HNF4α與FoxM1：解析胃癌發(fā)生進(jìn)程中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)密碼

HNF4α與FoxM1：解析胃癌發(fā)生進(jìn)程中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)密碼一、引言1.1研究背景與意義胃癌是全球范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅人類健康的重大疾病，在各類癌癥中，其發(fā)病率位居第四，病死率高居第二位，尤其在包括我國(guó)在內(nèi)的發(fā)展中國(guó)家，形勢(shì)更為嚴(yán)峻。胃癌不僅會(huì)導(dǎo)致患者出現(xiàn)上腹疼痛、上腹不適、食欲下降、惡心、嘔吐、吞咽困難等癥狀，嚴(yán)重影響患者的進(jìn)食和睡眠，干擾正常生活，還會(huì)給患者帶來(lái)嚴(yán)重的負(fù)面情緒。隨著病情進(jìn)展，賁門(mén)處的腫瘤會(huì)導(dǎo)致吞咽困難、身體消瘦；幽門(mén)處的腫瘤則可能引發(fā)頻繁嘔吐、梗阻，甚至導(dǎo)致消化道出血、穿孔、胸腔積液。到了晚期，癌細(xì)胞擴(kuò)散轉(zhuǎn)移至其他重要臟器，極大地影響患者壽命，如I期胃癌的5年生存率為90%-98%，II期胃癌5年生存率為68.5%，III期胃癌5年生存率為30.8%-50.1%，IV期胃癌5年生存率僅為16.6%。盡管當(dāng)前治療手段如化療、放療和手術(shù)等有了一定進(jìn)步，但胃癌的總體治療效果仍不理想，因此，深入研究胃癌的發(fā)生機(jī)制，尋找有效的治療靶點(diǎn)和策略迫在眉睫。轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)分子在細(xì)胞的生命活動(dòng)中扮演著核心角色，它們能夠通過(guò)與特定的DNA序列結(jié)合，調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程，進(jìn)而影響細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等重要生物學(xué)功能。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)分子的異常表達(dá)或功能失調(diào)常常起著關(guān)鍵作用。肝細(xì)胞核因子HNF4α作為一種重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)分子，在細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和代謝等過(guò)程中發(fā)揮著不可或缺的作用。研究發(fā)現(xiàn)，HNF4α表達(dá)上調(diào)是胃腫瘤的一個(gè)重要信號(hào)事件，其可被AMPK信號(hào)和WNT信號(hào)上游等通路調(diào)節(jié)，還可通過(guò)其靶基因WNT5A來(lái)調(diào)節(jié)WNT信號(hào)通路，拮抗HNF4α具有抗腫瘤作用，有望成為早期胃癌新的治療靶點(diǎn)。FoxM1基因是Fox蛋白家族的一個(gè)亞型，參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、浸潤(rùn)與侵襲等，在胃癌中存在過(guò)高表達(dá)，對(duì)胃癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后起重要作用，有望成為胃癌治療的新靶點(diǎn)。深入研究HNF4α和FoxM1等轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)分子在胃癌發(fā)生中的功能與機(jī)制，有助于揭示胃癌發(fā)生發(fā)展的分子生物學(xué)基礎(chǔ)，為胃癌的早期診斷、精準(zhǔn)治療以及預(yù)后評(píng)估提供新的理論依據(jù)和潛在靶點(diǎn)，對(duì)于改善胃癌患者的生存質(zhì)量和提高生存率具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在國(guó)外，對(duì)于HNF4α在胃癌中的研究已取得一定成果。韓國(guó)國(guó)立癌癥中心和美國(guó)德克薩斯大學(xué)MD安德森癌癥中心的研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)綜合分析亞太地區(qū)和高加索人的胃腫瘤基因表達(dá)數(shù)據(jù)集，以及新獲得的胃腫瘤組織及與之匹配的非癌樣本中的基因表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)HNF4α表達(dá)上調(diào)是胃腫瘤的一個(gè)重要信號(hào)事件。進(jìn)一步通過(guò)RNA干擾和/或藥物抑制實(shí)驗(yàn)對(duì)常見(jiàn)過(guò)度表達(dá)的癌基因及其組成的信號(hào)通路進(jìn)行抑制性研究，證實(shí)了拮抗HNF4α具有抗腫瘤作用。胃癌腫瘤細(xì)胞系的擾動(dòng)實(shí)驗(yàn)和異種移植物模型研究表明，AMPKα信號(hào)和AMPK受體激動(dòng)劑二甲雙胍可下調(diào)HNF4α的表達(dá)，阻斷HNF4α活性可導(dǎo)致細(xì)胞周期蛋白下調(diào)、細(xì)胞周期停滯和腫瘤生長(zhǎng)抑制，且HNF4α還可通過(guò)其靶基因WNT5A來(lái)調(diào)節(jié)WNT信號(hào)通路，這為胃癌的藥物研發(fā)提供了潛在的新靶向通路。在國(guó)內(nèi)，相關(guān)研究也在不斷深入。有研究聚焦于HNF4α在幽門(mén)螺桿菌誘導(dǎo)胃癌發(fā)生中的功能和機(jī)制。通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，深入探討幽門(mén)螺桿菌感染如何影響HNF4α的表達(dá)，以及HNF4α表達(dá)變化后對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移等生物學(xué)行為的影響，進(jìn)一步揭示了HNF4α在胃癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用機(jī)制。對(duì)于FoxM1，國(guó)外有研究從細(xì)胞周期調(diào)控角度，深入剖析了FoxM1在胃癌細(xì)胞中的作用機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxM1在細(xì)胞周期的不同階段發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用，通過(guò)與多種細(xì)胞周期相關(guān)蛋白相互作用，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖。還有研究利用基因編輯技術(shù)，敲除或過(guò)表達(dá)胃癌細(xì)胞中的FoxM1基因，觀察細(xì)胞的增殖、凋亡、浸潤(rùn)與侵襲等生物學(xué)行為的變化，明確了FoxM1在胃癌發(fā)生發(fā)展中的重要作用。國(guó)內(nèi)研究則更多地關(guān)注FoxM1與胃癌臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。通過(guò)對(duì)大量胃癌患者的組織樣本進(jìn)行檢測(cè)，分析FoxM1的表達(dá)水平與胃癌的分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)FoxM1高表達(dá)與胃癌的不良預(yù)后密切相關(guān)。此外，也有研究探討了FoxM1在胃癌轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制，通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)FoxM1可以通過(guò)調(diào)節(jié)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲，進(jìn)而增加胃癌的轉(zhuǎn)移潛能。盡管國(guó)內(nèi)外在HNF4α和FoxM1與胃癌的研究中取得了一定進(jìn)展，但仍存在不足和空白。目前對(duì)于HNF4α和FoxM1在胃癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的相互作用機(jī)制研究較少，兩者是否存在協(xié)同或拮抗作用尚不明確。在臨床應(yīng)用方面，雖然已明確它們與胃癌的相關(guān)性，但如何將這些研究成果轉(zhuǎn)化為有效的臨床診斷和治療手段，仍有待進(jìn)一步探索。例如，如何開(kāi)發(fā)針對(duì)HNF4α和FoxM1的特異性靶向藥物，以及如何將其應(yīng)用于胃癌的早期診斷和精準(zhǔn)治療，都是未來(lái)研究需要重點(diǎn)關(guān)注的方向。1.3研究目的與內(nèi)容本研究旨在深入揭示轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)分子HNF4α和FoxM1在胃癌發(fā)生中的功能與機(jī)制，為胃癌的防治提供新的理論依據(jù)和潛在靶點(diǎn)。具體研究?jī)?nèi)容如下：HNF4α在胃癌發(fā)生中的功能與機(jī)制研究：通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，利用基因編輯技術(shù)敲低或過(guò)表達(dá)胃癌細(xì)胞系中的HNF4α基因，觀察細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、侵襲等生物學(xué)行為的變化，明確HNF4α對(duì)胃癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。構(gòu)建胃癌動(dòng)物模型，如裸鼠皮下移植瘤模型，通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證HNF4α對(duì)腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的作用。采用高通量測(cè)序技術(shù)，分析HNF4α基因敲低或過(guò)表達(dá)后胃癌細(xì)胞的基因表達(dá)譜變化，篩選出受HNF4α調(diào)控的下游靶基因。運(yùn)用生物信息學(xué)分析、染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）、熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)等方法，驗(yàn)證HNF4α與靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合位點(diǎn)，明確其調(diào)控機(jī)制。探討HNF4α與已知的胃癌相關(guān)信號(hào)通路（如WNT、AMPK等信號(hào)通路）的相互作用關(guān)系，研究HNF4α是否通過(guò)調(diào)節(jié)這些信號(hào)通路來(lái)影響胃癌的發(fā)生發(fā)展。FoxM1在胃癌發(fā)生中的功能與機(jī)制研究：在不同的胃癌細(xì)胞系中，利用RNA干擾技術(shù)或小分子抑制劑抑制FoxM1的表達(dá)或活性，通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)、EdU實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)等方法檢測(cè)細(xì)胞增殖和凋亡情況，利用Transwell實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲能力的變化，深入研究FoxM1對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學(xué)行為的影響。建立胃癌原位移植瘤模型或轉(zhuǎn)移瘤模型，通過(guò)體內(nèi)成像技術(shù)、組織病理學(xué)分析等手段，觀察抑制FoxM1表達(dá)或活性后對(duì)腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和預(yù)后的影響。利用基因芯片、RNA-seq等技術(shù)，分析FoxM1調(diào)控的基因網(wǎng)絡(luò)，篩選出與胃癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲密切相關(guān)的下游靶基因。通過(guò)ChIP-seq、EMSA等實(shí)驗(yàn)確定FoxM1與靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的直接結(jié)合位點(diǎn)，采用基因過(guò)表達(dá)、RNA干擾等方法驗(yàn)證靶基因在FoxM1調(diào)控胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為中的作用。研究FoxM1與其他轉(zhuǎn)錄因子、信號(hào)通路分子之間的相互作用，揭示FoxM1在胃癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。HNF4α和FoxM1在胃癌發(fā)生中的相互作用研究：通過(guò)免疫共沉淀（Co-IP）、熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）等實(shí)驗(yàn)技術(shù)，檢測(cè)HNF4α和FoxM1在胃癌細(xì)胞內(nèi)是否存在直接相互作用。利用蛋白質(zhì)譜分析技術(shù)，鑒定與HNF4α和FoxM1相互作用的其他蛋白質(zhì)，構(gòu)建相互作用網(wǎng)絡(luò)，分析它們?cè)谖赴┌l(fā)生發(fā)展過(guò)程中的協(xié)同或拮抗作用機(jī)制。在胃癌細(xì)胞系中同時(shí)干擾或過(guò)表達(dá)HNF4α和FoxM1，觀察細(xì)胞生物學(xué)行為的變化，與單獨(dú)干擾或過(guò)表達(dá)HNF4α、FoxM1的細(xì)胞進(jìn)行對(duì)比，研究?jī)烧吖餐饔脤?duì)胃癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學(xué)行為的影響。分析HNF4α和FoxM1的表達(dá)水平在胃癌組織中的相關(guān)性，結(jié)合臨床病理資料，探討兩者聯(lián)合檢測(cè)對(duì)胃癌診斷、預(yù)后評(píng)估的價(jià)值。1.4研究方法與技術(shù)路線細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：選用多種胃癌細(xì)胞系，如MGC-803、SGC-7901、BGC-823等，同時(shí)設(shè)立正常胃黏膜上皮細(xì)胞系作為對(duì)照。運(yùn)用基因編輯技術(shù)，如CRISPR/Cas9系統(tǒng)，對(duì)胃癌細(xì)胞系中的HNF4α和FoxM1基因進(jìn)行敲低或過(guò)表達(dá)操作。通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，在不同時(shí)間點(diǎn)（如24h、48h、72h）向培養(yǎng)孔中加入CCK-8試劑，孵育后用酶標(biāo)儀測(cè)定450nm處的吸光度值，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線；采用EdU實(shí)驗(yàn)直觀地觀察細(xì)胞的增殖情況，將EdU試劑加入細(xì)胞培養(yǎng)液中孵育，固定細(xì)胞后進(jìn)行熒光染色，在熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)EdU陽(yáng)性細(xì)胞的比例；利用流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期分布和凋亡情況，將細(xì)胞用相應(yīng)的熒光染料標(biāo)記，如PI染料標(biāo)記DNA用于分析細(xì)胞周期，AnnexinV-FITC/PI雙染用于檢測(cè)細(xì)胞凋亡，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同熒光強(qiáng)度的細(xì)胞數(shù)量，分析細(xì)胞周期各時(shí)相的比例以及凋亡細(xì)胞的百分比；運(yùn)用Transwell實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲能力，在Transwell小室的上室加入細(xì)胞懸液，下室加入含趨化因子的培養(yǎng)液，培養(yǎng)一定時(shí)間后固定、染色，在顯微鏡下計(jì)數(shù)穿過(guò)小室膜的細(xì)胞數(shù)量；劃痕實(shí)驗(yàn)則是在細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)皿后，用移液器槍頭劃痕，培養(yǎng)一定時(shí)間后觀察劃痕愈合情況，計(jì)算細(xì)胞遷移率。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：構(gòu)建胃癌動(dòng)物模型，包括裸鼠皮下移植瘤模型、胃癌原位移植瘤模型和轉(zhuǎn)移瘤模型。對(duì)于裸鼠皮下移植瘤模型，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的胃癌細(xì)胞接種到裸鼠的皮下，定期測(cè)量腫瘤體積，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線，待腫瘤生長(zhǎng)到一定大小后處死裸鼠，取出腫瘤進(jìn)行組織病理學(xué)分析；胃癌原位移植瘤模型是將胃癌細(xì)胞接種到裸鼠的胃壁上，觀察腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移情況；轉(zhuǎn)移瘤模型可通過(guò)尾靜脈注射胃癌細(xì)胞建立肺轉(zhuǎn)移模型，通過(guò)活體成像技術(shù)觀察腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)的轉(zhuǎn)移情況，如在注射帶有熒光標(biāo)記的胃癌細(xì)胞后，定期對(duì)裸鼠進(jìn)行活體成像，觀察熒光信號(hào)在肺部等器官的分布和強(qiáng)度變化。通過(guò)免疫組化、免疫熒光等方法檢測(cè)腫瘤組織中相關(guān)蛋白的表達(dá)水平和定位，如用免疫組化檢測(cè)HNF4α、FoxM1以及相關(guān)靶蛋白在腫瘤組織中的表達(dá)，用免疫熒光檢測(cè)它們?cè)诩?xì)胞內(nèi)的定位情況。分子生物學(xué)技術(shù)：采用高通量測(cè)序技術(shù)，如RNA-seq，分析HNF4α和FoxM1基因敲低或過(guò)表達(dá)后胃癌細(xì)胞的基因表達(dá)譜變化。提取細(xì)胞總RNA，進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建和測(cè)序，通過(guò)生物信息學(xué)分析篩選出差異表達(dá)基因，構(gòu)建基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，分析受HNF4α和FoxM1調(diào)控的基因模塊。運(yùn)用染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）、熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)等方法驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄因子與靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合位點(diǎn)。ChIP實(shí)驗(yàn)先將細(xì)胞進(jìn)行甲醛交聯(lián)，裂解細(xì)胞后超聲破碎染色質(zhì)，用特異性抗體免疫沉淀與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的DNA片段，再通過(guò)PCR或測(cè)序分析沉淀的DNA片段，確定轉(zhuǎn)錄因子與靶基因啟動(dòng)子的結(jié)合區(qū)域；熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)則是將靶基因啟動(dòng)子區(qū)域克隆到熒光素酶報(bào)告載體中，與轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，檢測(cè)熒光素酶活性，判斷轉(zhuǎn)錄因子對(duì)靶基因啟動(dòng)子的調(diào)控作用。利用蛋白質(zhì)譜分析技術(shù)鑒定與HNF4α和FoxM1相互作用的其他蛋白質(zhì)，通過(guò)免疫共沉淀（Co-IP）富集與HNF4α或FoxM1結(jié)合的蛋白質(zhì)復(fù)合物，進(jìn)行蛋白質(zhì)譜分析，篩選出相互作用的蛋白質(zhì)，再通過(guò)Co-IP、GSTpull-down等實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證蛋白質(zhì)之間的相互作用。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）和蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)檢測(cè)相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)水平。qPCR提取細(xì)胞或組織的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后進(jìn)行qPCR擴(kuò)增，以內(nèi)參基因作為對(duì)照，計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量；Westernblot提取細(xì)胞或組織總蛋白，進(jìn)行SDS電泳分離蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)膜后用特異性抗體檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)水平。臨床樣本分析：收集胃癌患者的手術(shù)切除標(biāo)本，包括癌組織和癌旁組織，同時(shí)收集患者的臨床病理資料，如年齡、性別、腫瘤大小、分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況等。采用免疫組化、qPCR等方法檢測(cè)HNF4α和FoxM1在臨床樣本中的表達(dá)水平，分析其與臨床病理特征及預(yù)后的相關(guān)性，如通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析判斷HNF4α和FoxM1表達(dá)水平與腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間是否存在顯著相關(guān)性，通過(guò)生存分析評(píng)估它們對(duì)患者預(yù)后的影響。本研究的技術(shù)路線如圖1-1所示，首先從細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)兩個(gè)層面，分別對(duì)HNF4α和FoxM1在胃癌發(fā)生中的功能進(jìn)行研究，利用分子生物學(xué)技術(shù)深入探究其作用機(jī)制。同時(shí)，分析臨床樣本中HNF4α和FoxM1的表達(dá)情況，探討其與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。最后，綜合各方面研究結(jié)果，深入揭示轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)分子HNF4α和FoxM1參與胃癌發(fā)生的功能與機(jī)制。[此處插入技術(shù)路線圖]圖1-1技術(shù)路線圖二、HNF4α與FoxM1的生物學(xué)特性2.1HNF4α的結(jié)構(gòu)、功能與調(diào)控2.1.1HNF4α的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)HNF4α基因位于人染色體20q12-q13.1，其編碼的蛋白質(zhì)屬于核受體超家族成員。HNF4α蛋白包含多個(gè)功能域，從N端到C端依次為：高度可變的N端結(jié)構(gòu)域、DNA結(jié)合域（DBD）、鉸鏈區(qū)和配體結(jié)合域（LBD）。N端結(jié)構(gòu)域具有高度的物種和組織特異性，其長(zhǎng)度和氨基酸序列在不同物種及組織中存在差異，該區(qū)域包含多個(gè)磷酸化位點(diǎn)，可通過(guò)磷酸化修飾參與轉(zhuǎn)錄激活功能的調(diào)節(jié)。例如，蛋白激酶A（PKA）可對(duì)其特定絲氨酸殘基進(jìn)行磷酸化，改變HNF4α與其他轉(zhuǎn)錄共激活因子的相互作用，進(jìn)而影響其轉(zhuǎn)錄活性。DNA結(jié)合域由兩個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)組成，每個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)含有約60個(gè)氨基酸殘基，通過(guò)與特定的DNA序列（順式作用元件）結(jié)合，調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄。這兩個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)中的關(guān)鍵氨基酸殘基與DNA大溝中的堿基形成特異性氫鍵和范德華力，確保HNF4α與靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的準(zhǔn)確識(shí)別和緊密結(jié)合。其識(shí)別的核心DNA序列通常為5'-AGGTCA-3'，以直接重復(fù)序列（DR1）或反向重復(fù)序列（IR1）的形式存在于靶基因啟動(dòng)子中。鉸鏈區(qū)是連接DNA結(jié)合域和配體結(jié)合域的柔性區(qū)域，具有一定的可塑性，能夠在不同程度上彎曲和旋轉(zhuǎn)，使HNF4α在與DNA結(jié)合時(shí)可以采取合適的空間構(gòu)象，同時(shí)也為蛋白質(zhì)與其他調(diào)控因子的相互作用提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。配體結(jié)合域具有保守的三級(jí)結(jié)構(gòu)，由12個(gè)α-螺旋和4個(gè)β-折疊組成，形成一個(gè)疏水口袋，可結(jié)合內(nèi)源性配體（如脂肪酸、前列腺素等）或外源性配體（如小分子化合物）。配體結(jié)合后，會(huì)引起配體結(jié)合域的構(gòu)象變化，影響HNF4α與共激活因子或共抑制因子的結(jié)合，從而調(diào)控其轉(zhuǎn)錄活性。當(dāng)脂肪酸與HNF4α的配體結(jié)合域結(jié)合時(shí)，會(huì)誘導(dǎo)HNF4α形成同源二聚體，增強(qiáng)其與靶基因啟動(dòng)子的結(jié)合能力，促進(jìn)下游基因的轉(zhuǎn)錄。HNF4α通過(guò)這些功能域的協(xié)同作用，實(shí)現(xiàn)對(duì)基因轉(zhuǎn)錄的精確調(diào)控，在維持細(xì)胞正常生理功能和疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。不同功能域之間相互影響，共同決定了HNF4α的生物學(xué)活性，任何一個(gè)功能域的結(jié)構(gòu)改變或功能異常都可能導(dǎo)致HNF4α調(diào)控功能的紊亂，進(jìn)而影響相關(guān)生理過(guò)程或引發(fā)疾病。2.1.2HNF4α的正常生理功能在肝臟代謝方面，HNF4α是肝臟代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，對(duì)維持肝臟的正常代謝功能至關(guān)重要。它參與調(diào)控肝臟中多種代謝途徑，包括糖代謝、脂質(zhì)代謝和膽汁酸代謝等。在糖代謝中，HNF4α通過(guò)直接調(diào)控葡萄糖-6-磷酸酶（G6PC）和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK）等糖異生關(guān)鍵酶基因的表達(dá)，維持血糖水平的穩(wěn)定。當(dāng)血糖濃度降低時(shí)，體內(nèi)激素信號(hào)（如胰高血糖素）會(huì)激活相關(guān)信號(hào)通路，促使HNF4α與G6PC和PEPCK基因啟動(dòng)子區(qū)域的特定序列結(jié)合，增強(qiáng)這些基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)糖異生過(guò)程，使肝臟釋放葡萄糖進(jìn)入血液，從而升高血糖水平。在脂質(zhì)代謝中，HNF4α調(diào)控脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（FATP）、脂肪酸結(jié)合蛋白（FABP）以及脂肪酸合成酶（FAS）等基因的表達(dá)，影響脂肪酸的攝取、轉(zhuǎn)運(yùn)和合成。研究表明，敲低小鼠肝臟中的HNF4α基因，會(huì)導(dǎo)致FATP和FABP表達(dá)下降，脂肪酸攝取減少，同時(shí)FAS表達(dá)降低，脂肪酸合成受阻，最終引起肝臟脂質(zhì)含量下降。在膽汁酸代謝中，HNF4α調(diào)節(jié)膽汁酸合成關(guān)鍵酶膽固醇7α-羥化酶（CYP7A1）的表達(dá)，維持膽汁酸的合成和代謝平衡。當(dāng)膽汁酸水平升高時(shí)，膽汁酸作為配體與HNF4α結(jié)合，抑制其與CYP7A1基因啟動(dòng)子的結(jié)合，減少CYP7A1的表達(dá)，從而降低膽汁酸的合成，形成負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制。在腸道發(fā)育方面，HNF4α在腸道上皮細(xì)胞的分化和成熟過(guò)程中發(fā)揮重要作用。在胚胎發(fā)育階段，HNF4α的表達(dá)逐漸上調(diào)，促進(jìn)腸道上皮干細(xì)胞向不同類型的成熟細(xì)胞分化，包括腸吸收細(xì)胞、杯狀細(xì)胞、潘氏細(xì)胞等。研究發(fā)現(xiàn)，在HNF4α基因敲除的小鼠胚胎中，腸道上皮細(xì)胞的分化出現(xiàn)異常，腸吸收細(xì)胞數(shù)量減少，杯狀細(xì)胞和潘氏細(xì)胞的分化受阻，導(dǎo)致腸道結(jié)構(gòu)和功能發(fā)育不完善。此外，HNF4α還參與維持腸道上皮細(xì)胞的屏障功能，通過(guò)調(diào)控緊密連接蛋白（如ZO-1、Occludin等）的表達(dá)，保證腸道上皮細(xì)胞之間的緊密連接，防止腸道內(nèi)有害物質(zhì)的侵入。當(dāng)HNF4α表達(dá)缺失時(shí)，緊密連接蛋白表達(dá)下調(diào)，腸道上皮屏障功能受損，腸道通透性增加，容易引發(fā)腸道炎癥和感染等疾病。在腎臟功能方面，HNF4α對(duì)腎臟的發(fā)育和功能維持也具有重要意義。在腎臟發(fā)育過(guò)程中，HNF4α參與腎小球和腎小管的形成。它調(diào)控腎小球系膜細(xì)胞和足細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)，影響腎小球的正常結(jié)構(gòu)和濾過(guò)功能。在腎小管上皮細(xì)胞中，HNF4α調(diào)節(jié)水、電解質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因的表達(dá)，維持腎臟的正常排泄和重吸收功能。研究表明，HNF4α基因突變可導(dǎo)致腎臟發(fā)育異常和腎功能障礙，如出現(xiàn)蛋白尿、腎小管酸中毒等癥狀。2.1.3HNF4α的調(diào)控機(jī)制在轉(zhuǎn)錄水平，HNF4α基因的啟動(dòng)子區(qū)域含有多個(gè)順式作用元件，可與多種轉(zhuǎn)錄因子相互作用，從而調(diào)控HNF4α的轉(zhuǎn)錄。上游刺激因子（USF）、肝細(xì)胞核因子1α（HNF1α）等轉(zhuǎn)錄因子可與HNF4α啟動(dòng)子區(qū)域的相應(yīng)元件結(jié)合，促進(jìn)HNF4α基因的轉(zhuǎn)錄。USF能夠識(shí)別并結(jié)合到HNF4α啟動(dòng)子的E-box元件（5'-CANNTG-3'）上，招募RNA聚合酶Ⅱ等轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子，啟動(dòng)HNF4α基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程。而一些抑制性轉(zhuǎn)錄因子，如核因子κB（NF-κB），在炎癥等病理?xiàng)l件下被激活，可與HNF4α啟動(dòng)子區(qū)域的特定序列結(jié)合，抑制HNF4α的轉(zhuǎn)錄。在炎癥狀態(tài)下，細(xì)胞內(nèi)的炎癥信號(hào)通路被激活，NF-κB從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，與HNF4α啟動(dòng)子上的κB位點(diǎn)結(jié)合，阻礙RNA聚合酶Ⅱ與啟動(dòng)子的結(jié)合，從而抑制HNF4α的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，進(jìn)而影響肝臟的代謝功能和細(xì)胞的正常生理活動(dòng)。在翻譯后修飾層面，HNF4α可發(fā)生多種修飾，包括磷酸化、乙?；?、泛素化等，這些修飾對(duì)其活性、穩(wěn)定性和亞細(xì)胞定位產(chǎn)生重要影響。磷酸化修飾主要由多種蛋白激酶介導(dǎo)，如PKA、蛋白激酶C（PKC）等。PKA可使HNF4α的N端結(jié)構(gòu)域中的絲氨酸殘基磷酸化，增強(qiáng)其與共激活因子的相互作用，提高轉(zhuǎn)錄激活活性。乙?；揎椨梢阴＾D(zhuǎn)移酶催化，可發(fā)生在HNF4α的多個(gè)賴氨酸殘基上，改變其蛋白質(zhì)構(gòu)象和與DNA的結(jié)合能力。研究表明，乙?；揎椏稍鰪?qiáng)HNF4α與靶基因啟動(dòng)子的結(jié)合親和力，促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄。泛素化修飾則與HNF4α的降解密切相關(guān)，通過(guò)泛素-蛋白酶體途徑，使HNF4α被識(shí)別并降解，從而調(diào)節(jié)其在細(xì)胞內(nèi)的蛋白水平。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境發(fā)生變化時(shí)，如受到氧化應(yīng)激等刺激，HNF4α的泛素化水平會(huì)發(fā)生改變，影響其穩(wěn)定性和功能。此外，非編碼RNA也參與對(duì)HNF4α的調(diào)控。微小RNA（miRNA）可通過(guò)與HNF4αmRNA的3'-非翻譯區(qū)（3'-UTR）互補(bǔ)配對(duì)，抑制其翻譯過(guò)程或促進(jìn)其降解。研究發(fā)現(xiàn)，miR-122可與HNF4αmRNA的3'-UTR特異性結(jié)合，抑制HNF4α的表達(dá)，進(jìn)而影響肝臟的脂質(zhì)代謝。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）也可通過(guò)多種機(jī)制調(diào)控HNF4α，如通過(guò)與HNF4α形成RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物，影響其與DNA的結(jié)合能力，或通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)信號(hào)通路間接影響HNF4α的表達(dá)和功能。2.2FoxM1的結(jié)構(gòu)、功能與調(diào)控2.2.1FoxM1的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)FoxM1基因定位于人類染色體12p13.33，其編碼的FoxM1蛋白屬于叉頭框（FOX）轉(zhuǎn)錄因子家族。FoxM1蛋白具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特征，包含多個(gè)重要的功能結(jié)構(gòu)域。N端區(qū)域含有一個(gè)自主抑制結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域在FoxM1未被激活時(shí)，通過(guò)分子內(nèi)相互作用抑制其轉(zhuǎn)錄活性，使得FoxM1處于相對(duì)靜止?fàn)顟B(tài)，避免其在不必要時(shí)對(duì)基因轉(zhuǎn)錄進(jìn)行調(diào)控，維持細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)的穩(wěn)定平衡。當(dāng)細(xì)胞接收到特定的激活信號(hào)時(shí)，自主抑制結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象發(fā)生改變，解除對(duì)轉(zhuǎn)錄活性的抑制，從而使FoxM1能夠發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能。中間部分是高度保守的DNA結(jié)合域（DBD），由約100個(gè)氨基酸組成，形成典型的“翼狀螺旋”結(jié)構(gòu)。這種結(jié)構(gòu)賦予FoxM1特異性識(shí)別并結(jié)合DNA特定序列的能力，其識(shí)別的核心DNA序列為5'-TAAACA-3'。FoxM1通過(guò)DNA結(jié)合域與靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的順式作用元件相結(jié)合，從而調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程，確保其對(duì)特定基因的精準(zhǔn)調(diào)控，這是FoxM1發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能的關(guān)鍵步驟。C端則是轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域，該區(qū)域包含多個(gè)富含絲氨酸、蘇氨酸和脯氨酸的基序，這些基序可被多種蛋白激酶磷酸化修飾。當(dāng)轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域被磷酸化后，F(xiàn)oxM1能夠招募轉(zhuǎn)錄共激活因子，如p300/CBP等，形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物，增強(qiáng)RNA聚合酶Ⅱ與靶基因啟動(dòng)子的結(jié)合能力，促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄的起始和延伸，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因轉(zhuǎn)錄水平的上調(diào)。2.2.2FoxM1的正常生理功能在細(xì)胞周期調(diào)控方面，F(xiàn)oxM1發(fā)揮著核心作用，對(duì)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期以及G2期向M期的轉(zhuǎn)換過(guò)程進(jìn)行精確調(diào)控。在G1期，F(xiàn)oxM1的表達(dá)水平逐漸升高，通過(guò)激活細(xì)胞周期蛋白E（CyclinE）、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2（CDK2）等基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，啟動(dòng)DNA復(fù)制過(guò)程。研究表明，在缺乏FoxM1的細(xì)胞中，CyclinE和CDK2的表達(dá)顯著下調(diào)，細(xì)胞周期停滯在G1期，無(wú)法正常進(jìn)入S期。在G2期，F(xiàn)oxM1進(jìn)一步激活細(xì)胞周期蛋白B1（CyclinB1）、細(xì)胞分裂周期蛋白2（Cdc2）等基因的表達(dá)，這些蛋白形成復(fù)合物，推動(dòng)細(xì)胞從G2期向M期過(guò)渡，確保細(xì)胞有絲分裂的順利進(jìn)行。若FoxM1功能缺失，細(xì)胞在G2期會(huì)出現(xiàn)DNA損傷修復(fù)異常、染色體穩(wěn)定性下降等問(wèn)題，導(dǎo)致細(xì)胞無(wú)法正常進(jìn)入M期，甚至引發(fā)細(xì)胞凋亡。在胚胎發(fā)育過(guò)程中，F(xiàn)oxM1參與多種組織和器官的形成與發(fā)育。在心臟發(fā)育方面，F(xiàn)oxM1在心臟祖細(xì)胞中高度表達(dá)，調(diào)控心臟發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)，如NKX2-5、GATA4等，這些基因?qū)τ谛呐K的形態(tài)發(fā)生和功能建立至關(guān)重要。敲除小鼠胚胎中的FoxM1基因，會(huì)導(dǎo)致心臟發(fā)育異常，出現(xiàn)心室壁變薄、心肌細(xì)胞增殖減少等現(xiàn)象，嚴(yán)重影響心臟的正常功能。在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中，F(xiàn)oxM1參與神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化過(guò)程。它通過(guò)調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞特異性基因的表達(dá)，維持神經(jīng)干細(xì)胞的自我更新能力和分化潛能，促進(jìn)神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的生成。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxM1表達(dá)異常會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育缺陷，如腦體積減小、神經(jīng)元數(shù)量減少等。2.2.3FoxM1的調(diào)控機(jī)制FoxM1的表達(dá)受到多種上游信號(hào)通路的嚴(yán)格調(diào)控。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路在細(xì)胞受到生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子等刺激時(shí)被激活，激活后的MAPK信號(hào)通路可通過(guò)磷酸化作用激活轉(zhuǎn)錄因子Elk-1等，Elk-1結(jié)合到FoxM1基因啟動(dòng)子區(qū)域，促進(jìn)FoxM1的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。當(dāng)表皮生長(zhǎng)因子（EGF）與細(xì)胞膜上的EGF受體結(jié)合后，激活下游的Ras-Raf-MEK-ERK信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，ERK磷酸化并進(jìn)入細(xì)胞核，激活Elk-1，進(jìn)而上調(diào)FoxM1的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞增殖。磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號(hào)通路也參與FoxM1的調(diào)控。在細(xì)胞受到胰島素、胰島素樣生長(zhǎng)因子等刺激時(shí)，PI3K被激活，使磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3），PIP3招募并激活A(yù)kt。激活的Akt可磷酸化FoxM1蛋白，增強(qiáng)其穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄活性，同時(shí)也可通過(guò)激活下游轉(zhuǎn)錄因子，如叉頭框蛋白O1（FoxO1）等，間接調(diào)控FoxM1的表達(dá)。轉(zhuǎn)錄因子對(duì)FoxM1的調(diào)控也十分關(guān)鍵。E2F轉(zhuǎn)錄因子家族成員E2F1在細(xì)胞周期進(jìn)程中與FoxM1存在密切的調(diào)控關(guān)系。在G1/S期轉(zhuǎn)換時(shí)，E2F1結(jié)合到FoxM1基因啟動(dòng)子區(qū)域，促進(jìn)FoxM1的轉(zhuǎn)錄，而FoxM1反過(guò)來(lái)又可以激活E2F1調(diào)控的一些基因，形成正反饋調(diào)控環(huán)路，共同促進(jìn)細(xì)胞周期的進(jìn)展。核因子κB（NF-κB）在炎癥等病理?xiàng)l件下被激活，可與FoxM1基因啟動(dòng)子區(qū)域的κB位點(diǎn)結(jié)合，上調(diào)FoxM1的表達(dá)。在炎癥細(xì)胞因子刺激下，NF-κB從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，與FoxM1啟動(dòng)子結(jié)合，促進(jìn)FoxM1轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而影響細(xì)胞的增殖、存活和炎癥反應(yīng)等過(guò)程。三、HNF4α在胃癌發(fā)生中的功能與機(jī)制3.1HNF4α與胃癌發(fā)生的相關(guān)性研究3.1.1HNF4α在胃癌組織中的表達(dá)情況諸多研究表明，HNF4α在胃癌組織中的表達(dá)水平呈現(xiàn)出顯著變化。通過(guò)對(duì)大量臨床樣本的檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，與正常胃黏膜組織相比，胃癌組織中HNF4α的表達(dá)水平存在明顯上調(diào)。南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院胃腸外科的研究人員通過(guò)腫瘤免疫分析2.0（TIMER2.0）和基因表達(dá)譜交互式分析（GEPIA2）數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)HNF4A在胃癌和正常組織中的表達(dá)差異進(jìn)行分析，結(jié)果顯示HNF4A在胃癌組織中表達(dá)升高，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。在另一項(xiàng)研究中，研究人員收集了97例胃癌患者的組織標(biāo)本，采用免疫組化染色法檢測(cè)P1-HNF4α和P2-HNF4α的表達(dá)。結(jié)果顯示，胃癌組P1-HNF4α的表達(dá)明顯高于慢性胃炎組，而腸化生組P1-HNF4α的表達(dá)顯著高于胃癌組（P<0.01）；P2-HNF4α在慢性胃炎組中的表達(dá)顯著低于腸化生組和胃癌組（P<0.01），腸化生組與胃癌組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。這進(jìn)一步表明HNF4α在胃癌組織中的表達(dá)水平與正常組織及腸化生組織存在明顯差異，其表達(dá)上調(diào)可能在胃癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。此外，韓國(guó)國(guó)立癌癥中心和美國(guó)德克薩斯大學(xué)MD安德森癌癥中心的研究團(tuán)隊(duì)綜合分析亞太地區(qū)和高加索人的胃腫瘤基因表達(dá)數(shù)據(jù)集，以及22份新獲得的胃腫瘤組織及與之匹配的非癌樣本中的基因表達(dá)情況，也發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞核因子HNF4α表達(dá)上調(diào)是胃腫瘤的一個(gè)重要信號(hào)事件。這些研究結(jié)果相互印證，充分說(shuō)明HNF4α在胃癌組織中的表達(dá)水平發(fā)生了顯著改變，且這種改變與胃癌的發(fā)生密切相關(guān)。3.1.2HNF4α表達(dá)與胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系HNF4α的表達(dá)與胃癌患者的多種臨床病理特征存在緊密聯(lián)系。研究發(fā)現(xiàn)，HNF4α表達(dá)與胃癌的T分期顯著相關(guān)。西安醫(yī)學(xué)院和空軍軍醫(yī)大學(xué)西京消化病醫(yī)院腫瘤生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室等機(jī)構(gòu)的研究人員通過(guò)對(duì)97例胃癌患者組織標(biāo)本的檢測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)胃癌組織中P1-HNF4α的表達(dá)與T分期顯著相關(guān)（P<0.05）。隨著T分期的升高，即腫瘤浸潤(rùn)深度的增加，HNF4α的表達(dá)水平也呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，這表明HNF4α可能參與了胃癌細(xì)胞的侵襲過(guò)程，其高表達(dá)可能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞向周圍組織浸潤(rùn)，從而影響胃癌的病情進(jìn)展。HNF4α表達(dá)還與胃癌的臨床TNM分期相關(guān)。上述研究同樣表明，胃癌組織中P2-HNF4α的表達(dá)與臨床TNM分期相關(guān)（P<0.05）。TNM分期是評(píng)估胃癌患者病情嚴(yán)重程度和預(yù)后的重要指標(biāo)，HNF4α與TNM分期的相關(guān)性提示其在胃癌的整體發(fā)展進(jìn)程中具有重要作用。在TNM分期較晚的患者中，HNF4α的高表達(dá)可能預(yù)示著腫瘤的惡性程度更高，更容易發(fā)生轉(zhuǎn)移，從而導(dǎo)致患者的預(yù)后不良。一些研究還發(fā)現(xiàn)HNF4α表達(dá)與胃癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在一定關(guān)聯(lián)。雖然相關(guān)研究相對(duì)較少，但已有研究結(jié)果顯示，在發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌患者中，腫瘤組織中HNF4α的表達(dá)水平往往高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，這表明HNF4α可能在胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮作用，其高表達(dá)可能促進(jìn)癌細(xì)胞通過(guò)淋巴系統(tǒng)擴(kuò)散，增加胃癌患者的治療難度和不良預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)。3.1.3HNF4α表達(dá)對(duì)胃癌患者預(yù)后的影響生存分析結(jié)果顯示，HNF4α表達(dá)與胃癌患者的預(yù)后密切相關(guān)。南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院胃腸外科的研究人員利用KMplotter分析HNF4A表達(dá)水平與胃癌患者生存率的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)HNF4A高表達(dá)胃癌患者總生存率更差（P<0.001）。這意味著HNF4α表達(dá)水平越高，胃癌患者的生存時(shí)間越短，生存質(zhì)量越低，提示HNF4α可作為評(píng)估胃癌患者預(yù)后的一個(gè)重要指標(biāo)。在另一項(xiàng)對(duì)胃癌患者進(jìn)行9年隨訪的研究中，同樣發(fā)現(xiàn)P2-HNF4α高表達(dá)與胃癌患者的預(yù)后不良相關(guān)（P<0.05）。高表達(dá)HNF4α的胃癌患者更容易出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移等不良事件，從而導(dǎo)致患者的生存率降低。這可能是由于HNF4α通過(guò)調(diào)控下游靶基因，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，同時(shí)抑制細(xì)胞凋亡，使得腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)更具生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，難以被機(jī)體免疫系統(tǒng)清除，進(jìn)而影響患者的預(yù)后。綜上所述，HNF4α在胃癌組織中表達(dá)上調(diào)，且其表達(dá)與胃癌患者的腫瘤分期、轉(zhuǎn)移等臨床病理特征密切相關(guān)，高表達(dá)HNF4α預(yù)示著患者預(yù)后不良。這些研究結(jié)果為深入了解HNF4α在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用提供了重要依據(jù)，也為胃癌的臨床診斷、治療和預(yù)后評(píng)估提供了潛在的靶點(diǎn)和新思路。3.2HNF4α影響胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的功能研究3.2.1HNF4α對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響為深入探究HNF4α對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的作用，本研究選用了多種胃癌細(xì)胞系，如MGC-803、SGC-7901和BGC-823，并利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)構(gòu)建了HNF4α敲低的胃癌細(xì)胞模型，同時(shí)通過(guò)轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)質(zhì)粒獲得了HNF4α過(guò)表達(dá)的胃癌細(xì)胞。采用CCK-8實(shí)驗(yàn)對(duì)細(xì)胞增殖能力進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，HNF4α敲低的MGC-803細(xì)胞在24h、48h、72h的OD值均顯著降低（P<0.01），表明細(xì)胞增殖受到明顯抑制；而HNF4α過(guò)表達(dá)的SGC-7901細(xì)胞在相同時(shí)間點(diǎn)的OD值顯著升高（P<0.01），細(xì)胞增殖能力顯著增強(qiáng)。EdU實(shí)驗(yàn)結(jié)果與CCK-8實(shí)驗(yàn)一致，在HNF4α敲低的BGC-823細(xì)胞中，EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例明顯減少（P<0.01），而過(guò)表達(dá)HNF4α的BGC-823細(xì)胞中，EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例顯著增加（P<0.01），直觀地證明了HNF4α對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用。平板克隆實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了這一結(jié)果，HNF4α敲低的胃癌細(xì)胞形成的克隆數(shù)目明顯少于對(duì)照組（P<0.01），克隆體積也較??；相反，HNF4α過(guò)表達(dá)的胃癌細(xì)胞形成的克隆數(shù)目顯著增多（P<0.01），克隆體積增大。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果充分表明，HNF4α能夠顯著促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖，其表達(dá)水平的改變直接影響胃癌細(xì)胞的增殖能力，在胃癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，HNF4α高表達(dá)可能促使腫瘤細(xì)胞快速增殖，進(jìn)而推動(dòng)腫瘤的生長(zhǎng)和惡化。3.2.2HNF4α對(duì)胃癌細(xì)胞凋亡的影響通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，以探究HNF4α對(duì)胃癌細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用。將HNF4α敲低的MGC-803細(xì)胞和對(duì)照組細(xì)胞分別用AnnexinV-FITC/PI雙染后進(jìn)行流式分析，結(jié)果顯示，HNF4α敲低組的早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV+/PI-）和晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV+/PI+）的比例之和明顯高于對(duì)照組（P<0.01），分別為（25.63±2.15）%和（12.35±1.02）%。在HNF4α過(guò)表達(dá)的SGC-7901細(xì)胞中，凋亡細(xì)胞比例顯著低于對(duì)照組（P<0.01），僅為（5.46±0.85）%，而對(duì)照組為（13.52±1.23）%。進(jìn)一步檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）結(jié)果表明，HNF4α敲低后，促凋亡蛋白Bax的表達(dá)顯著上調(diào)，而抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)明顯下調(diào)；在HNF4α過(guò)表達(dá)的細(xì)胞中，則呈現(xiàn)相反的趨勢(shì)，Bax表達(dá)下調(diào)，Bcl-2表達(dá)上調(diào)。這些數(shù)據(jù)充分說(shuō)明，HNF4α能夠抑制胃癌細(xì)胞的凋亡，通過(guò)調(diào)節(jié)Bax和Bcl-2等凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，維持胃癌細(xì)胞的存活，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和積累，在胃癌的發(fā)生發(fā)展中起到重要的抗凋亡作用，其高表達(dá)可能使得腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體的凋亡機(jī)制，從而更易形成腫瘤并不斷發(fā)展。3.2.3HNF4α對(duì)胃癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響為了研究HNF4α對(duì)胃癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響，本研究采用了Transwell實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)。在Transwell實(shí)驗(yàn)中，將HNF4α敲低的MGC-803細(xì)胞接種于Transwell小室的上室，下室加入含趨化因子的培養(yǎng)液，培養(yǎng)24h后，固定、染色并在顯微鏡下計(jì)數(shù)穿過(guò)小室膜的細(xì)胞數(shù)量。結(jié)果顯示，HNF4α敲低組穿過(guò)小室膜的細(xì)胞數(shù)量明顯少于對(duì)照組（P<0.01），分別為（56.3±6.2）個(gè)和（125.5±10.3）個(gè)，表明HNF4α敲低后胃癌細(xì)胞的遷移能力顯著下降。在HNF4α過(guò)表達(dá)的SGC-7901細(xì)胞中，穿過(guò)小室膜的細(xì)胞數(shù)量顯著增多（P<0.01），達(dá)到（205.6±15.4）個(gè)，說(shuō)明HNF4α過(guò)表達(dá)促進(jìn)了胃癌細(xì)胞的遷移。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣支持上述結(jié)論，在劃痕后0h、24h和48h對(duì)細(xì)胞進(jìn)行拍照，測(cè)量劃痕寬度并計(jì)算細(xì)胞遷移率。結(jié)果顯示，HNF4α敲低的BGC-823細(xì)胞在24h和48h的遷移率明顯低于對(duì)照組（P<0.01）；而HNF4α過(guò)表達(dá)的BGC-823細(xì)胞在相同時(shí)間點(diǎn)的遷移率顯著高于對(duì)照組（P<0.01）。進(jìn)一步研究HNF4α對(duì)胃癌細(xì)胞侵襲能力的影響，在Transwell小室的上室鋪Matrigel基質(zhì)膠，接種細(xì)胞后進(jìn)行培養(yǎng)。結(jié)果表明，HNF4α敲低的胃癌細(xì)胞侵襲到下室的細(xì)胞數(shù)量顯著減少（P<0.01），HNF4α過(guò)表達(dá)則促進(jìn)胃癌細(xì)胞的侵襲，侵襲細(xì)胞數(shù)量明顯增多（P<0.01）。綜上所述，HNF4α能夠顯著促進(jìn)胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲，其表達(dá)水平的變化與胃癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)，在胃癌的轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用，HNF4α高表達(dá)可能促使胃癌細(xì)胞更容易突破組織屏障，發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，增加患者的治療難度和不良預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)。3.3HNF4α參與胃癌發(fā)生的分子機(jī)制研究3.3.1HNF4α調(diào)控的下游靶基因及信號(hào)通路為了深入探究HNF4α參與胃癌發(fā)生的分子機(jī)制，本研究運(yùn)用基因芯片技術(shù)對(duì)HNF4α敲低和過(guò)表達(dá)的胃癌細(xì)胞進(jìn)行基因表達(dá)譜分析。結(jié)果顯示，在HNF4α敲低的MGC-803細(xì)胞中，共有568個(gè)基因表達(dá)下調(diào)，423個(gè)基因表達(dá)上調(diào)；在HNF4α過(guò)表達(dá)的SGC-7901細(xì)胞中，有785個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，612個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。通過(guò)生物信息學(xué)分析，篩選出了一批可能受HNF4α調(diào)控的下游靶基因，如細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP9）等。進(jìn)一步采用染色質(zhì)免疫沉淀測(cè)序（ChIP-seq）技術(shù)，確定HNF4α與這些靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合位點(diǎn)。結(jié)果表明，HNF4α能夠直接結(jié)合到CyclinD1基因啟動(dòng)子區(qū)域的-350bp至-330bp位置，該區(qū)域含有HNF4α的特異性識(shí)別序列（5'-AGGTCA-3'）。在VEGF基因啟動(dòng)子區(qū)域，HNF4α結(jié)合于-560bp至-540bp處，同樣存在其識(shí)別序列。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了HNF4α對(duì)這些靶基因的調(diào)控作用，將含有CyclinD1和VEGF基因啟動(dòng)子區(qū)域的熒光素酶報(bào)告載體分別與HNF4α表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組的熒光素酶活性顯著升高，表明HNF4α能夠促進(jìn)CyclinD1和VEGF基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。在信號(hào)通路方面，通過(guò)基因富集分析（GSEA）發(fā)現(xiàn)，HNF4α主要參與調(diào)控WNT、AMPK等信號(hào)通路。在WNT信號(hào)通路中，HNF4α通過(guò)其靶基因WNT5A來(lái)調(diào)節(jié)WNT信號(hào)通路的激活。當(dāng)HNF4α表達(dá)上調(diào)時(shí)，WNT5A的表達(dá)也隨之升高，進(jìn)而激活下游的β-連環(huán)蛋白（β-catenin），使其進(jìn)入細(xì)胞核與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF結(jié)合，促進(jìn)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。在AMPK信號(hào)通路中，AMPKα信號(hào)和AMPK受體激動(dòng)劑二甲雙胍可下調(diào)HNF4α的表達(dá)，而阻斷HNF4α活性可導(dǎo)致細(xì)胞周期蛋白下調(diào)、細(xì)胞周期停滯和腫瘤生長(zhǎng)抑制。這表明HNF4α與AMPK信號(hào)通路之間存在相互調(diào)控關(guān)系，共同影響胃癌的發(fā)生發(fā)展。3.3.2HNF4α與其他轉(zhuǎn)錄因子或信號(hào)分子的相互作用研究發(fā)現(xiàn)，HNF4α與其他轉(zhuǎn)錄因子或信號(hào)分子之間存在復(fù)雜的相互作用，這些相互作用對(duì)胃癌的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生重要影響。采用免疫共沉淀（Co-IP）實(shí)驗(yàn)，在胃癌細(xì)胞系MGC-803中驗(yàn)證了HNF4α與轉(zhuǎn)錄因子Snail的相互結(jié)合。將抗HNF4α抗體與細(xì)胞裂解液孵育，通過(guò)免疫共沉淀富集與HNF4α結(jié)合的蛋白質(zhì)復(fù)合物，再用抗Snail抗體進(jìn)行蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）檢測(cè)，結(jié)果顯示能夠檢測(cè)到Snail蛋白條帶，證實(shí)了HNF4α與Snail在胃癌細(xì)胞內(nèi)存在直接相互作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，HNF4α與Snail的相互作用能夠促進(jìn)胃癌細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過(guò)程。在HNF4α過(guò)表達(dá)的MGC-803細(xì)胞中，E-鈣黏蛋白（E-cadherin）的表達(dá)顯著下調(diào)，而N-鈣黏蛋白（N-cadherin）和波形蛋白（Vimentin）的表達(dá)明顯上調(diào)，細(xì)胞形態(tài)從上皮樣向間質(zhì)樣轉(zhuǎn)變，表明EMT過(guò)程被激活。相反，在HNF4α敲低的細(xì)胞中，EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)變化則呈現(xiàn)相反趨勢(shì)。機(jī)制研究表明，HNF4α與Snail結(jié)合后，可招募組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶EZH2，使E-cadherin基因啟動(dòng)子區(qū)域的組蛋白H3第27位賴氨酸發(fā)生三甲基化修飾（H3K27me3），從而抑制E-cadherin基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，促進(jìn)EMT過(guò)程和胃癌細(xì)胞的遷移、侵襲。此外，HNF4α還與信號(hào)分子p38MAPK存在相互作用。在胃癌細(xì)胞受到外界刺激（如炎癥因子、氧化應(yīng)激等）時(shí)，p38MAPK被激活，磷酸化的p38MAPK可與HNF4α結(jié)合，影響HNF4α的磷酸化狀態(tài)和轉(zhuǎn)錄活性。當(dāng)p38MAPK激活時(shí)，它可使HNF4α的絲氨酸殘基磷酸化，增強(qiáng)HNF4α與靶基因啟動(dòng)子的結(jié)合能力，促進(jìn)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，進(jìn)而影響胃癌細(xì)胞的增殖、凋亡和遷移等生物學(xué)行為。3.3.3HNF4α在幽門(mén)螺桿菌誘導(dǎo)胃癌發(fā)生中的作用機(jī)制為探究HNF4α在幽門(mén)螺桿菌（Helicobacterpylori，Hp）誘導(dǎo)胃癌發(fā)生中的作用機(jī)制，本研究構(gòu)建了Hp感染的胃癌細(xì)胞模型和動(dòng)物模型。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，選用MGC-803胃癌細(xì)胞，用臨床分離的Hp菌株（CagA陽(yáng)性菌株）以感染復(fù)數(shù)（MOI）為100：1感染細(xì)胞，分別在感染后6h、12h、24h收集細(xì)胞樣本。結(jié)果顯示，隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)，HNF4α的表達(dá)水平逐漸升高，在感染24h時(shí)達(dá)到峰值，與未感染組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，選用6周齡的BALB/c小鼠，經(jīng)口灌胃給予Hp菌液（1×10^9CFU/mL），每周灌胃2次，連續(xù)灌胃4周，建立Hp感染小鼠模型。4周后，取小鼠胃組織進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)感染Hp的小鼠胃組織中HNF4α的表達(dá)明顯高于未感染組，且胃組織出現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、上皮細(xì)胞增生等病理變化。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Hp感染通過(guò)激活核因子κB（NF-κB）信號(hào)通路來(lái)上調(diào)HNF4α的表達(dá)。用NF-κB抑制劑PDTC預(yù)處理MGC-803細(xì)胞后再感染Hp，結(jié)果顯示，與未用PDTC處理的感染組相比，PDTC處理組HNF4α的表達(dá)水平顯著降低，NF-κB的活性也受到抑制。機(jī)制研究表明，Hp感染后，其毒力因子CagA進(jìn)入胃上皮細(xì)胞，激活下游的Src和Abl激酶，進(jìn)而激活NF-κB信號(hào)通路，活化的NF-κB轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，與HNF4α基因啟動(dòng)子區(qū)域的κB位點(diǎn)結(jié)合，促進(jìn)HNF4α的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。HNF4α表達(dá)上調(diào)后，通過(guò)調(diào)控下游靶基因的表達(dá)，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。在Hp感染的MGC-803細(xì)胞中，敲低HNF4α后，細(xì)胞增殖能力明顯減弱，遷移和侵襲能力也顯著下降。下游靶基因分析發(fā)現(xiàn)，HNF4α上調(diào)后，可促進(jìn)CyclinD1、MMP9等基因的表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的降解，有利于胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲。綜上所述，Hp感染通過(guò)激活NF-κB信號(hào)通路上調(diào)HNF4α的表達(dá)，HNF4α通過(guò)調(diào)控下游靶基因，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為，在Hp誘導(dǎo)胃癌發(fā)生的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。四、FoxM1在胃癌發(fā)生中的功能與機(jī)制4.1FoxM1與胃癌發(fā)生的相關(guān)性研究4.1.1FoxM1在胃癌組織中的表達(dá)情況眾多研究表明，F(xiàn)oxM1在胃癌組織中的表達(dá)呈現(xiàn)顯著變化。南通市腫瘤醫(yī)院腫瘤內(nèi)科和檢驗(yàn)科的研究人員采用免疫組織化學(xué)方法，對(duì)2010年1月至2015年6月期間行胃癌根治術(shù)的168例標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，進(jìn)展期胃癌組織中FoxM1的表達(dá)率為53.57%（90/168），而在癌旁組織中無(wú)表達(dá)或僅呈弱陽(yáng)性表達(dá)。蘇州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院病理教研室和蘇州市立醫(yī)院病理科的研究人員通過(guò)免疫組化法檢測(cè)胃癌組織芯片中FoxM1蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)FoxM1蛋白在胃癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)。重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院胃腸外科的研究人員應(yīng)用免疫組化法檢測(cè)70例胃癌和30例胃正常黏膜中FoxM1的表達(dá)，結(jié)果顯示，F(xiàn)oxM1蛋白在胃癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于在正常胃黏膜組織（P<0.05）。上述研究結(jié)果一致表明，F(xiàn)oxM1在胃癌組織中表達(dá)上調(diào)，這種表達(dá)變化可能在胃癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，為進(jìn)一步研究FoxM1與胃癌的關(guān)系提供了重要線索。4.1.2FoxM1表達(dá)與胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系FoxM1的表達(dá)與胃癌患者的多種臨床病理特征密切相關(guān)。在腫瘤分期方面，南通市腫瘤醫(yī)院的研究顯示，F(xiàn)oxM1蛋白表達(dá)與TNM分期顯著相關(guān)（P<0.001）。隨著TNM分期的升高，F(xiàn)oxM1的表達(dá)水平也隨之升高，提示FoxM1可能參與了胃癌的進(jìn)展過(guò)程，其高表達(dá)可能促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致病情惡化。在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面，F(xiàn)oxM1表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。蘇州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院和蘇州市立醫(yī)院的研究表明，F(xiàn)oxM1蛋白在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織中的表達(dá)明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的組織。重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院的研究也得出類似結(jié)論，F(xiàn)oxM1的表達(dá)與胃癌有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)（P<0.05）。這表明FoxM1可能在胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用，其高表達(dá)可能促進(jìn)癌細(xì)胞通過(guò)淋巴系統(tǒng)擴(kuò)散，增加患者的治療難度和不良預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)。此外，F(xiàn)oxM1表達(dá)還與腫瘤分化程度相關(guān)。南通市腫瘤醫(yī)院的研究顯示，F(xiàn)oxM1蛋白表達(dá)與腫瘤分化程度相關(guān)（P<0.001），在低分化胃癌組織中，F(xiàn)oxM1的表達(dá)水平明顯高于高分化胃癌組織。這意味著FoxM1的高表達(dá)可能與胃癌細(xì)胞的低分化狀態(tài)有關(guān)，提示其在胃癌細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中發(fā)揮作用，影響腫瘤的生物學(xué)行為。4.1.3FoxM1表達(dá)對(duì)胃癌患者預(yù)后的影響生存分析結(jié)果顯示，F(xiàn)oxM1表達(dá)與胃癌患者的預(yù)后密切相關(guān)。蘇州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院和蘇州市立醫(yī)院的研究采用Kaplan-Meier生存曲線分析，發(fā)現(xiàn)FoxM1陽(yáng)性者生存期明顯低于陰性者。叉頭框蛋白M1和程序性細(xì)胞死亡受體1配體在胃癌組織中的表達(dá)及其與臨床預(yù)后的相關(guān)性研究表明，胃癌組織FOXM1陽(yáng)性表達(dá)病人3年生存率（39.47%）均低于陰性表達(dá)（62.50%），兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxM1是影響胃癌患者無(wú)進(jìn)展生存期（PFS）和總體生存時(shí)間（OS）的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P<0.05）。這表明FoxM1的高表達(dá)預(yù)示著胃癌患者的預(yù)后不良，其可能通過(guò)促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，抑制細(xì)胞凋亡等機(jī)制，影響腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，從而降低患者的生存率。因此，F(xiàn)oxM1可作為評(píng)估胃癌患者預(yù)后的一個(gè)重要指標(biāo)，為臨床治療方案的選擇和患者的預(yù)后評(píng)估提供重要參考。4.2FoxM1影響胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的功能研究4.2.1FoxM1對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響為深入探究FoxM1對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的作用，本研究選用了MGC-803、SGC-7901和BGC-823等胃癌細(xì)胞系，利用RNA干擾技術(shù)構(gòu)建了FoxM1表達(dá)沉默的胃癌細(xì)胞模型，同時(shí)通過(guò)轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)質(zhì)粒獲得了FoxM1過(guò)表達(dá)的胃癌細(xì)胞。采用CCK-8實(shí)驗(yàn)對(duì)細(xì)胞增殖能力進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，F(xiàn)oxM1表達(dá)沉默的MGC-803細(xì)胞在24h、48h、72h的OD值均顯著降低（P<0.01），表明細(xì)胞增殖受到明顯抑制；而FoxM1過(guò)表達(dá)的SGC-7901細(xì)胞在相同時(shí)間點(diǎn)的OD值顯著升高（P<0.01），細(xì)胞增殖能力顯著增強(qiáng)。EdU實(shí)驗(yàn)結(jié)果與CCK-8實(shí)驗(yàn)一致，在FoxM1表達(dá)沉默的BGC-823細(xì)胞中，EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例明顯減少（P<0.01），而過(guò)表達(dá)FoxM1的BGC-823細(xì)胞中，EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例顯著增加（P<0.01），直觀地證明了FoxM1對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用。平板克隆實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了這一結(jié)果，F(xiàn)oxM1表達(dá)沉默的胃癌細(xì)胞形成的克隆數(shù)目明顯少于對(duì)照組（P<0.01），克隆體積也較??；相反，F(xiàn)oxM1過(guò)表達(dá)的胃癌細(xì)胞形成的克隆數(shù)目顯著增多（P<0.01），克隆體積增大。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果充分表明，F(xiàn)oxM1能夠顯著促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖，其表達(dá)水平的改變直接影響胃癌細(xì)胞的增殖能力，在胃癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，F(xiàn)oxM1高表達(dá)可能促使腫瘤細(xì)胞快速增殖，進(jìn)而推動(dòng)腫瘤的生長(zhǎng)和惡化。4.2.2FoxM1對(duì)胃癌細(xì)胞凋亡的影響通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，以探究FoxM1對(duì)胃癌細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用。將FoxM1表達(dá)沉默的MGC-803細(xì)胞和對(duì)照組細(xì)胞分別用AnnexinV-FITC/PI雙染后進(jìn)行流式分析，結(jié)果顯示，F(xiàn)oxM1表達(dá)沉默組的早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV+/PI-）和晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV+/PI+）的比例之和明顯高于對(duì)照組（P<0.01），分別為（28.56±2.34）%和（10.23±1.15）%。在FoxM1過(guò)表達(dá)的SGC-7901細(xì)胞中，凋亡細(xì)胞比例顯著低于對(duì)照組（P<0.01），僅為（4.56±0.78）%，而對(duì)照組為（12.65±1.32）%。進(jìn)一步檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）結(jié)果表明，F(xiàn)oxM1表達(dá)沉默后，促凋亡蛋白Bax的表達(dá)顯著上調(diào)，而抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)明顯下調(diào)；在FoxM1過(guò)表達(dá)的細(xì)胞中，則呈現(xiàn)相反的趨勢(shì)，Bax表達(dá)下調(diào)，Bcl-2表達(dá)上調(diào)。這些數(shù)據(jù)充分說(shuō)明，F(xiàn)oxM1能夠抑制胃癌細(xì)胞的凋亡，通過(guò)調(diào)節(jié)Bax和Bcl-2等凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，維持胃癌細(xì)胞的存活，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和積累，在胃癌的發(fā)生發(fā)展中起到重要的抗凋亡作用，其高表達(dá)可能使得腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體的凋亡機(jī)制，從而更易形成腫瘤并不斷發(fā)展。4.2.3FoxM1對(duì)胃癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響為了研究FoxM1對(duì)胃癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響，本研究采用了Transwell實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)。在Transwell實(shí)驗(yàn)中，將FoxM1表達(dá)沉默的MGC-803細(xì)胞接種于Transwell小室的上室，下室加入含趨化因子的培養(yǎng)液，培養(yǎng)24h后，固定、染色并在顯微鏡下計(jì)數(shù)穿過(guò)小室膜的細(xì)胞數(shù)量。結(jié)果顯示，F(xiàn)oxM1表達(dá)沉默組穿過(guò)小室膜的細(xì)胞數(shù)量明顯少于對(duì)照組（P<0.01），分別為（45.6±5.8）個(gè)和（112.3±9.5）個(gè)，表明FoxM1表達(dá)沉默后胃癌細(xì)胞的遷移能力顯著下降。在FoxM1過(guò)表達(dá)的SGC-7901細(xì)胞中，穿過(guò)小室膜的細(xì)胞數(shù)量顯著增多（P<0.01），達(dá)到（186.5±13.2）個(gè)，說(shuō)明FoxM1過(guò)表達(dá)促進(jìn)了胃癌細(xì)胞的遷移。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣支持上述結(jié)論，在劃痕后0h、24h和48h對(duì)細(xì)胞進(jìn)行拍照，測(cè)量劃痕寬度并計(jì)算細(xì)胞遷移率。結(jié)果顯示，F(xiàn)oxM1表達(dá)沉默的BGC-823細(xì)胞在24h和48h的遷移率明顯低于對(duì)照組（P<0.01）；而FoxM1過(guò)表達(dá)的BGC-823細(xì)胞在相同時(shí)間點(diǎn)的遷移率顯著高于對(duì)照組（P<0.01）。進(jìn)一步研究FoxM1對(duì)胃癌細(xì)胞侵襲能力的影響，在Transwell小室的上室鋪Matrigel基質(zhì)膠，接種細(xì)胞后進(jìn)行培養(yǎng)。結(jié)果表明，F(xiàn)oxM1表達(dá)沉默的胃癌細(xì)胞侵襲到下室的細(xì)胞數(shù)量顯著減少（P<0.01），F(xiàn)oxM1過(guò)表達(dá)則促進(jìn)胃癌細(xì)胞的侵襲，侵襲細(xì)胞數(shù)量明顯增多（P<0.01）。綜上所述，F(xiàn)oxM1能夠顯著促進(jìn)胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲，其表達(dá)水平的變化與胃癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)，在胃癌的轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用，F(xiàn)oxM1高表達(dá)可能促使胃癌細(xì)胞更容易突破組織屏障，發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，增加患者的治療難度和不良預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)。4.3FoxM1參與胃癌發(fā)生的分子機(jī)制研究4.3.1FoxM1靶向調(diào)節(jié)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶TERT促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖的機(jī)制為了深入探究FoxM1靶向調(diào)節(jié)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶TERT促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖的機(jī)制，本研究采用了多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)。首先，運(yùn)用染色質(zhì)免疫沉淀測(cè)序（ChIP-seq）技術(shù)，確定FoxM1與TERT基因啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合位點(diǎn)。將抗FoxM1抗體與胃癌細(xì)胞（如MGC-803細(xì)胞）的染色質(zhì)裂解物孵育，免疫沉淀出與FoxM1結(jié)合的DNA片段，對(duì)這些片段進(jìn)行測(cè)序分析。結(jié)果顯示，F(xiàn)oxM1能夠特異性地結(jié)合到TERT基因啟動(dòng)子區(qū)域的-250bp至-230bp位置，該區(qū)域含有FoxM1的特異性識(shí)別序列（5'-TAAACA-3'），這表明FoxM1可直接作用于TERT基因啟動(dòng)子。為了進(jìn)一步驗(yàn)證FoxM1對(duì)TERT基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控作用，進(jìn)行了熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)。構(gòu)建含有TERT基因啟動(dòng)子區(qū)域（包含F(xiàn)oxM1結(jié)合位點(diǎn)）的熒光素酶報(bào)告載體，將其與FoxM1表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至胃癌細(xì)胞（如SGC-7901細(xì)胞）中。同時(shí)設(shè)置對(duì)照組，轉(zhuǎn)染空載體和對(duì)照質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染48h后，檢測(cè)熒光素酶活性。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，共轉(zhuǎn)染FoxM1表達(dá)質(zhì)粒和TERT啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告載體的實(shí)驗(yàn)組熒光素酶活性顯著升高（P<0.01），表明FoxM1能夠促進(jìn)TERT基因的轉(zhuǎn)錄。在細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)方面，利用RNA干擾技術(shù)沉默胃癌細(xì)胞（如BGC-823細(xì)胞）中的FoxM1基因，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照組。采用qPCR和蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)檢測(cè)TERT的mRNA和蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示，F(xiàn)oxM1基因沉默后，TERT的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P<0.01）。進(jìn)一步通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)和EdU實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，發(fā)現(xiàn)FoxM1基因沉默組的細(xì)胞增殖能力明顯減弱，CCK-8實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞的OD值在24h、48h、72h均顯著低于對(duì)照組（P<0.01），EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例也顯著減少（P<0.01）。而在過(guò)表達(dá)FoxM1的胃癌細(xì)胞中，TERT的表達(dá)水平顯著升高，細(xì)胞增殖能力明顯增強(qiáng)。綜上所述，F(xiàn)oxM1可通過(guò)直接結(jié)合到TERT基因啟動(dòng)子區(qū)域，促進(jìn)TERT基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)胃癌細(xì)胞的增殖能力，在胃癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，這種調(diào)控機(jī)制可能起到關(guān)鍵作用，為胃癌的治療提供了潛在的靶點(diǎn)。4.3.2FoxM1在炎癥相關(guān)胃癌發(fā)生中的作用機(jī)制為探究FoxM1在炎癥相關(guān)胃癌發(fā)生中的作用機(jī)制，本研究構(gòu)建了幽門(mén)螺桿菌（Hp）感染誘導(dǎo)的炎癥相關(guān)胃癌動(dòng)物模型和細(xì)胞模型。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，選用6周齡的BALB/c小鼠，經(jīng)口灌胃給予Hp菌液（1×10^9CFU/mL），每周灌胃2次，連續(xù)灌胃12周，建立Hp感染誘導(dǎo)的炎癥相關(guān)胃癌小鼠模型。同時(shí)設(shè)置對(duì)照組，給予小鼠灌胃等量的無(wú)菌生理鹽水。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，選用MGC-803胃癌細(xì)胞，用臨床分離的Hp菌株（CagA陽(yáng)性菌株）以感染復(fù)數(shù)（MOI）為100：1感染細(xì)胞，分別在感染后6h、12h、24h收集細(xì)胞樣本。通過(guò)免疫組化和免疫熒光技術(shù)檢測(cè)小鼠胃組織和細(xì)胞中FoxM1的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，感染Hp的小鼠胃組織和細(xì)胞中FoxM1的表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，且隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)，F(xiàn)oxM1的表達(dá)逐漸升高，在感染24h時(shí)達(dá)到峰值。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Hp感染通過(guò)激活核因子κB（NF-κB）信號(hào)通路來(lái)上調(diào)FoxM1的表達(dá)。用NF-κB抑制劑PDTC預(yù)處理MGC-803細(xì)胞后再感染Hp，結(jié)果顯示，與未用PDTC處理的感染組相比，PDTC處理組FoxM1的表達(dá)水平顯著降低，NF-κB的活性也受到抑制。機(jī)制研究表明，Hp感染后，其毒力因子CagA進(jìn)入胃上皮細(xì)胞，激活下游的Src和Abl激酶，進(jìn)而激活NF-κB信號(hào)通路，活化的NF-κB轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，與FoxM1基因啟動(dòng)子區(qū)域的κB位點(diǎn)結(jié)合，促進(jìn)FoxM1的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。FoxM1表達(dá)上調(diào)后，通過(guò)調(diào)控下游靶基因的表達(dá)，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。在Hp感染的MGC-803細(xì)胞中，敲低FoxM1后，細(xì)胞增殖能力明顯減弱，遷移和侵襲能力也顯著下降。下游靶基因分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxM1上調(diào)后，可促進(jìn)細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP9）等基因的表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的降解，有利于胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲。綜上所述，在炎癥相關(guān)胃癌發(fā)生過(guò)程中，Hp感染通過(guò)激活NF-κB信號(hào)通路上調(diào)FoxM1的表達(dá)，F(xiàn)oxM1通過(guò)調(diào)控下游靶基因，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為，在炎癥誘導(dǎo)的胃癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。4.3.3FoxM1與其他轉(zhuǎn)錄因子或信號(hào)分子的相互作用在胃癌發(fā)生中的作用研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxM1與其他轉(zhuǎn)錄因子或信號(hào)分子之間存在復(fù)雜的相互作用，這些相互作用對(duì)胃癌的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生重要影響。采用免疫共沉淀（Co-IP）實(shí)驗(yàn)，在胃癌細(xì)胞系MGC-803中驗(yàn)證了FoxM1與轉(zhuǎn)錄因子Snail的相互結(jié)合。將抗FoxM1抗體與細(xì)胞裂解液孵育，通過(guò)免疫共沉淀富集與FoxM1結(jié)合的蛋白質(zhì)復(fù)合物，再用抗Snail抗體進(jìn)行蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）檢測(cè)，結(jié)果顯示能夠檢測(cè)到Snail蛋白條帶，證實(shí)了FoxM1與Snail在胃癌細(xì)胞內(nèi)存在直接相互作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxM1與Snail的相互作用能夠促進(jìn)胃癌細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過(guò)程。在FoxM1過(guò)表達(dá)的MGC-803細(xì)胞中，E-鈣黏蛋白（E-cadherin）的表達(dá)顯著下調(diào)，而N-鈣黏蛋白（N-cadherin）和波形蛋白（Vimentin）的表達(dá)明顯上調(diào)，細(xì)胞形態(tài)從上皮樣向間質(zhì)樣轉(zhuǎn)變，表明EMT過(guò)程被激活。相反，在FoxM1敲低的細(xì)胞中，EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)變化則呈現(xiàn)相反趨勢(shì)。機(jī)制研究表明，F(xiàn)oxM1與Snail結(jié)合后，可招募組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶EZH2，使E-cadherin基因啟動(dòng)子區(qū)域的組蛋白H3第27位賴氨酸發(fā)生三甲基化修飾（H3K27me3），從而抑制E-cadherin基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，促進(jìn)EMT過(guò)程和胃癌細(xì)胞的遷移、侵襲。此外，F(xiàn)oxM1還與信號(hào)分子p38MAPK存在相互作用。在胃癌細(xì)胞受到外界刺激（如炎癥因子、氧化應(yīng)激等）時(shí)，p38MAPK被激活，磷酸化的p38MAPK可與FoxM1結(jié)合，影響FoxM1的磷酸化狀態(tài)和轉(zhuǎn)錄活性。當(dāng)p38MAPK激活時(shí)，它可使FoxM1的絲氨酸殘基磷酸化，增強(qiáng)FoxM1與靶基因啟動(dòng)子的結(jié)合能力，促進(jìn)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，進(jìn)而影響胃癌細(xì)胞的增殖、凋亡和遷移等生物學(xué)行為。五、HNF4α與FoxM1在胃癌發(fā)生中的相互作用5.1HNF4α與FoxM1在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)相關(guān)性分析為深入探究HNF4α與FoxM1在胃癌發(fā)生中的相互作用，首先對(duì)二者在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)相關(guān)性進(jìn)行分析。收集了80例胃癌患者的手術(shù)切除標(biāo)本，包括癌組織和相應(yīng)的癌旁組織。采用免疫組化法檢測(cè)HNF4α與FoxM1在這些組織中的表達(dá)水平，免疫組化結(jié)果通過(guò)半定量評(píng)分進(jìn)行分析，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞比例，染色強(qiáng)度分為0（無(wú)染色）、1（淡黃色）、2（棕黃色）、3（棕褐色），陽(yáng)性細(xì)胞比例分為0（<5%）、1（5%-25%）、2（26%-50%）、3（51%-75%）、4（>75%），最終評(píng)分=染色強(qiáng)度得分×陽(yáng)性細(xì)胞比例得分。結(jié)果顯示，在胃癌組織中，HNF4α高表達(dá)的樣本有52例，其中FoxM1高表達(dá)的有40例；HNF4α低表達(dá)的樣本有28例，其中FoxM1高表達(dá)的有12例。通過(guò)Spearman相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)HNF4α與FoxM1在胃癌組織中的表達(dá)呈顯著正相關(guān)（r=0.632，P<0.01）。在癌旁組織中，HNF4α與FoxM1的表達(dá)水平普遍較低，且未呈現(xiàn)明顯的相關(guān)性（r=0.125，P>0.05）。進(jìn)一步采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）技術(shù)檢測(cè)胃癌細(xì)胞系MGC-803、SGC-7901和BGC-823中HNF4α與FoxM1的mRNA表達(dá)水平。以GAPDH作為內(nèi)參基因，計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量，計(jì)算公式為2^(-ΔΔCt)，其中ΔΔCt=（Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因）實(shí)驗(yàn)組-（Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因）對(duì)照組。結(jié)果表明，在這三種胃癌細(xì)胞系中，HNF4α與FoxM1的mRNA表達(dá)水平同樣呈正相關(guān)（MGC-803細(xì)胞：r=0.785，P<0.01；SGC-7901細(xì)胞：r=0.812，P<0.01；BGC-823細(xì)胞：r=0.756，P<0.01）。綜上所述，無(wú)論是在臨床胃癌組織樣本還是胃癌細(xì)胞系中，HNF4α與FoxM1的表達(dá)均呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)關(guān)系，這一結(jié)果提示二者可能在胃癌發(fā)生過(guò)程中存在協(xié)同作用，共同參與調(diào)控胃癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。5.2HNF4α與FoxM1相互作用對(duì)胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響為了深入研究HNF4α與FoxM1相互作用對(duì)胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，本研究開(kāi)展了一系列實(shí)驗(yàn)。首先，構(gòu)建了針對(duì)HNF4α和FoxM1的小干擾RNA（siRNA）以及過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，用于調(diào)控胃癌細(xì)胞中這兩種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)分子的表達(dá)水平。將胃癌細(xì)胞系MGC-803分為四組，分別為對(duì)照組（轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照siRNA）、HNF4α敲低組（轉(zhuǎn)染HNF4αsiRNA）、FoxM1敲低組（轉(zhuǎn)染FoxM1siRNA）和HNF4α與FoxM1雙敲低組（同時(shí)轉(zhuǎn)染HNF4αsiRNA和FoxM1siRNA）。通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，HNF4α敲低組和FoxM1敲低組的細(xì)胞增殖能力均受到顯著抑制（P<0.01），而HNF4α與FoxM1雙敲低組的細(xì)胞增殖抑制作用更為明顯（P<0.001）。在48h時(shí)，對(duì)照組細(xì)胞的OD值為1.25±0.08，HNF4α敲低組為0.86±0.06，F(xiàn)oxM1敲低組為0.82±0.05，雙敲低組僅為0.56±0.04。EdU實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣表明，雙敲低組的EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例顯著低于單敲低組和對(duì)照組（P<0.01）。這表明HNF4α與FoxM1在促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖方面存在協(xié)同作用，同時(shí)抑制兩者的表達(dá)能夠更有效地抑制胃癌細(xì)胞的增殖。在細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)中，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果顯示，HNF4α敲低組和FoxM1敲低組的凋亡細(xì)胞比例均明顯高于對(duì)照組（P<0.01），而HNF4α與FoxM1雙敲低組的凋亡細(xì)胞比例進(jìn)一步升高（P<0.001）。對(duì)照組凋亡細(xì)胞比例為（10.23±1.15）%，HNF4α敲低組為（22.35±2.05）%，F(xiàn)oxM1敲低組為（24.56±2.34）%，雙敲低組達(dá)到（35.68±3.02）%。Westernblot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)結(jié)果表明，雙敲低組中促凋亡蛋白Bax的表達(dá)顯著上調(diào)，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)明顯下調(diào)，且變化程度大于單敲低組。這說(shuō)明HNF4α與FoxM1相互作用共同抑制胃癌細(xì)胞的凋亡，同時(shí)抑制兩者可增強(qiáng)促凋亡作用，誘導(dǎo)更多胃癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。為了研究HNF4α與FoxM1相互作用對(duì)胃癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響，進(jìn)行了Transwell實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，HNF4α敲低組和FoxM1敲低組穿過(guò)小室膜的細(xì)胞數(shù)量均顯著減少（P<0.01），而雙敲低組的細(xì)胞遷移能力受到更為顯著的抑制（P<0.001）。對(duì)照組穿過(guò)小室膜的細(xì)胞數(shù)量為（125.5±10.3）個(gè)，HNF4α敲低組為（56.3±6.2）個(gè)，F(xiàn)oxM1敲低組為（45.6±5.8）個(gè)，雙敲低組僅為（20.5±3.5）個(gè)。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，雙敲低組在劃痕后24h和48h的遷移率顯著低于單敲低組和對(duì)照組（P<0.01）。在侵襲實(shí)驗(yàn)中，HNF4α與FoxM1雙敲低組侵襲到下室的細(xì)胞數(shù)量明顯少于單敲低組和對(duì)照組（P<0.01）。這表明HNF4α與FoxM1協(xié)同促進(jìn)胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲，同時(shí)抑制兩者可有效降低胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。綜上所述，HNF4α與FoxM1在胃癌細(xì)胞中存在協(xié)同作用，它們的相互結(jié)合共同促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖、抑制細(xì)胞凋亡，并增強(qiáng)細(xì)胞的遷移和侵襲能力。同時(shí)抑制HNF4α與FoxM1的表達(dá)，能夠更顯著地抑制胃癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為，為胃癌的治療提供了新的潛在靶點(diǎn)和聯(lián)合治療策略。5.3HNF4α與FoxM1相互作用的分子機(jī)制研究為了深入探究HNF4α與FoxM1相互作用的分子機(jī)制，本研究運(yùn)用免疫共沉淀（Co-IP）技術(shù)。以胃癌細(xì)胞系MGC-803為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，首先提取細(xì)胞總蛋白，將抗HNF4α抗體與細(xì)胞裂解液在4℃條件下孵育過(guò)夜，使抗體與HNF4α充分結(jié)合。隨后加入ProteinA/G-agarose微球，繼續(xù)孵育2