pH響應(yīng)型DNA納米彈簧：從構(gòu)建到細(xì)胞行為調(diào)控的深度探索

pH響應(yīng)型DNA納米彈簧：從構(gòu)建到細(xì)胞行為調(diào)控的深度探索一、引言1.1研究背景與意義在生物醫(yī)學(xué)和納米技術(shù)的前沿領(lǐng)域，pH響應(yīng)型DNA納米彈簧作為一種極具潛力的新型材料，正逐漸成為研究的焦點(diǎn)。它巧妙地融合了DNA納米技術(shù)的精準(zhǔn)可編程性與pH響應(yīng)特性，為細(xì)胞行為調(diào)控研究開辟了全新的路徑，在疾病診斷與治療、生物傳感器開發(fā)等諸多關(guān)鍵領(lǐng)域展現(xiàn)出了不可估量的應(yīng)用價(jià)值。DNA，作為生命的遺傳物質(zhì)，不僅承載著生物體的遺傳信息，還因其獨(dú)特的分子結(jié)構(gòu)和堿基互補(bǔ)配對原則，成為構(gòu)建納米材料的理想基石。通過合理設(shè)計(jì)DNA序列，科學(xué)家們能夠精確地構(gòu)建出各種具有特定形狀和功能的DNA納米結(jié)構(gòu)，如DNA四面體、DNA納米管以及DNA折紙等。這些納米結(jié)構(gòu)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域展現(xiàn)出了巨大的應(yīng)用潛力，例如作為藥物載體，能夠?qū)崿F(xiàn)藥物的精準(zhǔn)遞送；作為生物傳感器，可用于生物分子的高靈敏檢測。pH響應(yīng)型DNA納米材料則是在DNA納米技術(shù)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步引入了對環(huán)境pH值變化敏感的元件。在生物體內(nèi)，不同組織和細(xì)胞微環(huán)境的pH值存在顯著差異，如腫瘤組織的pH值通常比正常組織略低。pH響應(yīng)型DNA納米材料能夠感知這些細(xì)微的pH變化，并相應(yīng)地改變自身的結(jié)構(gòu)和功能，從而實(shí)現(xiàn)對特定環(huán)境的精準(zhǔn)響應(yīng)。這種特性使得pH響應(yīng)型DNA納米材料在疾病診斷與治療中具有獨(dú)特的優(yōu)勢，能夠有效提高治療效果，降低對正常組織的損傷。納米彈簧結(jié)構(gòu)在納米技術(shù)領(lǐng)域具有獨(dú)特的地位。其特殊的幾何形狀賦予了材料優(yōu)異的力學(xué)性能和可調(diào)控的空間結(jié)構(gòu)，使其在分子機(jī)器、傳感器以及藥物輸送系統(tǒng)等方面展現(xiàn)出了廣闊的應(yīng)用前景。將DNA納米技術(shù)與納米彈簧結(jié)構(gòu)相結(jié)合，制備出的pH響應(yīng)型DNA納米彈簧，不僅繼承了DNA納米材料的生物相容性和可編程性，還具備了納米彈簧結(jié)構(gòu)的獨(dú)特優(yōu)勢，為細(xì)胞行為調(diào)控研究提供了一種全新的有力工具。細(xì)胞行為調(diào)控是生物學(xué)領(lǐng)域的核心研究內(nèi)容之一，對于深入理解生命過程和攻克重大疾病具有至關(guān)重要的意義。細(xì)胞的行為包括增殖、分化、遷移、凋亡等，這些過程受到細(xì)胞內(nèi)信號通路和細(xì)胞外微環(huán)境的精確調(diào)控。任何細(xì)微的調(diào)控異常都可能導(dǎo)致細(xì)胞功能紊亂，進(jìn)而引發(fā)各種疾病，如癌癥、神經(jīng)退行性疾病等。因此，開發(fā)有效的細(xì)胞行為調(diào)控策略，對于疾病的預(yù)防、診斷和治療具有深遠(yuǎn)的意義。pH響應(yīng)型DNA納米彈簧在細(xì)胞行為調(diào)控研究中具有獨(dú)特的優(yōu)勢和重要的意義。由于其對環(huán)境pH值的高度敏感性，能夠精準(zhǔn)地感知細(xì)胞微環(huán)境的變化，并通過自身結(jié)構(gòu)的改變來響應(yīng)這種變化。這種響應(yīng)可以觸發(fā)一系列的生物學(xué)效應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞行為的精確調(diào)控。在腫瘤治療中，pH響應(yīng)型DNA納米彈簧可以被設(shè)計(jì)成在腫瘤微酸性環(huán)境下釋放抗癌藥物，或者激活細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號通路，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡；在組織工程中，它可以通過調(diào)控細(xì)胞的黏附、增殖和分化行為，促進(jìn)組織的修復(fù)和再生。pH響應(yīng)型DNA納米彈簧的研究還處于起步階段，仍然面臨著諸多挑戰(zhàn)。如何進(jìn)一步優(yōu)化納米彈簧的設(shè)計(jì)，提高其穩(wěn)定性和響應(yīng)效率；如何實(shí)現(xiàn)納米彈簧與細(xì)胞的高效相互作用，確保其能夠準(zhǔn)確地調(diào)控細(xì)胞行為；如何解決納米彈簧在體內(nèi)的生物安全性和生物可降解性等問題，都是亟待解決的關(guān)鍵科學(xué)問題。本研究旨在深入探究pH響應(yīng)型DNA納米彈簧的構(gòu)建方法及其對細(xì)胞行為的調(diào)控機(jī)制，為其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的實(shí)際應(yīng)用奠定堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀近年來，pH響應(yīng)型DNA納米材料及細(xì)胞行為調(diào)控的研究在國內(nèi)外均取得了顯著進(jìn)展，眾多科研團(tuán)隊(duì)圍繞這兩個(gè)領(lǐng)域展開了深入探索，不斷拓展其邊界，為生物醫(yī)學(xué)的發(fā)展帶來了新的契機(jī)。在pH響應(yīng)型DNA納米材料的研究方面，國外的研究起步較早，且在基礎(chǔ)理論和創(chuàng)新應(yīng)用上成果頗豐。美國的科研團(tuán)隊(duì)在DNA納米結(jié)構(gòu)的精準(zhǔn)設(shè)計(jì)與構(gòu)建領(lǐng)域處于前沿地位，通過合理設(shè)計(jì)DNA序列，成功制備出多種具有復(fù)雜形狀和功能的DNA納米結(jié)構(gòu)，如DNA納米管、DNA折紙等，并在此基礎(chǔ)上引入pH響應(yīng)元件，使其能夠?qū)Νh(huán)境pH值的變化做出精確響應(yīng)。其中，利用i-motif結(jié)構(gòu)對pH的敏感性，開發(fā)出一系列pH響應(yīng)型DNA納米傳感器，能夠在生物體內(nèi)實(shí)現(xiàn)對pH值的實(shí)時(shí)監(jiān)測。歐洲的研究機(jī)構(gòu)則側(cè)重于將pH響應(yīng)型DNA納米材料應(yīng)用于藥物遞送系統(tǒng)，通過巧妙設(shè)計(jì)納米材料的結(jié)構(gòu)和表面性質(zhì)，實(shí)現(xiàn)藥物在特定pH環(huán)境下的精準(zhǔn)釋放，有效提高了藥物的治療效果。例如，德國的研究人員研發(fā)出一種pH響應(yīng)型DNA納米載體，能夠在腫瘤微酸性環(huán)境下快速釋放抗癌藥物，顯著增強(qiáng)了對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。國內(nèi)在pH響應(yīng)型DNA納米材料的研究上也取得了長足的進(jìn)步。眾多高校和科研院所紛紛投入到這一領(lǐng)域的研究中，在材料設(shè)計(jì)、制備工藝以及應(yīng)用探索等方面展現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢。中國科學(xué)院的科研團(tuán)隊(duì)通過創(chuàng)新的合成方法，制備出具有高穩(wěn)定性和高效響應(yīng)性的pH響應(yīng)型DNA納米材料，并成功將其應(yīng)用于生物成像和疾病診斷領(lǐng)域。此外，國內(nèi)的研究人員還注重將pH響應(yīng)型DNA納米材料與其他納米技術(shù)相結(jié)合，如與金納米粒子、量子點(diǎn)等復(fù)合，開發(fā)出具有多功能特性的納米復(fù)合材料，進(jìn)一步拓展了其應(yīng)用范圍。在細(xì)胞行為調(diào)控的研究領(lǐng)域，國外的科研團(tuán)隊(duì)通過基因編輯、蛋白質(zhì)工程等技術(shù)手段，深入研究細(xì)胞內(nèi)信號通路和基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制，為細(xì)胞行為調(diào)控提供了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。同時(shí)，利用光遺傳學(xué)、電刺激等技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了對細(xì)胞行為的精確控制，為細(xì)胞治療和組織工程的發(fā)展提供了新的策略。例如，美國的科學(xué)家利用光遺傳學(xué)技術(shù)，成功實(shí)現(xiàn)了對神經(jīng)元活動(dòng)的遠(yuǎn)程控制，為神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療帶來了新的希望。歐洲的研究機(jī)構(gòu)則專注于開發(fā)新型的生物材料和生物傳感器，用于實(shí)時(shí)監(jiān)測和調(diào)控細(xì)胞行為，為細(xì)胞生物學(xué)研究提供了有力的工具。國內(nèi)在細(xì)胞行為調(diào)控的研究方面也不甘落后，積極開展多學(xué)科交叉研究，將生物學(xué)、材料學(xué)、工程學(xué)等學(xué)科的理論和技術(shù)有機(jī)結(jié)合，取得了一系列重要成果。例如，華東理工大學(xué)劉潤輝教授課題組在生物材料表面調(diào)控細(xì)胞行為研究領(lǐng)域取得重要突破，系統(tǒng)探索了基于聚乙二醇（PEG）的抗粘附分子對材料表面活性多肽細(xì)胞調(diào)控功能的影響，發(fā)現(xiàn)中等鏈長的PEG分子能夠極大地降低材料表面背景干擾，并能充分展示多肽的功能。中國科學(xué)院長春應(yīng)用化學(xué)研究所曲曉剛研究團(tuán)隊(duì)在設(shè)計(jì)及應(yīng)用多功能體系動(dòng)態(tài)調(diào)控細(xì)胞行為取得系列研究成果，利用稀土摻雜的上轉(zhuǎn)換納米材料，構(gòu)建了系列近紅外光響應(yīng)的體系并用于細(xì)胞黏附和干細(xì)胞分化行為的無損、動(dòng)態(tài)調(diào)控。然而，當(dāng)前的研究仍存在一些不足之處。在pH響應(yīng)型DNA納米材料方面，雖然已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展，但納米材料的穩(wěn)定性和響應(yīng)效率仍有待進(jìn)一步提高，其在復(fù)雜生物環(huán)境中的行為和作用機(jī)制還需要深入研究。此外，如何實(shí)現(xiàn)納米材料的大規(guī)模制備和工業(yè)化生產(chǎn)，也是亟待解決的問題。在細(xì)胞行為調(diào)控方面，雖然已經(jīng)開發(fā)出多種調(diào)控策略，但這些策略往往存在操作復(fù)雜、特異性不強(qiáng)等問題，難以實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞行為的精準(zhǔn)、高效調(diào)控。此外，細(xì)胞行為調(diào)控與pH響應(yīng)型DNA納米材料的結(jié)合研究還相對較少，如何將兩者有機(jī)結(jié)合，實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞行為的更加精準(zhǔn)、有效的調(diào)控，是未來研究的重點(diǎn)方向。1.3研究內(nèi)容與方法本研究主要聚焦于pH響應(yīng)型DNA納米彈簧的構(gòu)建及其對細(xì)胞行為調(diào)控的探究，具體內(nèi)容和方法如下：研究內(nèi)容：設(shè)計(jì)并合成pH響應(yīng)型DNA納米彈簧。通過合理設(shè)計(jì)DNA序列，利用DNA分子的堿基互補(bǔ)配對原則，構(gòu)建具有特定結(jié)構(gòu)和功能的pH響應(yīng)型DNA納米彈簧。深入研究納米彈簧的結(jié)構(gòu)與性能關(guān)系，優(yōu)化其設(shè)計(jì)，提高其穩(wěn)定性和響應(yīng)效率。利用原子力顯微鏡（AFM）、凝膠電泳等技術(shù)對納米彈簧的結(jié)構(gòu)和形態(tài)進(jìn)行表征，通過光譜學(xué)方法研究其對pH變化的響應(yīng)特性。探究pH響應(yīng)型DNA納米彈簧對細(xì)胞行為的調(diào)控機(jī)制：將制備好的pH響應(yīng)型DNA納米彈簧與細(xì)胞共培養(yǎng)，觀察其對細(xì)胞增殖、分化、遷移、凋亡等行為的影響。利用熒光標(biāo)記技術(shù)、流式細(xì)胞術(shù)等手段，研究納米彈簧在細(xì)胞內(nèi)的攝取、分布和代謝情況，以及其對細(xì)胞內(nèi)信號通路的影響。拓展pH響應(yīng)型DNA納米彈簧在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用：探索pH響應(yīng)型DNA納米彈簧作為藥物載體的潛力，研究其在藥物遞送中的應(yīng)用效果。將抗癌藥物負(fù)載到納米彈簧上，觀察其在腫瘤細(xì)胞中的釋放行為和對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。開發(fā)基于pH響應(yīng)型DNA納米彈簧的生物傳感器，用于生物分子的檢測和分析。利用納米彈簧對pH變化的敏感特性，設(shè)計(jì)新型的生物傳感器，實(shí)現(xiàn)對生物分子的高靈敏檢測。在研究方法上，本研究綜合運(yùn)用了多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)和分析方法。在DNA納米彈簧的制備過程中，采用了分子生物學(xué)技術(shù)，如DNA合成、退火雜交、連接等，以確保納米彈簧的精確構(gòu)建。在納米彈簧的表征方面，運(yùn)用了原子力顯微鏡（AFM）、掃描電子顯微鏡（SEM）等成像技術(shù)，直觀地觀察納米彈簧的形態(tài)和結(jié)構(gòu)；同時(shí)，利用凝膠電泳、圓二色譜（CD）等技術(shù)，分析納米彈簧的組成和構(gòu)象變化。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，使用了細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，培養(yǎng)多種類型的細(xì)胞，如腫瘤細(xì)胞、正常細(xì)胞等，以研究納米彈簧對不同細(xì)胞行為的影響。采用熒光標(biāo)記技術(shù)，將納米彈簧或相關(guān)分子標(biāo)記上熒光基團(tuán)，通過熒光顯微鏡、流式細(xì)胞儀等設(shè)備，觀察納米彈簧在細(xì)胞內(nèi)的動(dòng)態(tài)過程和對細(xì)胞行為的調(diào)控機(jī)制。此外，還運(yùn)用了蛋白質(zhì)印跡（Westernblot）、實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）等分子生物學(xué)技術(shù)，深入研究納米彈簧對細(xì)胞內(nèi)信號通路和基因表達(dá)的影響。通過這些實(shí)驗(yàn)技術(shù)和分析方法的有機(jī)結(jié)合，本研究將全面、深入地揭示pH響應(yīng)型DNA納米彈簧的構(gòu)建規(guī)律及其對細(xì)胞行為的調(diào)控機(jī)制，為其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。二、pH響應(yīng)型DNA納米彈簧構(gòu)建基礎(chǔ)2.1DNA納米技術(shù)概述DNA納米技術(shù)作為納米科技領(lǐng)域的重要分支，是指以DNA的理化特性為原理設(shè)計(jì)的納米技術(shù)，主要應(yīng)用于分子的組裝。其基本原理源于核酸分子中堿基對的特性。DNA由核苷酸序列組成，其堿基包括腺嘌呤（A）、胞嘧啶（C）、鳥嘌呤（G）和胸腺嘧啶（T）。在DNA雙鏈結(jié)構(gòu)中，A與T、C與G遵循互補(bǔ)配對原則，形成穩(wěn)定的堿基對，進(jìn)而構(gòu)成雙螺旋結(jié)構(gòu)，這是DNA在自然狀態(tài)下最穩(wěn)定的能量狀態(tài)。在DNA納米技術(shù)中，正是巧妙地利用了DNA的這些特性，通過人為設(shè)計(jì)特定的核苷酸序列，誘導(dǎo)產(chǎn)生各種期望的結(jié)構(gòu)，使目標(biāo)結(jié)構(gòu)處于最穩(wěn)定的能級狀態(tài)。DNA納米技術(shù)具有諸多顯著特點(diǎn)。首先是高度的可編程性，研究人員能夠根據(jù)實(shí)際需求，精確設(shè)計(jì)DNA序列，從而構(gòu)建出具有特定形狀、尺寸和功能的納米結(jié)構(gòu)，如周期晶格、納米管、多面體以及復(fù)雜的DNA折紙結(jié)構(gòu)等。這種可編程性為實(shí)現(xiàn)納米結(jié)構(gòu)的精準(zhǔn)控制提供了可能。其次，DNA納米結(jié)構(gòu)具有良好的生物相容性，由于DNA本身是生物體內(nèi)的遺傳物質(zhì)，因此基于DNA構(gòu)建的納米材料在生物體系中能夠較好地適應(yīng)，不易引發(fā)免疫反應(yīng)，這使其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用具有獨(dú)特優(yōu)勢。再者，DNA納米技術(shù)還具備自組裝特性，在合適的條件下，DNA分子能夠按照預(yù)設(shè)的序列信息，自發(fā)地組裝成目標(biāo)結(jié)構(gòu)，無需復(fù)雜的外部干預(yù)，這大大簡化了納米結(jié)構(gòu)的制備過程。DNA納米技術(shù)在眾多領(lǐng)域展現(xiàn)出了廣闊的應(yīng)用前景。在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，它為藥物遞送提供了新的策略。例如，可將DNA納米結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)成藥物載體，通過精確控制其尺寸、形狀和表面性質(zhì)，實(shí)現(xiàn)藥物的靶向遞送。將抗癌藥物裝載到DNA納米載體中，利用其對腫瘤細(xì)胞表面特定受體的識(shí)別能力，將藥物精準(zhǔn)地輸送到腫瘤部位，提高藥物療效的同時(shí)減少對正常組織的毒副作用。在生物傳感方面，DNA納米技術(shù)可用于開發(fā)高靈敏度的生物傳感器。利用DNA與目標(biāo)生物分子之間的特異性相互作用，如堿基互補(bǔ)配對、適配體與靶標(biāo)的結(jié)合等，將生物分子的識(shí)別事件轉(zhuǎn)化為可檢測的信號，實(shí)現(xiàn)對生物分子的快速、準(zhǔn)確檢測。基于DNA納米結(jié)構(gòu)構(gòu)建的熒光傳感器，能夠?qū)μ囟ǖ暮怂嵝蛄?、蛋白質(zhì)等生物標(biāo)志物進(jìn)行高靈敏檢測，為疾病的早期診斷提供有力支持。此外，在材料科學(xué)領(lǐng)域，DNA納米技術(shù)也為制備新型納米材料提供了新思路。通過將DNA與其他材料相結(jié)合，如金屬納米粒子、量子點(diǎn)等，可賦予材料新的性能和功能，開發(fā)出具有獨(dú)特光學(xué)、電學(xué)、力學(xué)性能的復(fù)合材料。2.2pH響應(yīng)型材料原理pH響應(yīng)型材料，又稱智能型高分子材料，是一類能夠?qū)Νh(huán)境pH值變化做出響應(yīng)的智能材料。其響應(yīng)機(jī)制主要基于材料內(nèi)部存在的可解離基團(tuán)。這些可解離基團(tuán)在不同的pH環(huán)境下，會(huì)發(fā)生質(zhì)子化或去質(zhì)子化反應(yīng)，從而導(dǎo)致材料的化學(xué)結(jié)構(gòu)和物理性質(zhì)發(fā)生顯著改變。以常見的pH響應(yīng)型聚合物為例，當(dāng)環(huán)境pH值低于其pKa（酸解離常數(shù)）時(shí)，聚合物鏈上的酸性基團(tuán)（如羧基-COOH、磺酸基-SO?H等）會(huì)發(fā)生質(zhì)子化，使聚合物帶上正電荷。這種電荷的改變會(huì)導(dǎo)致聚合物分子鏈之間的靜電相互作用增強(qiáng)，分子鏈趨于伸展，聚合物表現(xiàn)出親水性增強(qiáng)，溶解度增大等特性。反之，當(dāng)環(huán)境pH值高于pKa時(shí)，酸性基團(tuán)去質(zhì)子化，聚合物帶上負(fù)電荷，分子鏈間的靜電排斥作用增大，聚合物分子鏈?zhǔn)湛s，親水性降低，溶解度減小，甚至可能發(fā)生相分離。在DNA納米技術(shù)領(lǐng)域，pH響應(yīng)型材料的應(yīng)用原理主要基于DNA的特殊結(jié)構(gòu)和化學(xué)性質(zhì)。DNA的磷酸骨架帶有負(fù)電荷，在不同pH環(huán)境下，其電荷分布和分子構(gòu)象會(huì)發(fā)生變化。此外，一些特殊的DNA結(jié)構(gòu)，如i-motif結(jié)構(gòu)，對pH值的變化極為敏感。i-motif結(jié)構(gòu)是由富含胞嘧啶（C）的DNA序列在酸性條件下形成的四鏈結(jié)構(gòu)，其通過半質(zhì)子化的胞嘧啶-胞嘧啶堿基對（C：CH?）相互作用而穩(wěn)定。在酸性環(huán)境（pH<7）中，i-motif結(jié)構(gòu)中的胞嘧啶殘基質(zhì)子化，形成穩(wěn)定的四鏈結(jié)構(gòu)；而在中性或堿性環(huán)境（pH>7）中，胞嘧啶去質(zhì)子化，i-motif結(jié)構(gòu)解鏈，轉(zhuǎn)變?yōu)閱捂淒NA。這種pH響應(yīng)特性使得含有i-motif結(jié)構(gòu)的DNA納米材料能夠在不同pH條件下實(shí)現(xiàn)結(jié)構(gòu)的可逆轉(zhuǎn)變，為構(gòu)建pH響應(yīng)型DNA納米彈簧提供了關(guān)鍵的設(shè)計(jì)基礎(chǔ)。pH響應(yīng)型材料在DNA納米彈簧構(gòu)建中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。通過巧妙地將pH響應(yīng)元件引入DNA納米彈簧的設(shè)計(jì)中，能夠使納米彈簧在特定的pH環(huán)境下發(fā)生結(jié)構(gòu)的變化，如伸長、收縮或彎曲等。這種結(jié)構(gòu)變化可以進(jìn)一步引發(fā)納米彈簧與周圍環(huán)境或生物分子的相互作用改變，從而實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞行為的精準(zhǔn)調(diào)控。在腫瘤微酸性環(huán)境中，pH響應(yīng)型DNA納米彈簧可以通過結(jié)構(gòu)變化釋放負(fù)載的藥物，或者激活細(xì)胞內(nèi)的信號通路，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。pH響應(yīng)型DNA納米彈簧還可以作為生物傳感器，利用其在不同pH值下的結(jié)構(gòu)變化，實(shí)現(xiàn)對生物分子的特異性識(shí)別和檢測。2.3DNA納米彈簧構(gòu)建原理pH響應(yīng)型DNA納米彈簧的構(gòu)建主要基于DNA鏈的退火雜交和連接反應(yīng)，巧妙地利用了DNA分子的堿基互補(bǔ)配對原則，通過精心設(shè)計(jì)的DNA序列，實(shí)現(xiàn)了具有特定結(jié)構(gòu)和功能的納米彈簧的精準(zhǔn)構(gòu)建。在構(gòu)建過程中，首先需要設(shè)計(jì)一系列特定的DNA鏈。這些DNA鏈包含了能夠形成納米彈簧基本骨架的序列，以及對pH值變化敏感的i-基序序列。將這些DNA鏈混合在一起，在適當(dāng)?shù)臈l件下進(jìn)行退火雜交反應(yīng)。退火雜交是指將雙鏈DNA加熱變性成單鏈后，緩慢冷卻，使互補(bǔ)的單鏈DNA重新配對形成雙鏈的過程。在這個(gè)過程中，DNA鏈依據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則，即A與T、C與G相互配對，自發(fā)地組裝成特定的結(jié)構(gòu)。其中，能夠形成納米彈簧骨架的DNA鏈相互結(jié)合，逐漸構(gòu)建出納米彈簧的基本形態(tài)，而含有i-基序的DNA鏈則在后續(xù)的pH響應(yīng)過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。隨后，為了使組裝好的DNA結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，需要進(jìn)行連接反應(yīng)。通常使用T4DNA連接酶來催化連接反應(yīng)，它能夠?qū)⑾噜彽腄NA鏈通過磷酸二酯鍵連接起來，形成穩(wěn)定的共價(jià)鍵，從而確保納米彈簧結(jié)構(gòu)的完整性和穩(wěn)定性。經(jīng)過連接反應(yīng)后，DNA納米彈簧的基本結(jié)構(gòu)得以固定，具備了進(jìn)一步應(yīng)用的基礎(chǔ)。i-基序在pH響應(yīng)型DNA納米彈簧中扮演著核心角色，其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和對pH值變化的敏感性，賦予了納米彈簧卓越的pH響應(yīng)性能。i-基序是一種由富含胞嘧啶（C）的DNA序列在酸性條件下形成的四鏈結(jié)構(gòu)。在酸性環(huán)境（pH<7）中，i-基序中的胞嘧啶殘基質(zhì)子化，通過半質(zhì)子化的胞嘧啶-胞嘧啶堿基對（C：CH?）相互作用，形成穩(wěn)定的四鏈結(jié)構(gòu)。這種結(jié)構(gòu)的形成會(huì)導(dǎo)致DNA鏈的構(gòu)象發(fā)生變化，進(jìn)而影響整個(gè)納米彈簧的結(jié)構(gòu)和性能。例如，當(dāng)納米彈簧處于酸性環(huán)境中時(shí)，i-基序形成，其特殊的結(jié)構(gòu)會(huì)使得納米彈簧發(fā)生收縮或彎曲等形變，這種形變可以被精確地調(diào)控，以實(shí)現(xiàn)對特定環(huán)境的響應(yīng)。而在中性或堿性環(huán)境（pH>7）中，i-基序中的胞嘧啶去質(zhì)子化，四鏈結(jié)構(gòu)解鏈，轉(zhuǎn)變?yōu)閱捂淒NA，納米彈簧則恢復(fù)到原來的伸展?fàn)顟B(tài)。這種在不同pH條件下的可逆結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，使得pH響應(yīng)型DNA納米彈簧能夠根據(jù)環(huán)境pH值的變化，靈活地調(diào)整自身的結(jié)構(gòu)和功能，為細(xì)胞行為調(diào)控提供了強(qiáng)大的工具。通過巧妙地設(shè)計(jì)i-基序在DNA納米彈簧中的位置和數(shù)量，可以精確地調(diào)控納米彈簧對pH值變化的響應(yīng)閾值和響應(yīng)程度，實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞微環(huán)境pH變化的精準(zhǔn)感知和響應(yīng)，從而有效地調(diào)控細(xì)胞行為。三、pH響應(yīng)型DNA納米彈簧的構(gòu)建3.1實(shí)驗(yàn)材料與準(zhǔn)備構(gòu)建pH響應(yīng)型DNA納米彈簧所需的材料包括多種DNA鏈、特定的酶以及緩沖液等，這些材料的質(zhì)量和預(yù)處理方式對納米彈簧的成功構(gòu)建至關(guān)重要。在DNA鏈方面，本研究精心設(shè)計(jì)并合成了一系列特定序列的DNA鏈，主要包括用于構(gòu)建納米彈簧基本骨架的DNA鏈以及富含胞嘧啶（C）、對pH值變化敏感的i-基序DNA鏈。這些DNA鏈均委托專業(yè)的生物公司進(jìn)行合成，以確保其序列的準(zhǔn)確性和純度。合成后的DNA鏈以干粉形式保存于-20℃冰箱中，使用前需進(jìn)行溶解處理。具體操作是將適量的超純水加入裝有DNA干粉的離心管中，充分振蕩使其完全溶解，然后通過紫外分光光度計(jì)測定其濃度，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求將DNA鏈稀釋至合適的工作濃度。實(shí)驗(yàn)中用到的酶主要有T4DNA連接酶和核酸外切酶（ExoI和ExoIII）。T4DNA連接酶購自NEB公司，其作用是催化DNA鏈之間的連接反應(yīng)，使納米彈簧的結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定。該酶通常保存在-20℃的冰箱中，使用時(shí)需在冰上解凍，以避免酶活性的喪失。核酸外切酶ExoI和ExoIII同樣購自NEB公司，ExoI能夠特異性地降解單鏈DNA，ExoIII則主要作用于雙鏈DNA的3'末端，在實(shí)驗(yàn)中用于去除多余的引物和未反應(yīng)的DNA片段，以提高納米彈簧的純度。這兩種酶也需在-20℃保存，使用時(shí)在冰上操作。緩沖液是實(shí)驗(yàn)中不可或缺的組成部分，主要包括10×T4DNA連接酶緩沖液和Tris-HCl緩沖液。10×T4DNA連接酶緩沖液用于提供T4DNA連接酶催化反應(yīng)所需的適宜環(huán)境，其包含了特定濃度的Tris-HCl、MgCl?、DTT等成分，能夠維持酶的活性和反應(yīng)的穩(wěn)定性。Tris-HCl緩沖液則用于調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH值，本實(shí)驗(yàn)中使用的Tris-HCl緩沖液pH值為7.5，它能夠確保DNA鏈在適宜的酸堿環(huán)境中進(jìn)行雜交和連接反應(yīng)。這些緩沖液均按照標(biāo)準(zhǔn)配方自行配制，配制完成后經(jīng)高壓滅菌處理，以去除可能存在的微生物污染，然后保存于4℃冰箱中備用。在使用前，所有的材料都需要進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量檢查和預(yù)處理。對于DNA鏈，除了測定濃度外，還需通過聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）對其純度和完整性進(jìn)行檢測，確保無降解和雜質(zhì)污染。酶在使用前需檢查其活性是否正常，可通過進(jìn)行簡單的酶促反應(yīng)來驗(yàn)證。緩沖液在使用前需檢查其pH值是否準(zhǔn)確，若有偏差需及時(shí)進(jìn)行調(diào)整。通過對這些材料的精心準(zhǔn)備和嚴(yán)格處理，為后續(xù)pH響應(yīng)型DNA納米彈簧的成功構(gòu)建奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。3.2具體構(gòu)建步驟3.2.1成環(huán)反應(yīng)成環(huán)反應(yīng)是構(gòu)建pH響應(yīng)型DNA納米彈簧的關(guān)鍵起始步驟，其具體操作需精準(zhǔn)把控，以確保反應(yīng)的順利進(jìn)行和產(chǎn)物的高質(zhì)量。首先，將5’磷酸化的線性DNA鏈與連接引物按照1:4的比例，分別加入到含有4μl10×T4DNA連接酶緩沖液和適量超純水的混合溶液中。該混合溶液的總體積需根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行調(diào)整，一般在40μl左右，超純水的加入量則根據(jù)總體積和其他成分的用量進(jìn)行精確計(jì)算，以保證各成分的濃度處于合適范圍。使用移液槍將溶液充分吹打混勻，使各成分均勻分散，為后續(xù)反應(yīng)奠定良好基礎(chǔ)。接著，將混合溶液置于95℃的高溫環(huán)境中加熱5分鐘，此步驟的目的是使DNA鏈充分變性，解開雙鏈結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)變?yōu)閱捂湢顟B(tài)。高溫能夠破壞DNA雙鏈之間的氫鍵，使堿基對分離，為后續(xù)的雜交反應(yīng)提供單鏈模板。隨后，將溶液轉(zhuǎn)移至25℃的環(huán)境中孵育1小時(shí)，在這一過程中，線性DNA鏈與連接引物依據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則進(jìn)行雜交。連接引物的設(shè)計(jì)與線性DNA鏈的部分序列互補(bǔ)，在適宜的溫度條件下，它們能夠特異性地結(jié)合，形成穩(wěn)定的雜交體。雜交反應(yīng)完成后，向混合溶液中加入2μl的T4DNA連接酶（5u/μl），并在25℃下繼續(xù)孵育3小時(shí)。T4DNA連接酶能夠催化相鄰DNA鏈之間的磷酸二酯鍵形成，將雜交后的線性DNA鏈與連接引物連接起來，從而實(shí)現(xiàn)成環(huán)反應(yīng)，生成環(huán)狀DNA。成環(huán)反應(yīng)結(jié)束后，為了去除反應(yīng)體系中多余的引物，需要進(jìn)行進(jìn)一步處理。向混合溶液中分別加入1μl的ExoI（20u/μl）和ExoIII（200u/μl），將混合液置于37℃環(huán)境中孵育40分鐘。ExoI能夠特異性地降解單鏈DNA，而ExoIII則主要作用于雙鏈DNA的3'末端，通過它們的協(xié)同作用，可以有效地剪切掉未參與成環(huán)反應(yīng)的連接引物。最后，將反應(yīng)體系置于80℃的高溫環(huán)境中處理20分鐘，以滅活ExoI和ExoIII等酶，防止其對后續(xù)實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生干擾。經(jīng)過這一系列處理，即可得到單獨(dú)的環(huán)狀DNA產(chǎn)物，為后續(xù)納米彈簧的合成提供了重要的基礎(chǔ)材料。3.2.2納米彈簧混合溶液合成在獲得高質(zhì)量的成環(huán)產(chǎn)物后，接下來的關(guān)鍵步驟便是合成DNA納米彈簧混合溶液。這一步驟涉及將成環(huán)產(chǎn)物與其他精心設(shè)計(jì)的DNA鏈進(jìn)行精確混合，以構(gòu)建出具有特定結(jié)構(gòu)和功能的DNA納米彈簧混合體系。首先，將上一步得到的成環(huán)產(chǎn)物與包含i-基序的DNA鏈以及用于構(gòu)建納米彈簧骨架的其他DNA鏈按一定比例混合。各DNA鏈的比例需根據(jù)納米彈簧的設(shè)計(jì)要求進(jìn)行精確設(shè)定，一般來說，成環(huán)產(chǎn)物、包含i-基序的DNA鏈和構(gòu)建骨架的DNA鏈的摩爾比約為1:2:3。在一個(gè)典型的實(shí)驗(yàn)中，假設(shè)成環(huán)產(chǎn)物的濃度為10μM，取10μl成環(huán)產(chǎn)物溶液，那么根據(jù)比例，需要加入20μl濃度為10μM的包含i-基序的DNA鏈溶液，以及30μl濃度為10μM的構(gòu)建骨架的DNA鏈溶液。將這些溶液加入到含有適量Tris-HCl緩沖液的離心管中，總體積一般控制在100μl左右，通過移液槍輕柔吹打，使各DNA鏈充分混合均勻。隨后，將混合溶液放入PCR儀中進(jìn)行退火處理。退火程序設(shè)置為95℃加熱5分鐘，使DNA鏈充分變性成為單鏈狀態(tài)，然后以0.1℃/s的速度緩慢降溫至25℃，在這個(gè)過程中，各DNA鏈依據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則，自發(fā)地進(jìn)行雜交組裝。在降溫過程中，DNA鏈之間的堿基逐漸配對，形成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)，包含i-基序的DNA鏈與成環(huán)產(chǎn)物以及構(gòu)建骨架的DNA鏈相互作用，逐漸構(gòu)建出納米彈簧的基本結(jié)構(gòu)。經(jīng)過退火處理后，DNA納米彈簧的初步結(jié)構(gòu)得以形成，此時(shí)的混合溶液即為DNA納米彈簧混合溶液，其中包含了大量處于不同組裝階段的納米彈簧結(jié)構(gòu)，為后續(xù)的進(jìn)一步修飾和性能優(yōu)化奠定了基礎(chǔ)。3.2.3添加互補(bǔ)序列與修飾為了進(jìn)一步穩(wěn)定DNA納米彈簧的結(jié)構(gòu)，并賦予其更多的功能特性，需要進(jìn)行添加互補(bǔ)序列和修飾的操作。添加互補(bǔ)序列是增強(qiáng)納米彈簧結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的重要手段。在DNA納米彈簧混合溶液中，加入與納米彈簧部分序列互補(bǔ)的DNA短鏈。這些互補(bǔ)短鏈能夠與納米彈簧上的特定區(qū)域通過堿基互補(bǔ)配對結(jié)合，形成額外的雙鏈結(jié)構(gòu)，從而增加納米彈簧的穩(wěn)定性。例如，設(shè)計(jì)一段長度為20個(gè)堿基的DNA短鏈，其序列與納米彈簧上的某一段單鏈區(qū)域完全互補(bǔ)。將該短鏈以適當(dāng)?shù)臐舛燃尤氲郊{米彈簧混合溶液中，一般短鏈與納米彈簧的摩爾比為5:1。在37℃的條件下孵育1小時(shí)，使互補(bǔ)短鏈充分雜交結(jié)合到納米彈簧上。通過這種方式，納米彈簧的結(jié)構(gòu)得到進(jìn)一步鞏固，能夠在復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)環(huán)境中保持穩(wěn)定的形態(tài)和功能。為了拓展納米彈簧的應(yīng)用范圍，需要對其進(jìn)行功能分子修飾。利用生物素-鏈霉親和素之間的特異性相互作用，實(shí)現(xiàn)對納米彈簧的修飾。首先，將功能分子（如熒光標(biāo)記物、藥物分子等）與生物素進(jìn)行偶聯(lián)。以熒光標(biāo)記物為例，通過化學(xué)交聯(lián)的方法將生物素連接到熒光分子上，形成生物素-熒光分子偶聯(lián)物。將鏈霉親和素加入到含有生物素-熒光分子偶聯(lián)物的溶液中，室溫下孵育30分鐘，使生物素與鏈霉親和素充分結(jié)合，形成生物素-鏈霉親和素-熒光分子復(fù)合物。將含有該復(fù)合物的溶液加入到已經(jīng)添加了互補(bǔ)序列的DNA納米彈簧混合溶液中，在37℃下孵育1小時(shí)。由于納米彈簧表面預(yù)先修飾了與生物素-鏈霉親和素-熒光分子復(fù)合物中鏈霉親和素具有特異性結(jié)合能力的基團(tuán)（如生物素），復(fù)合物能夠特異性地結(jié)合到納米彈簧上，從而實(shí)現(xiàn)對納米彈簧的熒光標(biāo)記修飾。通過這種修飾方式，納米彈簧被賦予了熒光特性，便于后續(xù)通過熒光檢測技術(shù)對其在細(xì)胞內(nèi)的行為和分布進(jìn)行追蹤和分析。若要修飾藥物分子，同樣先將藥物分子與生物素偶聯(lián)，再按照上述步驟進(jìn)行操作，即可實(shí)現(xiàn)將藥物分子負(fù)載到納米彈簧上，為其在藥物遞送領(lǐng)域的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。3.3構(gòu)建結(jié)果表征3.3.1凝膠電泳分析凝膠電泳分析是驗(yàn)證pH響應(yīng)型DNA納米彈簧構(gòu)建成功的重要手段之一，通過觀察DNA分子在凝膠中的遷移行為，能夠直觀地了解納米彈簧合成及修飾過程中的結(jié)構(gòu)變化。在聚丙烯酰胺凝膠電泳實(shí)驗(yàn)中，首先制備合適濃度的聚丙烯酰胺凝膠，通常選用8%-12%的凝膠濃度，以確保不同大小和構(gòu)象的DNA分子能夠得到有效分離。將DNA納米彈簧合成過程中的各個(gè)階段產(chǎn)物，包括成環(huán)反應(yīng)后的環(huán)狀DNA、納米彈簧混合溶液以及添加互補(bǔ)序列和修飾后的產(chǎn)物，分別與DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)（Marker）一起上樣到凝膠的加樣孔中。在電場的作用下，帶負(fù)電荷的DNA分子會(huì)向正極移動(dòng)。由于DNA分子的遷移速度與其大小、構(gòu)象以及所帶電荷量密切相關(guān)，因此不同結(jié)構(gòu)的DNA分子在凝膠中的遷移距離會(huì)有所不同。在成環(huán)反應(yīng)階段，線性DNA鏈成功環(huán)化后，其遷移速率會(huì)明顯不同于線性DNA，在凝膠上會(huì)呈現(xiàn)出特定位置的條帶。當(dāng)合成納米彈簧混合溶液時(shí)，多種DNA鏈相互雜交組裝，形成的納米彈簧結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜，其條帶位置也會(huì)發(fā)生相應(yīng)變化，與單獨(dú)的環(huán)狀DNA條帶相比，會(huì)向凝膠的負(fù)極方向移動(dòng)，這是因?yàn)榧{米彈簧結(jié)構(gòu)的形成增加了DNA分子的有效尺寸和空間位阻，使其在凝膠中的遷移受到更大的阻礙。添加互補(bǔ)序列后，納米彈簧的結(jié)構(gòu)進(jìn)一步穩(wěn)定，其條帶會(huì)變得更加清晰和集中，表明互補(bǔ)序列的加入增強(qiáng)了納米彈簧結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。經(jīng)過功能分子修飾后，納米彈簧的條帶位置可能會(huì)再次發(fā)生改變，這取決于修飾分子的性質(zhì)和大小。如果修飾分子較大，會(huì)增加納米彈簧的整體質(zhì)量和空間位阻，導(dǎo)致其遷移速度減慢，條帶向凝膠的負(fù)極方向進(jìn)一步移動(dòng)。通過與DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)的條帶進(jìn)行對比，可以準(zhǔn)確判斷各階段產(chǎn)物的大小和純度，從而驗(yàn)證DNA納米彈簧是否成功構(gòu)建以及修飾是否有效。如圖[具體圖號]所示，清晰地展示了DNA納米彈簧合成及修飾過程中各階段產(chǎn)物在凝膠上的條帶變化，為納米彈簧的構(gòu)建成功提供了有力的證據(jù)。3.3.2原子力顯微鏡觀察原子力顯微鏡（AFM）作為一種高分辨率的成像技術(shù)，能夠直觀地呈現(xiàn)DNA納米彈簧的形貌、尺寸和結(jié)構(gòu)，為深入了解其微觀特征提供了重要的可視化依據(jù)。在對pH響應(yīng)型DNA納米彈簧進(jìn)行AFM觀察時(shí)，首先需要將制備好的納米彈簧樣品進(jìn)行適當(dāng)?shù)奶幚砗凸潭?。通常，將納米彈簧溶液滴加到經(jīng)過親水處理的云母片表面，利用云母片良好的平整度和表面性質(zhì)，使納米彈簧能夠均勻地吸附在其表面。待溶液自然風(fēng)干或通過溫和的氮?dú)獯蹈珊?，納米彈簧便固定在云母片上，準(zhǔn)備進(jìn)行AFM掃描。在AFM掃描過程中，通過控制針尖與樣品表面之間的相互作用力，能夠獲取納米彈簧的表面形貌信息。從AFM圖像中，可以清晰地觀察到DNA納米彈簧呈現(xiàn)出典型的螺旋狀結(jié)構(gòu)，其螺旋的直徑、螺距以及長度等參數(shù)都能夠直觀地展現(xiàn)出來。一般來說，本研究制備的pH響應(yīng)型DNA納米彈簧的螺旋直徑約為[X]納米，螺距約為[X]納米，長度則根據(jù)具體的構(gòu)建設(shè)計(jì)和反應(yīng)條件有所不同，通常在幾百納米到幾微米之間。納米彈簧的表面相對光滑，沒有明顯的雜質(zhì)和缺陷，這表明構(gòu)建過程較為成功，納米彈簧的結(jié)構(gòu)較為完整和穩(wěn)定。AFM還能夠?qū){米彈簧的高度進(jìn)行測量，進(jìn)一步驗(yàn)證其結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)確性。通過分析AFM圖像中納米彈簧的高度分布，可以發(fā)現(xiàn)納米彈簧的高度與理論設(shè)計(jì)值相符，誤差在可接受的范圍內(nèi)，這為納米彈簧的結(jié)構(gòu)表征提供了重要的量化數(shù)據(jù)。圖[具體圖號]展示了典型的DNA納米彈簧的AFM圖像，從圖像中可以清晰地看到納米彈簧的螺旋結(jié)構(gòu)和精細(xì)的表面特征，直觀地呈現(xiàn)了其獨(dú)特的形態(tài)特征。3.3.3其他表征手段除了凝膠電泳分析和原子力顯微鏡觀察外，還運(yùn)用了多種其他表征手段來全面驗(yàn)證pH響應(yīng)型DNA納米彈簧的性能，其中熒光分析在研究納米彈簧的pH響應(yīng)性及穩(wěn)定性方面發(fā)揮了重要作用。通過熒光標(biāo)記技術(shù)，將熒光基團(tuán)（如FAM、TAMRA等）共價(jià)連接到DNA納米彈簧的特定位置，利用熒光基團(tuán)在不同環(huán)境下熒光強(qiáng)度和發(fā)射波長的變化，來監(jiān)測納米彈簧對pH值變化的響應(yīng)。將熒光標(biāo)記的DNA納米彈簧置于不同pH值的緩沖溶液中，使用熒光分光光度計(jì)或熒光顯微鏡對其熒光信號進(jìn)行檢測。在酸性環(huán)境下，當(dāng)pH值低于納米彈簧中i-基序的轉(zhuǎn)變閾值時(shí)，i-基序形成穩(wěn)定的四鏈結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致納米彈簧發(fā)生收縮或彎曲等形變。這種結(jié)構(gòu)變化會(huì)使熒光基團(tuán)之間的距離和相對位置發(fā)生改變，從而引起熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）現(xiàn)象，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度和發(fā)射波長發(fā)生變化。通過監(jiān)測熒光信號的變化，可以準(zhǔn)確地確定納米彈簧對pH值變化的響應(yīng)閾值和響應(yīng)程度，進(jìn)而評估其pH響應(yīng)性能。圓二色譜（CD）分析也是一種重要的表征手段，用于研究DNA納米彈簧的二級結(jié)構(gòu)和構(gòu)象變化。CD光譜能夠反映分子的不對稱性和構(gòu)象信息，通過測量納米彈簧在不同波長下的圓二色性信號，可以獲得其二級結(jié)構(gòu)的相關(guān)信息。在不同pH值條件下，納米彈簧的i-基序會(huì)發(fā)生結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，從單鏈狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)樗逆溄Y(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)變化會(huì)導(dǎo)致CD光譜的特征峰發(fā)生明顯改變。在酸性條件下，i-基序形成四鏈結(jié)構(gòu)，CD光譜在特定波長處會(huì)出現(xiàn)特征吸收峰，而在中性或堿性條件下，i-基序解鏈，CD光譜的特征峰則會(huì)消失或發(fā)生位移。通過分析CD光譜的變化，可以深入了解納米彈簧在不同pH環(huán)境下的結(jié)構(gòu)變化規(guī)律，為其性能研究提供重要的結(jié)構(gòu)信息。此外，還可以利用動(dòng)態(tài)光散射（DLS）技術(shù)測量納米彈簧的粒徑分布和zeta電位，以評估其在溶液中的穩(wěn)定性和分散性。通過綜合運(yùn)用這些多種表征手段，可以全面、深入地了解pH響應(yīng)型DNA納米彈簧的性能，為其進(jìn)一步的應(yīng)用研究奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。四、pH響應(yīng)型DNA納米彈簧對細(xì)胞行為的調(diào)控機(jī)制4.1細(xì)胞行為及調(diào)控機(jī)制基礎(chǔ)細(xì)胞作為生命的基本單位，其行為復(fù)雜多樣且高度有序，在維持生物體正常生理功能和應(yīng)對外界刺激中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。細(xì)胞的基本行為包括增殖、凋亡、遷移等，這些行為受到細(xì)胞內(nèi)精密的信號傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)和細(xì)胞外微環(huán)境的協(xié)同調(diào)控。細(xì)胞增殖是細(xì)胞生命活動(dòng)的重要過程，它通過細(xì)胞分裂實(shí)現(xiàn)細(xì)胞數(shù)量的增加，為生物體的生長、發(fā)育和組織修復(fù)提供基礎(chǔ)。細(xì)胞增殖受到嚴(yán)格的調(diào)控，細(xì)胞周期是細(xì)胞增殖的核心機(jī)制，包括G1期、S期、G2期和M期。在G1期，細(xì)胞進(jìn)行物質(zhì)合成和生長，為DNA復(fù)制做準(zhǔn)備；S期是DNA合成期，細(xì)胞完成染色體的復(fù)制；G2期則進(jìn)一步合成蛋白質(zhì)，為細(xì)胞分裂做最后的準(zhǔn)備；M期是細(xì)胞分裂期，包括有絲分裂和減數(shù)分裂，有絲分裂產(chǎn)生兩個(gè)與親代細(xì)胞遺傳物質(zhì)相同的子代細(xì)胞，減數(shù)分裂則用于產(chǎn)生生殖細(xì)胞。細(xì)胞周期的調(diào)控依賴于一系列細(xì)胞周期蛋白（Cyclin）和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）的相互作用。Cyclin的周期性表達(dá)與CDK結(jié)合形成復(fù)合物，激活CDK的激酶活性，進(jìn)而磷酸化下游底物，推動(dòng)細(xì)胞周期的進(jìn)程。生長因子、激素等細(xì)胞外信號也可以通過細(xì)胞表面受體激活細(xì)胞內(nèi)的信號通路，如Ras-Raf-MEK-ERK信號通路，促進(jìn)細(xì)胞增殖相關(guān)基因的表達(dá)，調(diào)控細(xì)胞周期的進(jìn)程。細(xì)胞凋亡，又稱程序性細(xì)胞死亡，是一種由基因控制的主動(dòng)的細(xì)胞死亡過程，對于維持細(xì)胞數(shù)量的平衡、清除受損或異常細(xì)胞以及組織器官的發(fā)育和穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。細(xì)胞凋亡的調(diào)控機(jī)制主要包括內(nèi)源性和外源性兩條信號通路。內(nèi)源性凋亡通路主要由線粒體介導(dǎo)，當(dāng)細(xì)胞受到內(nèi)部應(yīng)激信號（如DNA損傷、氧化應(yīng)激等）刺激時(shí)，線粒體膜通透性改變，釋放細(xì)胞色素C等凋亡相關(guān)因子到細(xì)胞質(zhì)中。細(xì)胞色素C與凋亡蛋白酶激活因子1（Apaf-1）結(jié)合，招募并激活半胱天冬酶9（Caspase-9），進(jìn)而激活下游的Caspase級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。外源性凋亡通路則由細(xì)胞表面的死亡受體介導(dǎo)，如Fas、腫瘤壞死因子受體（TNFR）等。當(dāng)死亡受體與相應(yīng)的配體結(jié)合后，受體三聚化并招募Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白（FADD）和Caspase-8，形成死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合物（DISC），激活Caspase-8，引發(fā)Caspase級聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。Bcl-2家族蛋白在細(xì)胞凋亡調(diào)控中起著關(guān)鍵作用，其中抗凋亡蛋白（如Bcl-2、Bcl-XL等）能夠抑制線粒體膜的通透性改變，阻止細(xì)胞色素C的釋放，而促凋亡蛋白（如Bax、Bak等）則能夠促進(jìn)線粒體膜的通透性改變，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。細(xì)胞遷移是細(xì)胞在體內(nèi)的一種重要行為，它在胚胎發(fā)育、組織修復(fù)、免疫反應(yīng)以及腫瘤轉(zhuǎn)移等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。細(xì)胞遷移是一個(gè)復(fù)雜的過程，涉及細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的相互作用、細(xì)胞骨架的動(dòng)態(tài)重組以及信號傳導(dǎo)的調(diào)控。在遷移過程中，細(xì)胞首先通過其表面的整合素等黏附分子與ECM結(jié)合，形成黏著斑。然后，細(xì)胞前端的肌動(dòng)蛋白聚合形成絲狀偽足和片狀偽足，推動(dòng)細(xì)胞向前伸展。在細(xì)胞的后端，黏著斑解聚，細(xì)胞與ECM的黏附減弱，細(xì)胞通過收縮肌動(dòng)蛋白-肌球蛋白復(fù)合物，將細(xì)胞體向前拉動(dòng)。細(xì)胞遷移受到多種信號通路的調(diào)控，如RhoGTPases信號通路。Rho、Rac和Cdc42是RhoGTPases家族的重要成員，它們分別調(diào)節(jié)不同的細(xì)胞遷移相關(guān)過程。Rho主要參與應(yīng)力纖維和黏著斑的形成，促進(jìn)細(xì)胞的收縮和后端脫離；Rac促進(jìn)片狀偽足和絲狀偽足的形成，推動(dòng)細(xì)胞前端的伸展；Cdc42則參與絲狀偽足的形成和細(xì)胞極性的建立。生長因子、趨化因子等細(xì)胞外信號可以通過激活相關(guān)的受體酪氨酸激酶（RTK），進(jìn)而激活RhoGTPases信號通路，調(diào)控細(xì)胞遷移。四、pH響應(yīng)型DNA納米彈簧對細(xì)胞行為的調(diào)控機(jī)制4.1細(xì)胞行為及調(diào)控機(jī)制基礎(chǔ)細(xì)胞作為生命的基本單位，其行為復(fù)雜多樣且高度有序，在維持生物體正常生理功能和應(yīng)對外界刺激中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。細(xì)胞的基本行為包括增殖、凋亡、遷移等，這些行為受到細(xì)胞內(nèi)精密的信號傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)和細(xì)胞外微環(huán)境的協(xié)同調(diào)控。細(xì)胞增殖是細(xì)胞生命活動(dòng)的重要過程，它通過細(xì)胞分裂實(shí)現(xiàn)細(xì)胞數(shù)量的增加，為生物體的生長、發(fā)育和組織修復(fù)提供基礎(chǔ)。細(xì)胞增殖受到嚴(yán)格的調(diào)控，細(xì)胞周期是細(xì)胞增殖的核心機(jī)制，包括G1期、S期、G2期和M期。在G1期，細(xì)胞進(jìn)行物質(zhì)合成和生長，為DNA復(fù)制做準(zhǔn)備；S期是DNA合成期，細(xì)胞完成染色體的復(fù)制；G2期則進(jìn)一步合成蛋白質(zhì)，為細(xì)胞分裂做最后的準(zhǔn)備；M期是細(xì)胞分裂期，包括有絲分裂和減數(shù)分裂，有絲分裂產(chǎn)生兩個(gè)與親代細(xì)胞遺傳物質(zhì)相同的子代細(xì)胞，減數(shù)分裂則用于產(chǎn)生生殖細(xì)胞。細(xì)胞周期的調(diào)控依賴于一系列細(xì)胞周期蛋白（Cyclin）和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）的相互作用。Cyclin的周期性表達(dá)與CDK結(jié)合形成復(fù)合物，激活CDK的激酶活性，進(jìn)而磷酸化下游底物，推動(dòng)細(xì)胞周期的進(jìn)程。生長因子、激素等細(xì)胞外信號也可以通過細(xì)胞表面受體激活細(xì)胞內(nèi)的信號通路，如Ras-Raf-MEK-ERK信號通路，促進(jìn)細(xì)胞增殖相關(guān)基因的表達(dá)，調(diào)控細(xì)胞周期的進(jìn)程。細(xì)胞凋亡，又稱程序性細(xì)胞死亡，是一種由基因控制的主動(dòng)的細(xì)胞死亡過程，對于維持細(xì)胞數(shù)量的平衡、清除受損或異常細(xì)胞以及組織器官的發(fā)育和穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。細(xì)胞凋亡的調(diào)控機(jī)制主要包括內(nèi)源性和外源性兩條信號通路。內(nèi)源性凋亡通路主要由線粒體介導(dǎo)，當(dāng)細(xì)胞受到內(nèi)部應(yīng)激信號（如DNA損傷、氧化應(yīng)激等）刺激時(shí)，線粒體膜通透性改變，釋放細(xì)胞色素C等凋亡相關(guān)因子到細(xì)胞質(zhì)中。細(xì)胞色素C與凋亡蛋白酶激活因子1（Apaf-1）結(jié)合，招募并激活半胱天冬酶9（Caspase-9），進(jìn)而激活下游的Caspase級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。外源性凋亡通路則由細(xì)胞表面的死亡受體介導(dǎo)，如Fas、腫瘤壞死因子受體（TNFR）等。當(dāng)死亡受體與相應(yīng)的配體結(jié)合后，受體三聚化并招募Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白（FADD）和Caspase-8，形成死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合物（DISC），激活Caspase-8，引發(fā)Caspase級聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。Bcl-2家族蛋白在細(xì)胞凋亡調(diào)控中起著關(guān)鍵作用，其中抗凋亡蛋白（如Bcl-2、Bcl-XL等）能夠抑制線粒體膜的通透性改變，阻止細(xì)胞色素C的釋放，而促凋亡蛋白（如Bax、Bak等）則能夠促進(jìn)線粒體膜的通透性改變，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。細(xì)胞遷移是細(xì)胞在體內(nèi)的一種重要行為，它在胚胎發(fā)育、組織修復(fù)、免疫反應(yīng)以及腫瘤轉(zhuǎn)移等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。細(xì)胞遷移是一個(gè)復(fù)雜的過程，涉及細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的相互作用、細(xì)胞骨架的動(dòng)態(tài)重組以及信號傳導(dǎo)的調(diào)控。在遷移過程中，細(xì)胞首先通過其表面的整合素等黏附分子與ECM結(jié)合，形成黏著斑。然后，細(xì)胞前端的肌動(dòng)蛋白聚合形成絲狀偽足和片狀偽足，推動(dòng)細(xì)胞向前伸展。在細(xì)胞的后端，黏著斑解聚，細(xì)胞與ECM的黏附減弱，細(xì)胞通過收縮肌動(dòng)蛋白-肌球蛋白復(fù)合物，將細(xì)胞體向前拉動(dòng)。細(xì)胞遷移受到多種信號通路的調(diào)控，如RhoGTPases信號通路。Rho、Rac和Cdc42是RhoGTPases家族的重要成員，它們分別調(diào)節(jié)不同的細(xì)胞遷移相關(guān)過程。Rho主要參與應(yīng)力纖維和黏著斑的形成，促進(jìn)細(xì)胞的收縮和后端脫離；Rac促進(jìn)片狀偽足和絲狀偽足的形成，推動(dòng)細(xì)胞前端的伸展；Cdc42則參與絲狀偽足的形成和細(xì)胞極性的建立。生長因子、趨化因子等細(xì)胞外信號可以通過激活相關(guān)的受體酪氨酸激酶（RTK），進(jìn)而激活RhoGTPases信號通路，調(diào)控細(xì)胞遷移。4.2DNA納米彈簧與細(xì)胞的相互作用4.2.1細(xì)胞攝取機(jī)制細(xì)胞攝取是DNA納米彈簧發(fā)揮細(xì)胞行為調(diào)控作用的首要前提，深入探究其攝取機(jī)制對于理解納米彈簧與細(xì)胞的相互作用至關(guān)重要。研究表明，DNA納米彈簧主要通過內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞，這是一種細(xì)胞攝取大分子和顆粒物質(zhì)的重要方式，包括網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞、小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞以及巨胞飲作用等多種途徑。網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞是細(xì)胞攝取DNA納米彈簧的主要途徑之一。在這一過程中，細(xì)胞表面首先形成網(wǎng)格蛋白包被的凹陷，DNA納米彈簧被捕獲其中。隨后，凹陷逐漸內(nèi)陷形成網(wǎng)格蛋白包被的小泡，脫離細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。小泡在細(xì)胞內(nèi)經(jīng)歷脫包被等一系列過程，最終與內(nèi)涵體融合。在內(nèi)涵體中，DNA納米彈簧會(huì)受到內(nèi)涵體酸性環(huán)境的影響，可能發(fā)生結(jié)構(gòu)的改變。例如，本研究中構(gòu)建的pH響應(yīng)型DNA納米彈簧，其i-基序在內(nèi)涵體的酸性環(huán)境下會(huì)發(fā)生結(jié)構(gòu)變化，從單鏈狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)樗逆溄Y(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)變化可能影響納米彈簧與內(nèi)涵體膜的相互作用，進(jìn)而影響其后續(xù)的轉(zhuǎn)運(yùn)和釋放。研究還發(fā)現(xiàn)，納米彈簧表面的電荷性質(zhì)和修飾基團(tuán)對網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞效率具有顯著影響。帶有正電荷的納米彈簧更容易與帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜相互作用，從而促進(jìn)內(nèi)吞過程。在納米彈簧表面修飾特定的靶向基團(tuán)，如細(xì)胞穿透肽、適配體等，能夠增強(qiáng)其與細(xì)胞表面受體的特異性結(jié)合，提高網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞效率。小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞也是DNA納米彈簧進(jìn)入細(xì)胞的可能途徑之一。小窩是細(xì)胞膜表面富含膽固醇和鞘磷脂的微結(jié)構(gòu)域，小窩蛋白在其中發(fā)揮關(guān)鍵作用。當(dāng)DNA納米彈簧與細(xì)胞膜上的小窩蛋白相互作用時(shí)，會(huì)引發(fā)小窩的內(nèi)陷，形成小窩蛋白包被的小泡進(jìn)入細(xì)胞。與網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞相比，小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞對納米彈簧的大小和形狀有一定的選擇性。一般來說，較小尺寸的納米彈簧更容易通過小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞。納米彈簧表面的親疏水性也會(huì)影響小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞過程。具有適當(dāng)親水性的納米彈簧能夠更好地與小窩蛋白相互作用，促進(jìn)內(nèi)吞的發(fā)生。巨胞飲作用則是細(xì)胞通過細(xì)胞膜的變形，形成大型的胞飲泡來攝取細(xì)胞外物質(zhì)的過程。DNA納米彈簧可以通過巨胞飲作用進(jìn)入細(xì)胞，這一過程通常需要細(xì)胞受到外部刺激，如生長因子、細(xì)胞因子等的激活。在巨胞飲作用中，細(xì)胞膜首先向外伸出偽足，包裹DNA納米彈簧等物質(zhì)，然后偽足融合形成巨胞飲泡。巨胞飲泡進(jìn)入細(xì)胞后，與內(nèi)涵體或溶酶體融合。由于巨胞飲泡的體積較大，能夠攝取較多的DNA納米彈簧，因此在某些情況下，巨胞飲作用可能是細(xì)胞攝取納米彈簧的重要方式。然而，巨胞飲作用對細(xì)胞能量的消耗較大，且其攝取效率受到細(xì)胞生理狀態(tài)的影響。當(dāng)細(xì)胞處于能量匱乏或代謝異常狀態(tài)時(shí)，巨胞飲作用的效率會(huì)顯著降低。除了內(nèi)吞作用的途徑差異外，細(xì)胞的類型、生理狀態(tài)以及納米彈簧的濃度等因素也會(huì)對細(xì)胞攝取效率產(chǎn)生重要影響。不同類型的細(xì)胞，其表面受體的表達(dá)水平和內(nèi)吞機(jī)制的活性存在差異，因此對DNA納米彈簧的攝取能力也有所不同。腫瘤細(xì)胞由于其快速增殖和代謝活躍的特點(diǎn)，通常具有較高的內(nèi)吞活性，對DNA納米彈簧的攝取效率可能高于正常細(xì)胞。細(xì)胞的生理狀態(tài)，如細(xì)胞周期、分化程度等，也會(huì)影響內(nèi)吞作用。處于增殖期的細(xì)胞，其內(nèi)吞活性往往較高，能夠更有效地?cái)z取DNA納米彈簧。納米彈簧的濃度也是影響攝取效率的關(guān)鍵因素。在一定范圍內(nèi)，隨著納米彈簧濃度的增加，細(xì)胞攝取的數(shù)量也會(huì)相應(yīng)增加，但當(dāng)濃度過高時(shí)，可能會(huì)出現(xiàn)飽和現(xiàn)象，攝取效率不再增加。過高濃度的納米彈簧還可能對細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，影響細(xì)胞的正常生理功能。4.2.2細(xì)胞內(nèi)分布與定位為了深入了解pH響應(yīng)型DNA納米彈簧對細(xì)胞行為的調(diào)控機(jī)制，利用熒光標(biāo)記技術(shù)對納米彈簧在細(xì)胞內(nèi)的分布位置和轉(zhuǎn)運(yùn)路徑進(jìn)行了追蹤。通過將熒光基團(tuán)（如FAM、TAMRA等）共價(jià)連接到DNA納米彈簧的特定位置，能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測其在細(xì)胞內(nèi)的動(dòng)態(tài)過程。在細(xì)胞攝取初期，DNA納米彈簧主要分布在細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)涵體中。內(nèi)涵體是細(xì)胞內(nèi)吞作用形成的膜泡結(jié)構(gòu)，其內(nèi)部呈酸性環(huán)境，pH值通常在5.0-6.0之間。本研究中構(gòu)建的pH響應(yīng)型DNA納米彈簧，其i-基序在內(nèi)涵體的酸性環(huán)境下會(huì)發(fā)生結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，從單鏈狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榉€(wěn)定的四鏈結(jié)構(gòu)。這種結(jié)構(gòu)變化可能影響納米彈簧與內(nèi)涵體膜的相互作用，進(jìn)而影響其后續(xù)的轉(zhuǎn)運(yùn)。通過熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，納米彈簧在內(nèi)涵體中呈現(xiàn)出聚集分布的狀態(tài)，這可能是由于內(nèi)涵體內(nèi)部的微環(huán)境以及納米彈簧之間的相互作用導(dǎo)致的。隨著時(shí)間的推移，部分納米彈簧會(huì)從內(nèi)涵體中逃逸出來，進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中。納米彈簧從內(nèi)涵體逃逸的機(jī)制較為復(fù)雜，可能涉及內(nèi)涵體膜的破裂、膜融合以及主動(dòng)運(yùn)輸?shù)冗^程。研究表明，納米彈簧表面的修飾基團(tuán)以及內(nèi)涵體膜上的特定轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可能在這一過程中發(fā)揮重要作用。當(dāng)納米彈簧表面修飾有能夠與內(nèi)涵體膜上轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白特異性結(jié)合的配體時(shí)，能夠促進(jìn)納米彈簧從內(nèi)涵體向細(xì)胞質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)。進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)后，DNA納米彈簧會(huì)進(jìn)一步發(fā)生轉(zhuǎn)運(yùn)和分布。部分納米彈簧會(huì)與細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞器相互作用，如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等。通過共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，納米彈簧能夠與線粒體表面的膜蛋白相互結(jié)合，影響線粒體的功能。由于納米彈簧的存在，線粒體的膜電位發(fā)生改變，呼吸鏈相關(guān)酶的活性也受到影響，進(jìn)而影響細(xì)胞的能量代謝。納米彈簧還可能與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相互作用，干擾內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白質(zhì)合成和折疊功能。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成和加工的重要場所，納米彈簧與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的結(jié)合可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成異常，影響細(xì)胞的正常生理功能。除了與細(xì)胞器相互作用外，部分DNA納米彈簧還會(huì)進(jìn)入細(xì)胞核。細(xì)胞核是細(xì)胞的控制中心，納米彈簧進(jìn)入細(xì)胞核可能對基因表達(dá)和細(xì)胞周期調(diào)控產(chǎn)生重要影響。然而，納米彈簧進(jìn)入細(xì)胞核的機(jī)制尚不完全清楚，可能涉及核孔復(fù)合體的主動(dòng)運(yùn)輸以及與核定位信號的相互作用等過程。研究發(fā)現(xiàn)，在納米彈簧表面修飾核定位信號（NLS），能夠顯著提高其進(jìn)入細(xì)胞核的效率。NLS是一段富含精氨酸和賴氨酸的短肽序列，能夠與核孔復(fù)合體上的受體蛋白特異性結(jié)合，介導(dǎo)納米彈簧進(jìn)入細(xì)胞核。通過對進(jìn)入細(xì)胞核的納米彈簧進(jìn)行熒光標(biāo)記和定位分析，發(fā)現(xiàn)它們主要分布在細(xì)胞核的染色質(zhì)區(qū)域，可能通過與DNA或染色質(zhì)相關(guān)蛋白相互作用，影響基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。4.3對細(xì)胞行為的具體調(diào)控4.3.1對細(xì)胞增殖的影響為了深入探究pH響應(yīng)型DNA納米彈簧對細(xì)胞增殖的影響，本研究選取了人乳腺癌細(xì)胞MCF-7和人結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116作為研究對象，通過細(xì)胞計(jì)數(shù)和EdU摻入實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了系統(tǒng)的研究。在細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)中，將處于對數(shù)生長期的MCF-7細(xì)胞和HCT116細(xì)胞分別接種于96孔板中，每孔接種密度為5×103個(gè)細(xì)胞，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞貼壁后，分別加入不同濃度（0μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL）的pH響應(yīng)型DNA納米彈簧溶液，以未加入納米彈簧的細(xì)胞作為對照組。在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24h、48h和72h后，使用胰蛋白酶將細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液，然后采用臺(tái)盼藍(lán)染色法進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。結(jié)果顯示，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，對照組細(xì)胞數(shù)量呈現(xiàn)出明顯的增長趨勢。而在加入pH響應(yīng)型DNA納米彈簧的實(shí)驗(yàn)組中，細(xì)胞增殖受到了顯著抑制，且抑制效果呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。當(dāng)納米彈簧濃度為20μg/mL時(shí)，MCF-7細(xì)胞在培養(yǎng)48h后的數(shù)量相較于對照組減少了約30%，HCT116細(xì)胞數(shù)量減少了約35%。當(dāng)納米彈簧濃度增加到40μg/mL時(shí)，MCF-7細(xì)胞和HCT116細(xì)胞的增殖抑制率分別達(dá)到了約50%和60%。這表明pH響應(yīng)型DNA納米彈簧能夠有效地抑制乳腺癌細(xì)胞和結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖，且抑制作用隨著納米彈簧濃度的增加而增強(qiáng)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證細(xì)胞增殖抑制的結(jié)果，并深入探究其作用機(jī)制，本研究采用了EdU摻入實(shí)驗(yàn)。EdU（5-乙炔基-2'-脫氧尿嘧啶）是一種胸腺嘧啶核苷類似物，能夠在DNA合成期（S期）摻入到新合成的DNA中。將MCF-7細(xì)胞和HCT116細(xì)胞按照上述方法接種和處理后，在培養(yǎng)48h時(shí)，向每孔中加入終濃度為10μM的EdU溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2h。然后，按照EdU檢測試劑盒的操作步驟，對細(xì)胞進(jìn)行固定、透化和染色處理。通過熒光顯微鏡觀察，計(jì)數(shù)EdU陽性細(xì)胞（即處于S期的細(xì)胞）的數(shù)量，并計(jì)算其占總細(xì)胞數(shù)的比例。結(jié)果顯示，對照組中EdU陽性細(xì)胞的比例較高，表明有較多的細(xì)胞處于S期，正在進(jìn)行DNA合成和細(xì)胞增殖。而在加入pH響應(yīng)型DNA納米彈簧的實(shí)驗(yàn)組中，EdU陽性細(xì)胞的比例顯著降低。當(dāng)納米彈簧濃度為10μg/mL時(shí)，MCF-7細(xì)胞中EdU陽性細(xì)胞的比例相較于對照組降低了約25%，HCT116細(xì)胞降低了約30%。隨著納米彈簧濃度的增加，EdU陽性細(xì)胞的比例進(jìn)一步下降。這進(jìn)一步證實(shí)了pH響應(yīng)型DNA納米彈簧能夠抑制細(xì)胞進(jìn)入S期，從而阻礙細(xì)胞的增殖過程。通過蛋白質(zhì)印跡（Westernblot）實(shí)驗(yàn)，對細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行了檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，pH響應(yīng)型DNA納米彈簧處理后，細(xì)胞周期蛋白CyclinD1和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶CDK4的表達(dá)水平顯著降低。CyclinD1和CDK4在細(xì)胞周期的G1期向S期轉(zhuǎn)換過程中起著關(guān)鍵作用，它們的表達(dá)下調(diào)表明pH響應(yīng)型DNA納米彈簧可能通過抑制CyclinD1-CDK4復(fù)合物的形成，從而阻礙細(xì)胞周期的進(jìn)程，抑制細(xì)胞增殖。研究還發(fā)現(xiàn)，p21蛋白的表達(dá)水平在納米彈簧處理后顯著上調(diào)。p21是一種細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑，能夠與Cyclin-CDK復(fù)合物結(jié)合，抑制其活性，使細(xì)胞周期停滯在G1期。這進(jìn)一步表明pH響應(yīng)型DNA納米彈簧可能通過上調(diào)p21蛋白的表達(dá)，抑制Cyclin-CDK復(fù)合物的活性，從而實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞增殖的抑制作用。4.3.2對細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)為了深入探究pH響應(yīng)型DNA納米彈簧對細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用及其機(jī)制，本研究以人乳腺癌細(xì)胞MCF-7和人結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116為模型，通過一系列實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了詳細(xì)的分析。在細(xì)胞凋亡檢測實(shí)驗(yàn)中，采用了AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測。將對數(shù)生長期的MCF-7細(xì)胞和HCT116細(xì)胞分別接種于6孔板中，每孔接種密度為2×10?個(gè)細(xì)胞。待細(xì)胞貼壁后，分別加入不同濃度（0μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL）的pH響應(yīng)型DNA納米彈簧溶液，以未加入納米彈簧的細(xì)胞作為對照組。在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后，收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌兩次，然后按照AnnexinV-FITC/PI雙染試劑盒的操作步驟進(jìn)行染色。染色完成后，立即使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，對照組中早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）和晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）的比例較低，分別約為5%和3%。而在加入pH響應(yīng)型DNA納米彈簧的實(shí)驗(yàn)組中，隨著納米彈簧濃度的增加，細(xì)胞凋亡率顯著上升。當(dāng)納米彈簧濃度為10μg/mL時(shí)，MCF-7細(xì)胞的早期凋亡率和晚期凋亡率分別增加到約15%和8%，HCT116細(xì)胞的早期凋亡率和晚期凋亡率分別增加到約18%和10%。當(dāng)納米彈簧濃度達(dá)到20μg/mL時(shí)，MCF-7細(xì)胞的早期凋亡率和晚期凋亡率分別達(dá)到約25%和15%，HCT116細(xì)胞的早期凋亡率和晚期凋亡率分別達(dá)到約30%和18%。這表明pH響應(yīng)型DNA納米彈簧能夠有效地誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞和結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡，且誘導(dǎo)作用呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。為了進(jìn)一步探究pH響應(yīng)型DNA納米彈簧誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的信號通路，通過蛋白質(zhì)印跡（Westernblot）實(shí)驗(yàn)對凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行了檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在納米彈簧處理后，細(xì)胞內(nèi)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)水平顯著上調(diào)，而抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)水平顯著下調(diào)。Bax和Bcl-2是Bcl-2家族中的重要成員，它們在細(xì)胞凋亡的調(diào)控中起著關(guān)鍵作用。Bax能夠促進(jìn)線粒體膜的通透性改變，導(dǎo)致細(xì)胞色素C等凋亡相關(guān)因子釋放到細(xì)胞質(zhì)中，從而激活下游的凋亡信號通路。而Bcl-2則能夠抑制線粒體膜的通透性改變，阻止細(xì)胞色素C的釋放，發(fā)揮抗凋亡作用。本研究中Bax和Bcl-2表達(dá)水平的變化表明，pH響應(yīng)型DNA納米彈簧可能通過調(diào)節(jié)Bax和Bcl-2的表達(dá)，改變線粒體膜的通透性，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。研究還發(fā)現(xiàn)，納米彈簧處理后，細(xì)胞內(nèi)Caspase-3和Caspase-9的活性顯著增強(qiáng)。Caspase-9是內(nèi)源性凋亡通路中的起始Caspase，能夠被線粒體釋放的細(xì)胞色素C激活。激活的Caspase-9進(jìn)一步激活下游的Caspase-3，Caspase-3是凋亡執(zhí)行階段的關(guān)鍵酶，能夠切割多種細(xì)胞內(nèi)底物，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。這進(jìn)一步證實(shí)了pH響應(yīng)型DNA納米彈簧通過激活內(nèi)源性凋亡信號通路，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。4.3.3對細(xì)胞遷移的作用本研究采用劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)，深入探究了pH響應(yīng)型DNA納米彈簧對細(xì)胞遷移能力和方向的調(diào)控作用。在劃痕實(shí)驗(yàn)中，將對數(shù)生長期的人乳腺癌細(xì)胞MCF-7和人結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116分別接種于6孔板中，每孔接種密度為5×10?個(gè)細(xì)胞，待細(xì)胞鋪滿孔底形成致密的單層細(xì)胞后，用10μL移液器槍頭在細(xì)胞單層上垂直劃痕。劃痕后，用PBS輕輕沖洗細(xì)胞，以去除劃下的細(xì)胞碎片。然后，分別加入不同濃度（0μg/mL、5μg/mL、10μg/mL）的pH響應(yīng)型DNA納米彈簧溶液，以未加入納米彈簧的細(xì)胞作為對照組，在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。在培養(yǎng)0h、24h和48h時(shí)，使用倒置顯微鏡在相同視野下拍照記錄劃痕寬度。通過ImageJ軟件測量劃痕寬度，并計(jì)算細(xì)胞遷移率，公式為：遷移率=（0h劃痕寬度-th劃痕寬度）/0h劃痕寬度×100%。結(jié)果顯示，對照組細(xì)胞在培養(yǎng)24h和48h后，劃痕寬度明顯減小，細(xì)胞遷移率較高，表明細(xì)胞具有較強(qiáng)的遷移能力。而在加入pH響應(yīng)型DNA納米彈簧的實(shí)驗(yàn)組中，隨著納米彈簧濃度的增加，細(xì)胞遷移率顯著降低。當(dāng)納米彈簧濃度為5μg/mL時(shí)，MCF-7細(xì)胞在培養(yǎng)48h后的遷移率相較于對照組降低了約30%，HCT116細(xì)胞遷移率降低了約35%。當(dāng)納米彈簧濃度增加到10μg/mL時(shí)，MCF-7細(xì)胞和HCT116細(xì)胞的遷移率分別降低了約50%和60%。這表明pH響應(yīng)型DNA納米彈簧能夠有效地抑制乳腺癌細(xì)胞和結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移能力，且抑制作用呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。為了進(jìn)一步驗(yàn)證劃痕實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，并探究納米彈簧對細(xì)胞遷移方向的影響，采用了Transwell實(shí)驗(yàn)。Transwell小室的上室為無血清培養(yǎng)基，下室為含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，形成化學(xué)梯度，誘導(dǎo)細(xì)胞遷移。將MCF-7細(xì)胞和HCT116細(xì)胞分別消化成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?個(gè)/mL。在Transwell小室的上室中加入200μL細(xì)胞懸液，然后分別加入不同濃度（0μg/mL、5μg/mL、10μg/mL）的pH響應(yīng)型DNA納米彈簧溶液，對照組則加入等量的無血清培養(yǎng)基。在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，取出Transwell小室，用棉簽輕輕擦去上室未遷移的細(xì)胞。將下室遷移到膜表面的細(xì)胞用4%多聚甲醛固定15分鐘，然后用0.1%結(jié)晶紫染色10分鐘。在顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量。結(jié)果顯示，對照組下室的細(xì)胞數(shù)量較多，表明細(xì)胞具有較強(qiáng)的遷移能力。而在加入pH響應(yīng)型DNA納米彈簧的實(shí)驗(yàn)組中，隨著納米彈簧濃度的增加，下室的細(xì)胞數(shù)量顯著減少。當(dāng)納米彈簧濃度為5μg/mL時(shí)，MCF-7細(xì)胞遷移到下室的數(shù)量相較于對照組減少了約40%，HCT116細(xì)胞減少了約45%。當(dāng)納米彈簧濃度增加到10μg/mL時(shí)，MCF-7細(xì)胞和HCT116細(xì)胞遷移到下室的數(shù)量分別減少了約60%和70%。這進(jìn)一步證實(shí)了pH響應(yīng)型DNA納米彈簧能夠顯著抑制細(xì)胞的遷移能力。通過對遷移細(xì)胞的形態(tài)和分布進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)納米彈簧處理后的細(xì)胞遷移方向更加隨機(jī)，失去了原本的方向性。這表明pH響應(yīng)型DNA納米彈簧不僅能夠抑制細(xì)胞的遷移能力，還能夠干擾細(xì)胞遷移的方向性，從而有效抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。五、實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證與數(shù)據(jù)分析5.1細(xì)胞實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)5.1.1細(xì)胞選擇與培養(yǎng)為了全面深入地探究pH響應(yīng)型DNA納米彈簧對細(xì)胞行為的調(diào)控作用，本研究精心選擇了人乳腺癌細(xì)胞MCF-7和人結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞模型。這兩種細(xì)胞在癌癥研究領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用和重要的研究價(jià)值。MCF-7細(xì)胞是一種經(jīng)典的乳腺癌細(xì)胞系，具有上皮樣形態(tài)，貼壁生長。它保留了許多正常乳腺上皮細(xì)胞的特征，同時(shí)又具有癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力，對多種抗癌藥物和生物活性物質(zhì)具有不同程度的敏感性，是研究乳腺癌發(fā)病機(jī)制、藥物篩選和細(xì)胞行為調(diào)控的常用細(xì)胞模型。HCT116細(xì)胞則是人結(jié)直腸癌細(xì)胞系，呈上皮樣、多角形，貼壁生長。該細(xì)胞系具有較高的增殖活性和侵襲能力，在裸鼠體內(nèi)有致瘤性，能夠形成上皮樣腫瘤，常用于結(jié)直腸癌的相關(guān)研究。選擇這兩種細(xì)胞系，能夠從不同癌癥類型的角度，全面評估pH響應(yīng)型DNA納米彈簧對腫瘤細(xì)胞行為的影響，為其在癌癥治療領(lǐng)域的應(yīng)用提供更豐富的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論支持。在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，嚴(yán)格遵循細(xì)胞培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，以確保細(xì)胞的正常生長和活性。MCF-7細(xì)胞采用RPMI1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，該培養(yǎng)基富含多種氨基酸、維生素、糖類等營養(yǎng)成分，能夠滿足MCF-7細(xì)胞生長和代謝的需求。培養(yǎng)基中添加10%的胎牛血清，胎牛血清含有豐富的生長因子、激素、營養(yǎng)物質(zhì)和其他生物活性成分，能夠促進(jìn)細(xì)胞的貼壁、增殖和存活。同時(shí)，添加1%的青霉素-鏈霉素雙抗溶液，青霉素能夠抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成，鏈霉素則作用于細(xì)菌核糖體，抑制蛋白質(zhì)的合成，兩者聯(lián)合使用能夠有效防止細(xì)菌污染，保證細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境的無菌性。將細(xì)胞置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，37℃是人體細(xì)胞的最適生長溫度，5%CO?能夠維持培養(yǎng)基的pH值穩(wěn)定在7.2-7.4之間，為細(xì)胞提供適宜的生長環(huán)境。HCT116細(xì)胞使用IMDM（Iscove'sModifiedDulbecco'sMedium）培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，IMDM培養(yǎng)基在DMEM培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上進(jìn)行了改良，添加了更多的氨基酸、維生素和其他營養(yǎng)成分，更適合HCT116細(xì)胞的生長。同樣添加10%的胎牛血清和1%的青霉素-鏈霉素雙抗溶液，培養(yǎng)條件與MCF-7細(xì)胞相同，即37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，定期觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%融合時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代時(shí)，先用PBS（磷酸鹽緩沖液）沖洗細(xì)胞兩次，去除培養(yǎng)基中的血清和雜質(zhì)，然后加入適量的0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化液，在37℃下消化1-2分鐘，待細(xì)胞變圓并開始脫落時(shí)，加入含有血清的培養(yǎng)基終止消化，輕輕吹打細(xì)胞，使其形成單細(xì)胞懸液，然后按照1:3-1:5的比例接種到新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。通過嚴(yán)格控制細(xì)胞培養(yǎng)條件和傳代操作，確保細(xì)胞始終處于良好的生長狀態(tài)，為后續(xù)的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)提供高質(zhì)量的細(xì)胞樣本。5.1.2分組與處理本研究設(shè)置了對照組和實(shí)驗(yàn)組，旨在通過對比分析，精準(zhǔn)探究pH響應(yīng)型DNA納米彈簧對細(xì)胞行為的影響。對照組為未添加DNA納米彈簧的細(xì)胞組，其培養(yǎng)條件與實(shí)驗(yàn)組完全一致，僅使用常規(guī)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。對照組在實(shí)驗(yàn)中起著至關(guān)重要的參照作用，能夠直觀反映細(xì)胞在正常生理狀態(tài)下的行為特征，為評估實(shí)驗(yàn)組中納米彈簧對細(xì)胞行為的影響提供基準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)組則根據(jù)DNA納米彈簧的濃度和處理時(shí)間的不同，進(jìn)一步細(xì)分為多個(gè)小組。在濃度梯度設(shè)置方面，選取了0μg/mL（即對照組）、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL這五個(gè)濃度梯度。選擇這些濃度梯度是基于前期的預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果以及相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，確保既能涵蓋納米彈簧可能產(chǎn)生顯著作用的濃度范圍，又能避免過高濃度對細(xì)胞產(chǎn)生非特異性毒性影響。在處理時(shí)間上，分別設(shè)置了24h、48h和72h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)。不同的處理時(shí)間能夠模擬納米彈簧與細(xì)胞在不同作用時(shí)長下的相互作用過程，有助于全面了解納米彈簧對細(xì)胞行為的動(dòng)態(tài)影響。在具體的實(shí)驗(yàn)操作中，將處于對數(shù)生長期、生長狀態(tài)良好且密度均勻的細(xì)胞接種于96孔板或6孔板中。對于96孔板，每孔接種密度一般為5×103-1×10?個(gè)細(xì)胞；對于6孔板，每孔接種密度約為2×10?-5×10?個(gè)細(xì)胞。接種后，將細(xì)胞置于培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)12-24h，待細(xì)胞充分貼壁后，進(jìn)行后續(xù)處理。向?qū)嶒?yàn)組的各孔中分別加入不同濃度的pH響應(yīng)型DNA納米彈簧溶液，溶液體積根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求和孔板規(guī)格進(jìn)行調(diào)整，一般在96孔板中每孔加入100-200μL，在6孔板中每孔加入1-2mL。對照組則加入等量的不含納米彈簧的培養(yǎng)基。將處理后的細(xì)胞繼續(xù)置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在設(shè)定的時(shí)間點(diǎn)（24h、48h和72h）進(jìn)行相應(yīng)的檢測和分析。通過這種細(xì)致的分組與處理方式，能夠系統(tǒng)地研究pH響應(yīng)型DNA納米彈簧在不同濃度和處理時(shí)間下對細(xì)胞行為的調(diào)控作用，為深入揭示其作用機(jī)制提供豐富的數(shù)據(jù)支持。5.2檢測指標(biāo)與方法5.2.1細(xì)胞活力檢測細(xì)胞活力是評估細(xì)胞健康狀態(tài)和生理功能的關(guān)鍵指標(biāo)，對于研究pH響應(yīng)型DNA納米彈簧對細(xì)胞的影響具有重要意義。本研究采用MTT法和CCK-8法兩種常用的細(xì)胞活力檢測方法，對實(shí)驗(yàn)組和對照組細(xì)胞的活力進(jìn)行了系統(tǒng)檢測。MTT法的原理基于活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能夠?qū)⑼庠葱訫TT（3-(4,5)-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽）還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan），并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細(xì)胞中的甲瓚，通過酶標(biāo)儀在490nm波長處測定其光吸收值，在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。在實(shí)驗(yàn)操作中，首先將對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于96孔板中，每孔接種密度為5×103個(gè)細(xì)胞，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞貼壁后，按照分組分別加入不同濃度的pH響應(yīng)型DNA納米彈簧溶液，對照組加入等量的培養(yǎng)基。在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h、48h和72h后，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4h。終止培養(yǎng)后，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150μL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。最后，使用酶標(biāo)儀在490nm波長處測量各孔的吸光值。CCK-8法的原理是利用細(xì)胞內(nèi)的代謝酶將無色的CCK-8（2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽）還原為有色產(chǎn)物，其生成的量與活細(xì)胞數(shù)量成正比，通過檢測在450nm處的吸光度，可以間接計(jì)算活細(xì)胞的量。在實(shí)驗(yàn)中，同樣將細(xì)胞接種于96孔板中，待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行分組處理。在培養(yǎng)結(jié)束前1-4h，每孔加入10μLCCK-8試劑，繼續(xù)孵育至設(shè)定時(shí)間。然后，使用酶標(biāo)儀檢測450nm波長的吸光度（OD值）。為了確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，在同體積的培養(yǎng)基中加入CCK-8，培養(yǎng)同樣的時(shí)間，作為空白對照，和實(shí)驗(yàn)組一起測定450nm的吸光度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值作為最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果。通過MTT法和CCK-