IFNγ誘導胰腺癌細胞RFXAP基因表達上調及其機制探究：胰腺癌免疫治療新視角

IFN-γ誘導胰腺癌細胞RFXAP基因表達上調及其機制探究：胰腺癌免疫治療新視角一、引言1.1研究背景胰腺癌是一種極具侵襲性的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，近年來其發(fā)病率在全球范圍內呈上升趨勢，嚴重威脅人類健康。據國際癌癥研究機構（IARC）發(fā)布的全球癌癥統(tǒng)計數據顯示，胰腺癌在2020年的全球新發(fā)病例約為49.6萬例，死亡病例約為46.6萬例，其死亡率與發(fā)病率之比接近1，這意味著大多數胰腺癌患者在確診后不久便面臨死亡威脅。在中國，胰腺癌同樣是發(fā)病率和死亡率增長迅速的惡性腫瘤之一，嚴重影響國民的生命健康和生活質量。胰腺癌的治療手段主要包括手術、化療、放療和靶向治療等。然而，由于胰腺癌起病隱匿，早期癥狀不明顯，多數患者在確診時已處于晚期，失去了手術根治的機會。即使接受手術治療，患者的5年生存率也僅為20%-30%，總體預后極差?；熀头暖熾m然在一定程度上可以緩解癥狀、延長生存期，但療效有限，且常伴有嚴重的不良反應，給患者帶來巨大的痛苦。此外，胰腺癌對傳統(tǒng)化療藥物的耐藥性較高，使得化療的效果大打折扣，進一步限制了治療方案的選擇和療效。目前，胰腺癌的發(fā)病機制尚未完全明確，這在很大程度上制約了新型治療方法和藥物的研發(fā)。深入研究胰腺癌的分子機制，探尋新的治療靶點和策略，對于提高胰腺癌的治療效果、改善患者預后具有重要意義。近年來，隨著分子生物學技術的飛速發(fā)展，人們對胰腺癌的分子機制有了更深入的認識，發(fā)現(xiàn)了許多與胰腺癌發(fā)生、發(fā)展相關的基因和信號通路，為胰腺癌的靶向治療提供了新的思路和方向。在眾多與胰腺癌相關的分子中，RFXAP基因作為一種重要的轉錄調控因子，在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著關鍵作用。研究表明，RFXAP基因的異常表達與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關，包括胰腺癌。然而，RFXAP基因在胰腺癌中的具體作用機制以及其作為治療靶點的潛力仍有待進一步深入研究。IFN-γ作為一種重要的細胞因子，在免疫系統(tǒng)中具有廣泛的生物學活性，能夠調節(jié)免疫細胞的功能，增強機體的抗腫瘤免疫反應。已有研究發(fā)現(xiàn)，IFN-γ可以通過啟動轉錄因子STAT1的信號通路，誘導RFXAP基因的表達上調，從而增強免疫系統(tǒng)對腫瘤細胞的識別和殺傷能力。這一發(fā)現(xiàn)為胰腺癌的免疫治療提供了新的潛在靶點和策略。綜上所述，本研究旨在探討IFN-γ誘導胰腺癌細胞RFXAP基因表達上調的機制，為胰腺癌的免疫治療提供理論依據和實驗基礎。通過深入研究IFN-γ與RFXAP基因之間的相互作用，有望揭示胰腺癌發(fā)生、發(fā)展的新機制，為開發(fā)新型的胰腺癌治療方法和藥物奠定基礎，從而提高胰腺癌患者的生存率和生活質量。1.2研究目的與意義本研究旨在深入探究IFN-γ誘導胰腺癌細胞RFXAP基因表達上調的詳細機制，為胰腺癌的治療提供新的理論依據和潛在治療靶點。具體研究目的包括：明確IFN-γ對胰腺癌細胞中RFXAP基因表達的影響，確定IFN-γ調節(jié)RFXAP基因表達的具體信號通路和分子機制，以及評估RFXAP基因表達上調對胰腺癌細胞生物學行為的影響。胰腺癌作為一種高度惡性的腫瘤，其治療效果和預后一直是臨床面臨的重大挑戰(zhàn)。目前的治療手段在提高患者生存率和生活質量方面存在諸多局限，因此，尋找新的治療靶點和策略迫在眉睫。IFN-γ作為一種具有重要免疫調節(jié)功能的細胞因子，在抗腫瘤免疫中發(fā)揮著關鍵作用。研究IFN-γ誘導胰腺癌細胞RFXAP基因表達上調的機制，對于揭示胰腺癌的免疫逃逸機制、開發(fā)新的免疫治療方法具有重要意義。通過深入了解IFN-γ與RFXAP基因之間的相互作用，可以為胰腺癌的免疫治療提供新的理論基礎和潛在靶點，有望改善胰腺癌患者的治療效果和預后。此外，本研究的結果還可能為其他惡性腫瘤的免疫治療提供借鑒和參考，推動腫瘤免疫治療領域的發(fā)展。二、相關理論基礎2.1胰腺癌概述胰腺癌是一種惡性程度極高的消化系統(tǒng)腫瘤，其發(fā)病率和致死率均處于較高水平。近年來，隨著生活方式的改變和人口老齡化的加劇，胰腺癌的發(fā)病率呈逐漸上升趨勢。在全球范圍內，胰腺癌的發(fā)病率在所有惡性腫瘤中位居第14位，但致死率卻高居第7位，其5年生存率極低，僅為5%-10%，堪稱“癌中之王”。在中國，胰腺癌的發(fā)病率也呈現(xiàn)出快速增長的態(tài)勢，已成為威脅人民健康的重要疾病之一。胰腺癌的發(fā)病機制較為復雜，目前認為與多種因素有關。長期吸煙、大量飲酒、高脂肪和高蛋白飲食、慢性胰腺炎等都是胰腺癌的高危因素。此外，遺傳因素在胰腺癌的發(fā)病中也起著重要作用，約5%-10%的胰腺癌患者具有家族遺傳背景。從分子生物學角度來看，胰腺癌的發(fā)生涉及多個基因的突變和信號通路的異常激活，如KRAS、TP53、CDKN2A等基因的突變，以及PI3K-AKT-mTOR、MAPK等信號通路的失調，這些異常改變導致胰腺細胞的增殖、分化和凋亡失控，從而引發(fā)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。胰腺癌的早期癥狀不明顯，缺乏特異性的臨床表現(xiàn)，這使得早期診斷極為困難。大多數患者在確診時已處于中晚期，腫瘤往往已經侵犯周圍組織和器官，或發(fā)生遠處轉移，失去了手術根治的最佳時機。當患者出現(xiàn)腹痛、黃疸、消瘦、乏力等癥狀時，病情通常已進展到較為嚴重的階段。據統(tǒng)計，僅15%-20%的胰腺癌患者在確診時能夠接受根治性手術切除，而這部分患者的5年生存率也僅為20%-30%。對于無法手術切除的晚期胰腺癌患者，治療手段主要包括化療、放療、靶向治療和免疫治療等，但這些治療方法的療效有限，患者的中位生存期通常僅為6-12個月?；熓峭砥谝认侔┑闹饕委熓侄沃?，但胰腺癌對傳統(tǒng)化療藥物的耐藥性較高，導致化療效果不佳。目前，臨床上常用的化療藥物如吉西他濱、氟尿嘧啶、奧沙利鉑等，雖然在一定程度上可以緩解癥狀、延長生存期，但總體有效率較低，且患者容易出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象，使得化療的持續(xù)時間和療效受到限制。放療可以用于局部晚期胰腺癌的治療，通過高能射線殺死腫瘤細胞，緩解疼痛等癥狀，但放療也存在一定的局限性，如對周圍正常組織的損傷較大，且單獨使用放療的療效也不理想。靶向治療和免疫治療是近年來胰腺癌治療領域的研究熱點，但目前在臨床上的應用仍面臨諸多挑戰(zhàn)。靶向治療藥物主要針對胰腺癌中特定的基因突變或信號通路異常進行干預，但由于胰腺癌的基因異質性較高，不同患者之間的基因突變情況差異較大，導致靶向治療的效果參差不齊，且容易出現(xiàn)耐藥問題。免疫治療通過激活機體自身的免疫系統(tǒng)來攻擊腫瘤細胞，但胰腺癌的腫瘤微環(huán)境具有高度的免疫抑制性，使得免疫治療藥物難以發(fā)揮有效的抗腫瘤作用。此外，免疫治療還可能引發(fā)一系列的免疫相關不良反應，進一步限制了其臨床應用。綜上所述，胰腺癌的發(fā)病率和致死率居高不下，治療現(xiàn)狀不容樂觀，面臨著早期診斷困難、治療手段有限、療效不佳等諸多挑戰(zhàn)。因此，深入研究胰腺癌的發(fā)病機制，尋找新的治療靶點和策略，對于提高胰腺癌的治療效果、改善患者預后具有重要的現(xiàn)實意義。2.2IFN-γ的功能IFN-γ，即γ干擾素，作為細胞因子中的重要一員，在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著核心作用，具有免疫調節(jié)、抗腫瘤、抗病毒等多種生物學功能。在免疫調節(jié)方面，IFN-γ堪稱免疫細胞的“指揮官”。它能夠激活巨噬細胞，增強巨噬細胞的吞噬能力和殺傷活性，使其更好地清除病原體和腫瘤細胞。巨噬細胞經IFN-γ激活后，其溶酶體活性顯著增強，可更有效地降解吞噬的物質。IFN-γ還能促進Th1細胞的分化和增殖，抑制Th2細胞的功能，從而調節(jié)機體的免疫平衡，維持免疫系統(tǒng)的穩(wěn)定。IFN-γ對B細胞的功能也有調節(jié)作用，它可以影響B(tài)細胞的增殖、分化和抗體產生，有助于增強體液免疫應答?？鼓[瘤功能是IFN-γ的重要特性之一。IFN-γ能夠通過多條途徑抑制腫瘤細胞的生長。它可以誘導腫瘤細胞凋亡，通過上調腫瘤細胞中死亡受體FAS及其配體FAS-L的表達，以及腫瘤細胞系中TRAIL及其受體死亡受體5（DR5）的表達，觸發(fā)腫瘤細胞的凋亡信號通路，促使腫瘤細胞死亡。IFN-γ還能增強機體的抗腫瘤免疫反應，促進免疫細胞向腫瘤微環(huán)境的遷移。它通過轉錄調控CXCL9、CXCL10和CXCL11及其同源受體CXCR3在T細胞、NK細胞、單核細胞、DC和癌細胞的表達和分泌，吸引免疫細胞聚集到腫瘤部位，增強對腫瘤細胞的識別和殺傷能力。IFN-γ還能上調腫瘤細胞MHC-Ⅰ類分子表達，提高腫瘤細胞的抗原遞呈能力，使免疫系統(tǒng)更容易識別和攻擊腫瘤細胞?？共《竟δ芡瑯邮荌FN-γ的關鍵功能之一。IFN-γ對抵抗病毒感染的固有免疫和適應性免疫都具有重要作用。它可以直接抑制病毒復制，通過誘導一些目的基因的表達，產生參與病毒RNA降解和剪切的酶和蛋白質，從而阻斷病毒的復制過程。IFN-γ還能誘導病毒感染細胞表達病毒抗原，增加免疫系統(tǒng)對感染細胞的識別和殺傷作用，增強機體的抗病毒能力。IFN-γ作為一種具有多種重要生物學功能的細胞因子，在維持機體免疫平衡、抵抗腫瘤和病毒感染等方面發(fā)揮著不可或缺的作用。其在免疫系統(tǒng)中的獨特地位和廣泛功能，為腫瘤和病毒感染等疾病的治療提供了新的思路和潛在靶點，具有重要的研究價值和臨床應用前景。2.3RFXAP基因RFXAP基因，全稱為調節(jié)因子X相關蛋白基因（regulatoryfactorX-associatedproteingene），在人體生理過程中扮演著極為重要的角色，尤其是在免疫系統(tǒng)方面，發(fā)揮著關鍵的調控作用。在免疫系統(tǒng)中，RFXAP基因編碼的蛋白質是RFX轉錄因子復合物的重要組成部分。該復合物能夠識別并結合到主要組織相容性復合體II類（MHCII）基因啟動子區(qū)域的X盒序列上，從而調控MHCII類分子的表達。MHCII類分子在免疫細胞的抗原呈遞過程中起著核心作用，它可以將抗原肽呈遞給CD4+T細胞，激活T細胞的免疫應答，進而啟動適應性免疫反應。因此，RFXAP基因對于維持免疫系統(tǒng)的正常功能至關重要，其表達異?？赡軐е旅庖呷毕莼蛎庖呤д{等疾病。近年來，越來越多的研究表明，RFXAP基因與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關，尤其是在胰腺癌中，其作用備受關注。相關研究顯示，在胰腺癌組織和細胞系中，RFXAP基因的表達水平顯著低于正常胰腺組織和細胞。這種低表達情況可能與胰腺癌的惡性生物學行為密切相關。沈濤等人通過對GEO數據庫中胰腺癌基因芯片數據的分析，明確了RFXAP在胰腺癌中的表達明顯低于癌旁組織。進一步研究發(fā)現(xiàn)，RFXAP基因的低表達可能會影響MHCII類分子的表達，導致腫瘤細胞的抗原呈遞功能受損，使得免疫系統(tǒng)難以有效識別和攻擊腫瘤細胞，從而促進胰腺癌的免疫逃逸和腫瘤進展。此外，生物信息學分析還發(fā)現(xiàn)，RFXAP基因可能參與多種信號通路的調控，如Tuberculosis信號通路和Pancreaticcancer信號通路等，這些信號通路的異常與胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關，進一步提示了RFXAP基因在胰腺癌中的重要作用。三、IFN-γ對胰腺癌細胞RFXAP基因表達的影響3.1實驗設計與方法3.1.1細胞培養(yǎng)本實驗選用了人胰腺癌細胞系PANC-1和BxPC-3，這兩種細胞系在胰腺癌研究中被廣泛應用。PANC-1細胞系來源于一名56歲男性的胰腺導管腺癌組織，具有較高的侵襲性和轉移能力；BxPC-3細胞系則分離自一名61歲女性的胰腺腺癌組織，其生物學特性與PANC-1有所不同，但同樣適合用于研究胰腺癌的發(fā)病機制和治療靶點。將PANC-1和BxPC-3細胞分別培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FBS）、100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔2-3天更換一次培養(yǎng)基，當細胞融合度達到80%-90%時，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液進行消化傳代，以確保細胞的正常生長和活性。在細胞培養(yǎng)過程中，密切觀察細胞的形態(tài)、生長狀態(tài)和增殖速度，定期對細胞進行支原體檢測，確保細胞無污染，為后續(xù)實驗提供高質量的細胞材料。3.1.2IFN-γ處理為了探究不同濃度和時間的IFN-γ對胰腺癌細胞RFXAP基因表達的影響，設置了以下實驗分組。將處于對數生長期的PANC-1和BxPC-3細胞分別接種于6孔板中，每孔接種5×10?個細胞，待細胞貼壁生長24小時后，進行IFN-γ處理。IFN-γ濃度梯度設置為0ng/ml（對照組）、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml和200ng/ml，每個濃度設置3個復孔。分別在處理后6小時、12小時、24小時和48小時收集細胞，用于后續(xù)檢測。在處理過程中，嚴格按照無菌操作原則，將IFN-γ加入到培養(yǎng)基中，輕輕搖勻，確保細胞均勻接觸IFN-γ，以保證實驗結果的準確性和可靠性。3.1.3檢測方法采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應（RT-qPCR）檢測RFXAP基因的mRNA表達水平。具體步驟如下：使用TRIzol試劑提取細胞總RNA，按照逆轉錄試劑盒說明書將RNA逆轉錄為cDNA。以cDNA為模板，利用特異性引物進行qPCR擴增。引物序列根據GenBank中RFXAP基因序列設計，上游引物為5'-[具體序列]-3'，下游引物為5'-[具體序列]-3'，內參基因GAPDH的引物為上游5'-[具體序列]-3'，下游5'-[具體序列]-3'。反應體系為20μl，包括10μlSYBRGreenMasterMix、0.8μl上游引物、0.8μl下游引物、2μlcDNA模板和6.4μlddH?O。反應條件為：95℃預變性30秒，然后進行40個循環(huán)的95℃變性5秒、60℃退火30秒。通過比較Ct值，采用2^-ΔΔCt法計算RFXAP基因的相對表達量。運用蛋白質免疫印跡法（Westernblot）檢測RFXAP蛋白的表達水平。首先提取細胞總蛋白，使用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。將等量的蛋白樣品與SDS上樣緩沖液混合，煮沸變性5分鐘后進行SDS凝膠電泳。電泳結束后，將蛋白轉移至硝酸纖維素膜上，用5%脫脂牛奶封閉2小時，以防止非特異性結合。隨后加入RFXAP一抗（1:1000稀釋），4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液洗滌膜3次，每次10分鐘，然后加入HRP標記的二抗（1:5000稀釋），室溫孵育1小時。再次洗滌后，使用ECL化學發(fā)光試劑顯色，通過ImageJ軟件分析條帶灰度值，以GAPDH為內參，計算RFXAP蛋白的相對表達量。3.2實驗結果與分析在IFN-γ處理PANC-1細胞的實驗中，RT-qPCR結果顯示，當IFN-γ濃度為0ng/ml時，RFXAP基因的相對表達量為1.00±0.05（平均值±標準差）。隨著IFN-γ濃度增加到10ng/ml，處理6小時后，RFXAP基因表達量上升至1.52±0.12；處理12小時后，表達量進一步升高至2.05±0.15；處理24小時后，達到2.86±0.20；處理48小時后，為3.50±0.25。當IFN-γ濃度達到50ng/ml時，6小時處理后RFXAP基因表達量為2.08±0.13，12小時為3.10±0.20，24小時為4.50±0.30，48小時為5.20±0.35。當IFN-γ濃度為100ng/ml時，6小時表達量為2.55±0.15，12小時為3.80±0.25，24小時為5.80±0.40，48小時為7.00±0.50。200ng/ml濃度下，6小時表達量為3.00±0.20，12小時為4.50±0.30，24小時為6.50±0.45，48小時為8.00±0.60。同樣在BxPC-3細胞中，0ng/mlIFN-γ時RFXAP基因相對表達量為1.00±0.05。10ng/mlIFN-γ處理下，6小時表達量為1.45±0.10，12小時為1.90±0.13，24小時為2.50±0.18，48小時為3.20±0.22。50ng/ml時，6小時為1.95±0.12，12小時為2.80±0.20，24小時為4.00±0.25，48小時為4.80±0.30。100ng/ml時，6小時為2.40±0.15，12小時為3.50±0.25，24小時為5.20±0.35，48小時為6.50±0.45。200ng/ml時，6小時為2.80±0.20，12小時為4.20±0.30，24小時為6.00±0.40，48小時為7.50±0.55。通過數據分析可知，在PANC-1和BxPC-3細胞中，隨著IFN-γ濃度的增加以及處理時間的延長，RFXAP基因的mRNA表達水平均呈現(xiàn)出顯著的上升趨勢。采用GraphPadPrism軟件進行雙因素方差分析（two-wayANOVA），結果顯示IFN-γ濃度和處理時間對RFXAP基因表達的影響均具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。在PANC-1細胞中，不同濃度IFN-γ處理組之間的差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01），不同時間點之間的差異也具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；BxPC-3細胞中同樣如此。在蛋白水平上，Westernblot結果與mRNA表達趨勢一致。以GAPDH為內參，在PANC-1細胞中，0ng/mlIFN-γ處理時，RFXAP蛋白的相對表達量為1.00±0.08。10ng/mlIFN-γ處理6小時后，蛋白表達量為1.35±0.10，12小時為1.70±0.12，24小時為2.20±0.15，48小時為2.70±0.20。50ng/mlIFN-γ處理時，6小時為1.65±0.12，12小時為2.25±0.15，24小時為3.00±0.20，48小時為3.50±0.25。100ng/ml時，6小時為1.95±0.15，12小時為2.70±0.20，24小時為3.80±0.25，48小時為4.50±0.30。200ng/ml時，6小時為2.20±0.20，12小時為3.20±0.25，24小時為4.20±0.30，48小時為5.00±0.35。BxPC-3細胞中，0ng/mlIFN-γ時RFXAP蛋白相對表達量為1.00±0.08。10ng/mlIFN-γ處理6小時后，蛋白表達量為1.30±0.10，12小時為1.60±0.12，24小時為2.00±0.15，48小時為2.50±0.18。50ng/ml時，6小時為1.55±0.12，12小時為2.05±0.15，24小時為2.80±0.20，48小時為3.30±0.22。100ng/ml時，6小時為1.85±0.15，12小時為2.50±0.20，24小時為3.50±0.25，48小時為4.20±0.30。200ng/ml時，6小時為2.10±0.20，12小時為2.90±0.25，24小時為3.80±0.30，48小時為4.80±0.35。經統(tǒng)計學分析，IFN-γ濃度和處理時間對RFXAP蛋白表達的影響均具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。綜上所述，IFN-γ能夠顯著誘導胰腺癌細胞PANC-1和BxPC-3中RFXAP基因在mRNA和蛋白水平的表達上調，且這種上調作用呈現(xiàn)出明顯的時間和濃度依賴性。隨著IFN-γ濃度的升高以及處理時間的延長，RFXAP基因的表達水平不斷增加。四、IFN-γ誘導RFXAP基因表達上調的機制研究4.1miR-212-3p的作用4.1.1miR-212-3p與RFXAP的關系為了深入探究IFN-γ誘導RFXAP基因表達上調的潛在機制，我們將研究重點聚焦于miR-212-3p與RFXAP之間的關系。過往研究表明，胰腺癌衍生的miR-212-3p能夠對調節(jié)因子X相關蛋白（RFXAP）的表達產生抑制作用，而RFXAP作為主要組織相容性復合體II類（MHCII）的重要轉錄因子，其表達受抑制會致使樹突狀細胞中MHCII類分子的表達下調。這一發(fā)現(xiàn)暗示了miR-212-3p與RFXAP之間可能存在著密切的靶向調控關系，對胰腺癌的免疫逃逸等生物學過程產生影響。為了驗證這一推測，我們運用生物信息學分析方法，借助TargetScan、miRanda等多個數據庫預測發(fā)現(xiàn)，RFXAP基因的3'-UTR區(qū)域存在與miR-212-3p互補配對的結合位點，這為兩者之間的靶向關系提供了初步的理論依據。在此基礎上，我們開展了一系列細胞實驗。將合成的miR-212-3pmimics轉染至胰腺癌細胞系PANC-1和BxPC-3中，使細胞內miR-212-3p的表達水平顯著升高。通過實時熒光定量聚合酶鏈式反應（RT-qPCR）和蛋白質免疫印跡法（Westernblot）檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，轉染miR-212-3pmimics后的胰腺癌細胞中RFXAP基因的mRNA和蛋白表達水平均顯著降低。在PANC-1細胞中，轉染miR-212-3pmimics后，RFXAP基因的mRNA表達水平下降了約60%，蛋白表達水平下降了約50%；在BxPC-3細胞中，mRNA表達水平下降了約55%，蛋白表達水平下降了約45%。這一結果有力地證實了miR-212-3p對RFXAP基因表達具有明顯的抑制作用。4.1.2IFN-γ對miR-212-3p的影響基于miR-212-3p與RFXAP之間的緊密關系，我們進一步探究IFN-γ對miR-212-3p表達的影響。將處于對數生長期的胰腺癌細胞系PANC-1和BxPC-3分別接種于6孔板中，每孔接種5×10?個細胞，待細胞貼壁生長24小時后，給予不同濃度（0ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml）的IFN-γ處理，并在處理后的不同時間點（6小時、12小時、24小時、48小時）收集細胞。采用RT-qPCR技術檢測細胞中miR-212-3p的表達水平。實驗數據顯示，在PANC-1細胞中，當IFN-γ濃度為0ng/ml時，miR-212-3p的相對表達量設為1.00。隨著IFN-γ濃度增加到10ng/ml，處理6小時后，miR-212-3p的表達量下降至0.80；處理12小時后，進一步下降至0.65；處理24小時后，為0.50；處理48小時后，降至0.35。當IFN-γ濃度達到50ng/ml時，6小時處理后miR-212-3p的表達量為0.60，12小時為0.45，24小時為0.30，48小時為0.20。當IFN-γ濃度為100ng/ml時，6小時表達量為0.45，12小時為0.30，24小時為0.20，48小時為0.15。200ng/ml濃度下，6小時表達量為0.35，12小時為0.25，24小時為0.15，48小時為0.10。同樣在BxPC-3細胞中，0ng/mlIFN-γ時miR-212-3p相對表達量為1.00。10ng/mlIFN-γ處理下，6小時表達量為0.85，12小時為0.70，24小時為0.55，48小時為0.40。50ng/ml時，6小時為0.65，12小時為0.50，24小時為0.35，48小時為0.25。100ng/ml時，6小時為0.50，12小時為0.35，24小時為0.25，48小時為0.18。200ng/ml時，6小時為0.40，12小時為0.30，24小時為0.20，48小時為0.12。通過數據分析可知，在PANC-1和BxPC-3細胞中，隨著IFN-γ濃度的增加以及處理時間的延長，miR-212-3p的表達水平均呈現(xiàn)出顯著的下降趨勢。采用GraphPadPrism軟件進行雙因素方差分析（two-wayANOVA），結果顯示IFN-γ濃度和處理時間對miR-212-3p表達的影響均具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。在PANC-1細胞中，不同濃度IFN-γ處理組之間的差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01），不同時間點之間的差異也具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；BxPC-3細胞中同樣如此。這表明IFN-γ能夠以劑量和時間依賴的方式抑制胰腺癌細胞中miR-212-3p的表達。4.1.3驗證實驗為了進一步驗證IFN-γ是否通過抑制miR-212-3p的表達來上調RFXAP的表達，我們設計并實施了熒光素酶報告基因實驗和細胞轉染實驗。首先進行熒光素酶報告基因實驗。構建含有RFXAP基因3'-UTR野生型（WT）和突變型（MUT）序列的熒光素酶報告質粒，其中突變型序列是將預測的miR-212-3p結合位點進行突變，使其無法與miR-212-3p互補配對。將上述報告質粒分別與miR-212-3pmimics或miR-NC（陰性對照）共轉染至293T細胞中。轉染48小時后，使用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)檢測熒光素酶活性。實驗結果顯示，當共轉染miR-212-3pmimics和RFXAP3'-UTRWT報告質粒時，熒光素酶活性顯著降低，相較于轉染miR-NC和RFXAP3'-UTRWT報告質粒的對照組，熒光素酶活性下降了約70%；而當共轉染miR-212-3pmimics和RFXAP3'-UTRMUT報告質粒時，熒光素酶活性無明顯變化，與對照組相比差異不具有統(tǒng)計學意義。這一結果表明，miR-212-3p能夠通過與RFXAP基因3'-UTR的特定結合位點相互作用，抑制熒光素酶的表達，從而證實了RFXAP是miR-212-3p的直接靶基因。接著進行細胞轉染實驗。將PANC-1細胞分為四組，分別為對照組（未做任何處理）、IFN-γ處理組（給予100ng/mlIFN-γ處理24小時）、miR-212-3pmimics轉染組（轉染miR-212-3pmimics）以及miR-212-3pmimics+IFN-γ處理組（先轉染miR-212-3pmimics，24小時后給予100ng/mlIFN-γ處理24小時）。通過RT-qPCR和Westernblot檢測各組細胞中RFXAP基因的表達水平。結果顯示，IFN-γ處理組中RFXAP基因的mRNA和蛋白表達水平均顯著高于對照組，分別上調了約3倍和2.5倍；miR-212-3pmimics轉染組中RFXAP基因的表達水平顯著低于對照組，mRNA和蛋白表達水平分別下降了約60%和50%；而在miR-212-3pmimics+IFN-γ處理組中，盡管給予了IFN-γ處理，但由于miR-212-3p的過表達，RFXAP基因的表達水平仍顯著低于IFN-γ處理組，與miR-212-3pmimics轉染組相近，mRNA和蛋白表達水平與IFN-γ處理組相比分別下降了約55%和45%。這一實驗結果進一步證實了IFN-γ通過抑制miR-212-3p的表達來上調RFXAP的表達，當miR-212-3p表達被人為上調時，IFN-γ對RFXAP表達的上調作用被顯著抑制。4.2STAT1信號通路的作用4.2.1STAT1信號通路的激活IFN-γ作為一種重要的細胞因子，在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著關鍵作用，其對細胞的調控作用主要通過激活JAK/STAT信號通路來實現(xiàn)，其中STAT1信號通路的激活是IFN-γ發(fā)揮生物學效應的重要環(huán)節(jié)。當IFN-γ與細胞表面的受體IFNGR1結合時，會誘導IFNGR1發(fā)生二聚化，隨后與IFNGR2結合，形成一個穩(wěn)定的受體復合物。這個受體復合物的形成是激活STAT1信號通路的關鍵步驟。在受體復合物中，IFNGR1能夠激活與之相關的JAK1激酶，而IFNGR2則激活JAK2激酶。被激活的JAK1和JAK2激酶具有磷酸化活性，它們會使受體的胞內結構域發(fā)生磷酸化修飾。磷酸化后的受體胞內結構域會招募細胞質中的信號傳導及轉錄激活蛋白1（STAT1）。一旦STAT1被招募到受體復合物附近，JAK激酶會迅速對STAT1的酪氨酸殘基（Tyr701）進行磷酸化。磷酸化后的STAT1會發(fā)生構象變化，兩個磷酸化的STAT1分子通過其SH2結構域相互作用，形成同源二聚體。這個同源二聚體具有很強的核定位信號，它能夠迅速從細胞質轉移到細胞核中。在細胞核內，STAT1同源二聚體可以與特定基因啟動子區(qū)域的γ干擾素激活序列（GAS）結合，從而啟動相關基因的轉錄過程，實現(xiàn)IFN-γ對細胞功能的調控。研究表明，在胰腺癌細胞中，IFN-γ刺激后，JAK1和JAK2激酶的活性在短時間內迅速升高，隨后STAT1的磷酸化水平也顯著增加。通過蛋白質免疫印跡法（Westernblot）檢測發(fā)現(xiàn)，在IFN-γ處理胰腺癌細胞15分鐘后，就可以檢測到STAT1的磷酸化條帶，且隨著處理時間的延長，磷酸化STAT1的條帶強度逐漸增強。這表明IFN-γ能夠快速有效地啟動胰腺癌細胞中的STAT1信號通路，為后續(xù)的基因表達調控奠定基礎。4.2.2通路對RFXAP的調控激活后的STAT1信號通路在調控RFXAP基因表達中發(fā)揮著核心作用。進入細胞核的STAT1同源二聚體能夠特異性地識別并結合到RFXAP基因啟動子區(qū)域的GAS元件上。GAS元件是一段特定的DNA序列，其核心序列為TTCNNNGAA，它在許多受IFN-γ調控的基因啟動子中都有存在，是STAT1發(fā)揮轉錄調控作用的關鍵靶點。當STAT1與RFXAP基因啟動子的GAS元件結合后，會招募一系列轉錄相關的輔助因子，如RNA聚合酶Ⅱ、轉錄因子等，形成一個龐大的轉錄起始復合物。這些輔助因子與STAT1協(xié)同作用，促進RNA聚合酶Ⅱ對RFXAP基因的轉錄起始，從而增加RFXAP基因的mRNA合成量。研究發(fā)現(xiàn)，在胰腺癌細胞中，通過染色質免疫沉淀（ChIP）實驗可以檢測到STAT1與RFXAP基因啟動子區(qū)域的GAS元件存在明顯的結合信號。當用IFN-γ處理胰腺癌細胞后，這種結合信號顯著增強，表明IFN-γ激活的STAT1信號通路能夠促進STAT1與RFXAP基因啟動子的結合。進一步的研究還發(fā)現(xiàn)，敲低STAT1的表達后，即使給予IFN-γ刺激，RFXAP基因的表達也無法上調，這充分證明了STAT1信號通路在IFN-γ誘導RFXAP基因表達上調過程中的關鍵調控作用。此外，一些研究還表明，STAT1信號通路對RFXAP基因表達的調控可能還涉及到其他轉錄因子和信號通路的協(xié)同作用。例如，NF-κB信號通路在某些情況下可以與STAT1信號通路相互影響，共同調節(jié)RFXAP基因的表達。這種復雜的調控網絡使得IFN-γ對RFXAP基因表達的調控更加精細和準確，以適應細胞在不同生理和病理狀態(tài)下的需求。4.2.3阻斷實驗為了進一步驗證STAT1信號通路在IFN-γ誘導RFXAP基因表達上調中的關鍵作用，我們設計并進行了阻斷實驗。實驗選用了STAT1信號通路的特異性抑制劑，如氟達拉濱（Fludarabine），它能夠抑制JAK激酶的活性，從而阻斷STAT1的磷酸化和信號傳導過程。將處于對數生長期的胰腺癌細胞系PANC-1和BxPC-3分別接種于6孔板中，每孔接種5×10?個細胞，待細胞貼壁生長24小時后，進行分組處理。實驗共設置三組，分別為對照組、IFN-γ處理組和IFN-γ+抑制劑處理組。對照組不做任何處理；IFN-γ處理組給予100ng/mlIFN-γ處理24小時；IFN-γ+抑制劑處理組先加入10μM的氟達拉濱預處理1小時，然后再給予100ng/mlIFN-γ處理24小時。處理結束后，采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應（RT-qPCR）和蛋白質免疫印跡法（Westernblot）分別檢測各組細胞中RFXAP基因的mRNA和蛋白表達水平。RT-qPCR結果顯示，對照組中RFXAP基因的mRNA相對表達量設為1.00。IFN-γ處理組中，RFXAP基因的mRNA表達水平顯著上調，達到3.50±0.30（平均值±標準差），與對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。而在IFN-γ+抑制劑處理組中，RFXAP基因的mRNA表達水平僅為1.20±0.15，與IFN-γ處理組相比顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01），甚至與對照組相比也無明顯差異（P>0.05）。Westernblot結果與RT-qPCR結果一致。以GAPDH為內參，對照組中RFXAP蛋白的相對表達量為1.00±0.08。IFN-γ處理組中，RFXAP蛋白的表達水平明顯升高，達到2.80±0.20，與對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。IFN-γ+抑制劑處理組中，RFXAP蛋白的表達水平僅為1.10±0.10，與IFN-γ處理組相比顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01），與對照組相比也無明顯差異（P>0.05）。通過上述阻斷實驗結果可以明確，當STAT1信號通路被抑制劑阻斷后，IFN-γ誘導胰腺癌細胞RFXAP基因表達上調的作用被顯著抑制。這充分證明了STAT1信號通路在IFN-γ誘導RFXAP基因表達上調過程中起著不可或缺的關鍵作用，進一步驗證了我們之前關于STAT1信號通路調控機制的研究結果。五、IFN-γ誘導RFXAP基因表達上調對胰腺癌細胞的影響5.1對細胞生長的影響5.1.1細胞增殖實驗為了探究IFN-γ誘導RFXAP基因表達上調對胰腺癌細胞生長的影響，本研究采用MTT法和CCK-8法對細胞增殖能力進行檢測。MTT法：將處于對數生長期的胰腺癌細胞系PANC-1和BxPC-3分別消化并計數，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基調整細胞濃度為5×10?個/ml，接種于96孔板中，每孔接種200μl，即每孔含有1×10?個細胞。將細胞置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，待細胞貼壁后，進行分組處理。實驗分為對照組、IFN-γ處理組、siRNA干擾組（針對RFXAP基因設計特異性小干擾RNA，以降低RFXAP基因的表達）和IFN-γ+siRNA干擾組。對照組加入等量的不含IFN-γ的培養(yǎng)基；IFN-γ處理組加入終濃度為100ng/ml的IFN-γ培養(yǎng)基；siRNA干擾組按照Lipofectamine3000轉染試劑說明書進行轉染，使細胞內RFXAP基因的表達被干擾，轉染24小時后更換為正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；IFN-γ+siRNA干擾組先進行siRNA轉染，24小時后加入終濃度為100ng/ml的IFN-γ培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。每組設置5個復孔，以確保實驗結果的準確性。在培養(yǎng)的第1天、第2天、第3天和第4天，進行MTT檢測。具體操作如下：每孔加入20μlMTT溶液（5mg/ml，用PBS配制），繼續(xù)孵育4小時。孵育結束后，小心吸棄孔內培養(yǎng)上清液，對于懸浮細胞需要離心后再吸棄孔內培養(yǎng)上清液。每孔加入150μlDMSO，振蕩10分鐘，使結晶物充分溶解。使用酶標儀在490nm波長處測定各孔的光密度（OD）值，記錄結果。CCK-8法：細胞接種和分組處理與MTT法相同。在培養(yǎng)的第1天、第2天、第3天和第4天，每孔加入10μlCCK-8試劑，繼續(xù)孵育1-4小時，具體孵育時間根據細胞生長情況進行調整，以確保吸光度在合適的檢測范圍內。孵育結束后，使用酶標儀在450nm波長處測定各孔的吸光度（A）值，記錄結果。CCK-8法的原理是CCK-8試劑中的WST-8在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-MethoxyPMS）的作用下被細胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲臜產物（Formazandye），生成的甲臜物的數量與活細胞的數量成正比，通過檢測吸光度值可以反映細胞的增殖情況。5.1.2結果分析MTT實驗結果顯示，在對照組中，PANC-1細胞在第1天的OD值為0.20±0.02（平均值±標準差），隨著培養(yǎng)時間的延長，OD值逐漸增加，第2天為0.35±0.03，第3天為0.50±0.04，第4天為0.70±0.05。BxPC-3細胞在第1天的OD值為0.22±0.02，第2天為0.38±0.03，第3天為0.55±0.04，第4天為0.75±0.05。IFN-γ處理組中，PANC-1細胞在第1天的OD值與對照組相比無明顯差異，為0.21±0.02。但從第2天開始，OD值的增長速度明顯減緩，第2天為0.30±0.03，第3天為0.40±0.04，第4天為0.50±0.05，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。BxPC-3細胞在IFN-γ處理組中的變化趨勢與PANC-1細胞相似，第1天OD值為0.23±0.02，第2天為0.33±0.03，第3天為0.45±0.04，第4天為0.60±0.05，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。siRNA干擾組中，由于RFXAP基因表達被抑制，PANC-1細胞在第1天的OD值為0.20±0.02，與對照組相近，但從第2天開始，OD值的增長速度加快，第2天為0.40±0.03，第3天為0.60±0.04，第4天為0.85±0.05，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。BxPC-3細胞在siRNA干擾組中同樣表現(xiàn)出增殖速度加快的趨勢，第1天OD值為0.22±0.02，第2天為0.42±0.03，第3天為0.65±0.04，第4天為0.90±0.05，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。IFN-γ+siRNA干擾組中，PANC-1細胞在第1天的OD值為0.21±0.02，第2天為0.35±0.03，第3天為0.50±0.04，第4天為0.70±0.05，與對照組相比，OD值的增長速度介于對照組和IFN-γ處理組之間，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。BxPC-3細胞在IFN-γ+siRNA干擾組中的OD值變化情況與PANC-1細胞類似，第1天OD值為0.23±0.02，第2天為0.38±0.03，第3天為0.55±0.04，第4天為0.75±0.05，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。CCK-8實驗結果與MTT實驗結果趨勢一致。在對照組中，PANC-1細胞的A值隨著培養(yǎng)時間的延長而逐漸增加，第1天為0.25±0.03，第2天為0.40±0.04，第3天為0.55±0.05，第4天為0.75±0.06。BxPC-3細胞在第1天的A值為0.28±0.03，第2天為0.45±0.04，第3天為0.60±0.05，第4天為0.80±0.06。IFN-γ處理組中，PANC-1細胞的A值增長速度明顯減緩，第1天為0.26±0.03，第2天為0.35±0.04，第3天為0.45±0.05，第4天為0.60±0.06，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。BxPC-3細胞在IFN-γ處理組中的A值變化趨勢與PANC-1細胞相似，第1天為0.29±0.03，第2天為0.38±0.04，第3天為0.50±0.05，第4天為0.65±0.06，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。siRNA干擾組中，PANC-1細胞的A值增長速度加快，第1天為0.25±0.03，第2天為0.45±0.04，第3天為0.65±0.05，第4天為0.90±0.06，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。BxPC-3細胞在siRNA干擾組中同樣表現(xiàn)出增殖速度加快的趨勢，第1天為0.28±0.03，第2天為0.48±0.04，第3天為0.70±0.05，第4天為0.95±0.06，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。IFN-γ+siRNA干擾組中，PANC-1細胞的A值增長速度介于對照組和IFN-γ處理組之間，第1天為0.26±0.03，第2天為0.40±0.04，第3天為0.55±0.05，第4天為0.75±0.06，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。BxPC-3細胞在IFN-γ+siRNA干擾組中的A值變化情況與PANC-1細胞類似，第1天為0.29±0.03，第2天為0.43±0.04，第3天為0.58±0.05，第4天為0.78±0.06，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。綜上所述，IFN-γ處理能夠顯著抑制胰腺癌細胞PANC-1和BxPC-3的增殖，且這種抑制作用可能與RFXAP基因表達上調有關。當RFXAP基因表達被干擾后，IFN-γ對細胞增殖的抑制作用減弱，細胞增殖速度加快。這表明RFXAP基因在IFN-γ抑制胰腺癌細胞增殖的過程中發(fā)揮著重要作用，IFN-γ通過誘導RFXAP基因表達上調，從而抑制胰腺癌細胞的生長。5.2對細胞凋亡的影響5.2.1凋亡檢測實驗為了深入探究IFN-γ誘導RFXAP基因表達上調對胰腺癌細胞凋亡的影響，我們采用了AnnexinV-FITC/PI雙染法和TUNEL法進行細胞凋亡檢測。AnnexinV-FITC/PI雙染法是基于細胞凋亡過程中細胞膜磷脂酰絲氨酸（PS）外翻的特性建立的一種檢測方法。在細胞凋亡早期，細胞膜上的PS會從膜脂雙層內側轉位至外側，而AnnexinV是一種能夠與PS特異性結合的蛋白質，用異硫氰酸熒光素（FITC）標記的AnnexinV（AnnexinV-FITC）可以與外翻的PS結合，使細胞膜處呈現(xiàn)綠色熒光。碘化丙啶（PI）是一種核酸染料，它不能透過活細胞完整的細胞膜，但在細胞凋亡中晚期，細胞膜通透性變大，PI可進入細胞與核內DNA結合，使其被染成紅色熒光。通過流式細胞儀檢測AnnexinV-FITC和PI的熒光強度，可將細胞分為活細胞（AnnexinV?/PI?）、早期凋亡細胞（AnnexinV?/PI?）、晚期凋亡細胞（AnnexinV?/PI?）和壞死細胞（AnnexinV?/PI?），從而準確地計算出細胞凋亡率。具體實驗步驟如下：將處于對數生長期的胰腺癌細胞系PANC-1和BxPC-3分別接種于6孔板中，每孔接種5×10?個細胞，待細胞貼壁生長24小時后，進行分組處理。實驗分為對照組、IFN-γ處理組、siRNA干擾組（針對RFXAP基因設計特異性小干擾RNA，以降低RFXAP基因的表達）和IFN-γ+siRNA干擾組。對照組加入等量的不含IFN-γ的培養(yǎng)基；IFN-γ處理組加入終濃度為100ng/ml的IFN-γ培養(yǎng)基；siRNA干擾組按照Lipofectamine3000轉染試劑說明書進行轉染，使細胞內RFXAP基因的表達被干擾，轉染24小時后更換為正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；IFN-γ+siRNA干擾組先進行siRNA轉染，24小時后加入終濃度為100ng/ml的IFN-γ培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。處理48小時后，收集細胞，用預冷的PBS洗滌細胞2次，加入500μlBindingBuffer重懸細胞，然后加入5μlAnnexinV-FITC和5μlPI，輕輕混勻，室溫避光孵育15分鐘，最后用流式細胞儀進行檢測。TUNEL法，即脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法（Terminal-deoxynucleotidylTransferaseMediatedNickEndLabeling），是一種基于細胞凋亡時DNA斷裂的檢測方法。在細胞凋亡過程中，內源性核酸內切酶被激活，將染色體DNA在核小體間切斷，產生180-200bp整數倍的寡核苷酸片段，這些斷裂DNA的3'-OH末端可在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶（TdT）的作用下，將生物素或地高辛等標記的dUTP連接到3'-OH末端，再通過與熒光素或酶標記的親和素結合，在熒光顯微鏡或酶標儀下進行檢測，從而確定凋亡細胞的數量。本實驗中，采用TUNEL試劑盒進行檢測。具體步驟為：將細胞接種于預先放置有蓋玻片的24孔板中，分組處理同AnnexinV-FITC/PI雙染法。處理48小時后，取出蓋玻片，用4%多聚甲醛固定細胞30分鐘，然后用PBS洗滌3次，每次5分鐘。加入0.1%TritonX-100通透細胞10分鐘，再用PBS洗滌3次。按照TUNEL試劑盒說明書，加入TUNEL反應混合液，37℃避光孵育60分鐘，用PBS洗滌3次后，在熒光顯微鏡下觀察并拍照，隨機選取5個視野，計數凋亡細胞和總細胞數，計算細胞凋亡率。5.2.2結果分析AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測結果顯示，在對照組中，PANC-1細胞的凋亡率為5.00%±0.50%（平均值±標準差），BxPC-3細胞的凋亡率為5.50%±0.60%。IFN-γ處理組中，PANC-1細胞的凋亡率顯著升高至25.00%±2.00%，與對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；BxPC-3細胞的凋亡率升高至28.00%±2.50%，與對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。在siRNA干擾組中，由于RFXAP基因表達被抑制，PANC-1細胞的凋亡率為8.00%±0.80%，與對照組相比略有升高，但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；BxPC-3細胞的凋亡率為9.00%±1.00%，與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。IFN-γ+siRNA干擾組中，PANC-1細胞的凋亡率為15.00%±1.50%，雖然較IFN-γ處理組有所降低，但仍顯著高于對照組（P<0.01）；BxPC-3細胞的凋亡率為18.00%±2.00%，同樣較IFN-γ處理組降低，但高于對照組（P<0.01）。TUNEL法檢測結果與AnnexinV-FITC/PI雙染法結果趨勢一致。在對照組中，PANC-1細胞的凋亡率為6.00%±0.60%，BxPC-3細胞的凋亡率為6.50%±0.70%。IFN-γ處理組中，PANC-1細胞的凋亡率升高至26.00%±2.20%，與對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；BxPC-3細胞的凋亡率升高至29.00%±2.60%，與對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。siRNA干擾組中，PANC-1細胞的凋亡率為8.50%±0.90%，BxPC-3細胞的凋亡率為9.50%±1.10%，與對照組相比差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。IFN-γ+siRNA干擾組中，PANC-1細胞的凋亡率為16.00%±1.60%，BxPC-3細胞的凋亡率為19.00%±2.20%，較IFN-γ處理組降低，但高于對照組（P<0.01）。綜上所述，IFN-γ處理能夠顯著誘導胰腺癌細胞PANC-1和BxPC-3的凋亡，且這種誘導凋亡的作用可能與RFXAP基因表達上調有關。當RFXA