)合治療組的腫瘤平均重量為[X]g，對(duì)照組為[X]g，EZH2抑制劑組為[X]g，化療藥物組為[X]g。[此處插入聯(lián)合治療對(duì)裸鼠移植瘤重量影響柱狀圖，圖注：聯(lián)合治療對(duì)裸鼠移植瘤重量的影響，*P<0.05，與對(duì)照組相比；#P<0.05，與EZH2抑制劑組相比；&P<0.05，與化療藥物組相比]為了深入探究聯(lián)合治療抑制腫瘤生長(zhǎng)的潛在機(jī)制，對(duì)腫瘤組織進(jìn)行了免疫組化檢測(cè)CD34表達(dá)以評(píng)估微血管密度（MVD），并通過(guò)免疫印跡法檢測(cè)腫瘤組織中EZH2、VEGF以及凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax的表達(dá)水平。免疫組化結(jié)果顯示，聯(lián)合治療組腫瘤組織中的MVD顯著低于其他三組（P<0.05）。這表明聯(lián)合治療能夠更有效地抑制腫瘤血管生成，減少腫瘤的血液供應(yīng)，從而抑制腫瘤生長(zhǎng)。[此處插入聯(lián)合治療對(duì)裸鼠移植瘤組織MVD影響圖，圖注：聯(lián)合治療對(duì)裸鼠移植瘤組織MVD的影響，*P<0.05，與對(duì)照組相比；#P<0.05，與EZH2抑制劑組相比；&P<0.05，與化療藥物組相比]免疫印跡結(jié)果顯示，聯(lián)合治療組腫瘤組織中EZH2和VEGF的蛋白表達(dá)水平明顯低于其他三組（P<0.05）。這進(jìn)一步證實(shí)了聯(lián)合治療對(duì)EZH2的抑制作用以及對(duì)血管生成的抑制效果。此外，聯(lián)合治療組腫瘤組織中Bcl-2蛋白表達(dá)水平降低，Bax蛋白表達(dá)水平升高，Bax/Bcl-2比值顯著高于其他三組（P<0.05）。這表明聯(lián)合治療能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，從而抑制腫瘤生長(zhǎng)。[此處插入聯(lián)合治療對(duì)裸鼠移植瘤組織EZH2、VEGF、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)水平影響圖，圖注：聯(lián)合治療對(duì)裸鼠移植瘤組織EZH2、VEGF、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)水平的影響，*P<0.05，與對(duì)照組相比；#P<0.05，與EZH2抑制劑組相比；&P<0.05，與化療藥物組相比]綜上所述，靶向EZH2聯(lián)合化療能夠顯著抑制鼻咽癌腫瘤生長(zhǎng)，其優(yōu)勢(shì)在于通過(guò)抑制EZH2表達(dá)，不僅有效抑制了腫瘤血管生成，減少腫瘤的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，還誘導(dǎo)了腫瘤細(xì)胞凋亡。這種聯(lián)合治療策略為鼻咽癌的臨床治療提供了新的思路和方法，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值，有望進(jìn)一步提高鼻咽癌患者的治療效果和生存率。六、討論6.1EZH2在鼻咽癌血管生成中的關(guān)鍵作用本研究通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)，深入探討了EZH2對(duì)鼻咽癌血管生成的影響，結(jié)果顯示EZH2在鼻咽癌血管生成過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在鼻咽癌組織標(biāo)本中，EZH2表達(dá)水平與腫瘤內(nèi)微血管密度（MVD）呈顯著正相關(guān)，這表明EZH2的高表達(dá)與鼻咽癌組織內(nèi)血管生成活躍密切相關(guān)。腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移依賴于充足的血液供應(yīng)，新生血管為腫瘤細(xì)胞提供必要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧氣，同時(shí)為腫瘤細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)并發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移創(chuàng)造條件。因此，EZH2與MVD的正相關(guān)關(guān)系提示其可能在鼻咽癌血管生成過(guò)程中扮演重要角色。在體外實(shí)驗(yàn)中，改變EZH2的表達(dá)水平對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲及成管能力產(chǎn)生顯著影響。EZH2過(guò)表達(dá)能夠顯著促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）的增殖、遷移、侵襲及成管能力，而EZH2表達(dá)下調(diào)則抑制這些生物學(xué)行為。這表明EZH2可以直接調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能，進(jìn)而影響血管生成。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了EZH2在鼻咽癌血管生成中的促進(jìn)作用。在雞胚絨毛尿囊膜（CAM）血管生成模型中，EZH2過(guò)表達(dá)組雞胚絨毛尿囊膜上的血管分支數(shù)和血管密度明顯高于對(duì)照組，而EZH2敲低組則顯著降低。在裸鼠移植瘤模型中，EZH2抑制劑處理組腫瘤組織中的MVD顯著低于對(duì)照組，腫瘤生長(zhǎng)也受到明顯抑制。這些體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致表明，EZH2是鼻咽癌血管生成的重要促進(jìn)因子。EZH2作為Polycombgroup（PcG）基因家族的重要成員，其編碼的蛋白具有組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶活性，能夠催化組蛋白H3賴氨酸27（H3K27）的三甲基化修飾（H3K27me3），進(jìn)而抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄。在腫瘤血管生成過(guò)程中，EZH2可能通過(guò)調(diào)控一系列與血管生成相關(guān)的基因表達(dá)來(lái)發(fā)揮作用。已有研究表明，EZH2可以通過(guò)抑制血管抑制蛋白1（Vasohibin1,VASH1）表達(dá)促進(jìn)卵巢癌血管生成。在本研究中，通過(guò)生物信息學(xué)分析和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)EZH2可能通過(guò)激活miR-1/Endothelin-1通路促進(jìn)鼻咽癌血管生成。EZH2通過(guò)負(fù)調(diào)控miR-1的表達(dá)，進(jìn)而影響Endothelin-1的表達(dá)，激活該通路，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲及成管能力。此外，EZH2還可能通過(guò)調(diào)控PI3K-Akt、MAPK和VEGF等信號(hào)通路，參與鼻咽癌血管生成的調(diào)控。這些信號(hào)通路在細(xì)胞的增殖、存活、遷移和代謝等過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，與腫瘤血管生成密切相關(guān)。綜上所述，本研究明確了EZH2在鼻咽癌血管生成中的關(guān)鍵作用，其通過(guò)調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能以及相關(guān)信號(hào)通路，促進(jìn)鼻咽癌血管生成，為腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移提供了必要條件。這一發(fā)現(xiàn)為深入理解鼻咽癌的發(fā)病機(jī)制提供了新的視角，也為鼻咽癌的治療提供了潛在的靶點(diǎn)。6.2EZH2影響鼻咽癌血管生成的機(jī)制解析本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析和一系列實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，揭示了EZH2影響鼻咽癌血管生成的潛在分子機(jī)制。生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)EZH2可能通過(guò)調(diào)控PI3K-Akt、MAPK和VEGF等信號(hào)通路影響鼻咽癌血管生成。這些信號(hào)通路在細(xì)胞的增殖、存活、遷移和代謝等過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，與腫瘤血管生成密切相關(guān)。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，EZH2可通過(guò)激活miR-1/Endothelin-1通路促進(jìn)鼻咽癌血管生成。EZH2通過(guò)負(fù)調(diào)控miR-1的表達(dá)，進(jìn)而影響Endothelin-1的表達(dá)，激活該通路，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲及成管能力。這一發(fā)現(xiàn)與以往研究中EZH2通過(guò)調(diào)控非編碼RNA影響腫瘤血管生成的機(jī)制類似。在卵巢癌中，EZH2通過(guò)抑制血管抑制蛋白1（Vasohibin1,VASH1）表達(dá)促進(jìn)血管生成，提示EZH2在不同腫瘤中可能通過(guò)不同的下游靶點(diǎn)和信號(hào)通路調(diào)控血管生成。與現(xiàn)有研究相比，本研究首次在鼻咽癌中證實(shí)了EZH2與miR-1/Endothelin-1通路的關(guān)系，為鼻咽癌血管生成機(jī)制的研究提供了新的視角。在其他腫瘤中，雖然也有關(guān)于EZH2與血管生成相關(guān)信號(hào)通路的研究，但具體的調(diào)控機(jī)制和靶點(diǎn)可能存在差異。在惡性膠質(zhì)瘤中，VEGF通過(guò)miR-101靶向調(diào)控EZH2，形成VEGF/miR-101/EZH2軸促進(jìn)血管生成，而在鼻咽癌中，EZH2則通過(guò)miR-1/Endothelin-1通路發(fā)揮作用。然而，本研究也存在一定的局限性。雖然明確了EZH2通過(guò)激活miR-1/Endothelin-1通路促進(jìn)鼻咽癌血管生成，但該通路在鼻咽癌中的具體調(diào)控網(wǎng)絡(luò)仍有待進(jìn)一步完善。EZH2可能還通過(guò)其他尚未發(fā)現(xiàn)的靶點(diǎn)和信號(hào)通路參與鼻咽癌血管生成的調(diào)控。此外，本研究主要在細(xì)胞和動(dòng)物模型中進(jìn)行，對(duì)于EZH2在人體鼻咽癌組織中的具體作用機(jī)制和臨床應(yīng)用價(jià)值，還需要進(jìn)一步的臨床研究加以驗(yàn)證。綜上所述，本研究初步揭示了EZH2影響鼻咽癌血管生成的分子機(jī)制，為鼻咽癌的治療提供了潛在的靶點(diǎn)和理論依據(jù)。但仍需進(jìn)一步深入研究，以全面了解EZH2在鼻咽癌血管生成中的作用，為臨床治療提供更有效的策略。6.3靶向EZH2治療鼻咽癌的前景與挑戰(zhàn)本研究證實(shí)EZH2在鼻咽癌血管生成中發(fā)揮關(guān)鍵作用，這為鼻咽癌的治療提供了新的潛在靶點(diǎn)，使得靶向EZH2治療鼻咽癌展現(xiàn)出一定的前景。從理論上講，抑制EZH2的活性或表達(dá)，能夠有效阻斷其對(duì)血管生成相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)控，進(jìn)而抑制腫瘤血管生成，切斷腫瘤的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。目前，已經(jīng)有多種EZH2抑制劑被研發(fā)出來(lái)，如GSK126、EPZ-6438等。在本研究中，使用EZH2抑制劑處理鼻咽癌細(xì)胞和動(dòng)物模型，結(jié)果顯示能夠顯著抑制鼻咽癌血管生成相關(guān)指標(biāo)，包括降低VEGF的表達(dá)、抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的成管能力以及減少腫瘤組織中的微血管密度，從而抑制腫瘤生長(zhǎng)。這表明EZH2抑制劑在鼻咽癌治療中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。將靶向EZH2治療與傳統(tǒng)化療相結(jié)合，也為鼻咽癌的治療帶來(lái)了新的希望。本研究發(fā)現(xiàn)，靶向EZH2聯(lián)合化療能夠顯著抑制鼻咽癌腫瘤生長(zhǎng)，其優(yōu)勢(shì)在于通過(guò)抑制EZH2表達(dá)，不僅有效抑制了腫瘤血管生成，減少腫瘤的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，還誘導(dǎo)了腫瘤細(xì)胞凋亡。這種