RhoA-Rho激酶信號(hào)通路：解析2型糖尿病大鼠心肌纖維化的關(guān)鍵密碼

RhoA/Rho激酶信號(hào)通路：解析2型糖尿病大鼠心肌纖維化的關(guān)鍵密碼一、引言1.1研究背景與意義2型糖尿病（Type2DiabetesMellitus，T2DM）作為一種常見(jiàn)的慢性代謝性疾病，在全球范圍內(nèi)的發(fā)病率正呈急劇上升趨勢(shì)。國(guó)際糖尿病聯(lián)盟（IDF）的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，2021年全球約有5.37億成年人患有糖尿病，其中T2DM患者占比超過(guò)90%。在中國(guó)，T2DM的患病率也不容小覷，據(jù)最新的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果表明，我國(guó)成年人T2DM患病率已高達(dá)12.8%，患者人數(shù)超1.4億。T2DM不僅表現(xiàn)為血糖水平的持續(xù)升高，還會(huì)引發(fā)全身多系統(tǒng)的慢性并發(fā)癥，嚴(yán)重威脅患者的生命健康和生活質(zhì)量。糖尿病心肌?。―iabeticCardiomyopathy，DCM）是T2DM常見(jiàn)且嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一。臨床上，DCM患者往往逐漸出現(xiàn)心肌結(jié)構(gòu)和功能的異常改變，如心肌肥厚、心肌纖維化、心臟舒張和收縮功能障礙等，最終可發(fā)展為心力衰竭，顯著增加患者的死亡率。心肌纖維化作為DCM的重要病理特征，指的是心肌組織中膠原等細(xì)胞外基質(zhì)成分過(guò)度沉積，導(dǎo)致心肌僵硬度增加，順應(yīng)性降低，心臟舒張和收縮功能受損。研究表明，在T2DM患者中，心肌纖維化的發(fā)生率遠(yuǎn)高于非糖尿病患者，且與患者的預(yù)后密切相關(guān)。然而，目前對(duì)于T2DM導(dǎo)致心肌纖維化的確切分子機(jī)制尚未完全闡明，這在很大程度上限制了DCM的早期診斷和有效治療。RhoA/Rho激酶信號(hào)通路作為細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，在細(xì)胞的多種生理和病理過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。RhoA屬于小G蛋白超家族成員，當(dāng)被上游信號(hào)激活后，可與下游效應(yīng)分子Rho激酶結(jié)合并使其活化?；罨腞ho激酶通過(guò)對(duì)一系列底物蛋白的磷酸化修飾，調(diào)節(jié)細(xì)胞的骨架重組、細(xì)胞增殖、遷移和分化等生物學(xué)行為。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，RhoA/Rho激酶信號(hào)通路在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中扮演著重要角色，如參與心肌肥厚、心肌纖維化、心律失常和心力衰竭等病理過(guò)程。在糖尿病相關(guān)心血管并發(fā)癥中，RhoA/Rho激酶信號(hào)通路也被證實(shí)處于異常激活狀態(tài)，但其在T2DM心肌纖維化中的具體作用機(jī)制仍有待深入研究。深入探討RhoA/Rho激酶信號(hào)通路在T2DM心肌纖維化中的作用機(jī)制，具有重要的理論和臨床意義。從理論層面來(lái)看，有助于進(jìn)一步揭示DCM的發(fā)病機(jī)制，完善糖尿病心血管并發(fā)癥的病理生理學(xué)理論體系；從臨床應(yīng)用角度而言，有望為DCM的早期診斷提供新的生物標(biāo)志物，為開(kāi)發(fā)更加有效的治療策略提供潛在的藥物作用靶點(diǎn)，從而改善T2DM患者的心血管預(yù)后，降低死亡率，具有重大的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀1.2.12型糖尿病的研究現(xiàn)狀在國(guó)外，關(guān)于2型糖尿病的研究一直是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的重點(diǎn)。美國(guó)糖尿病協(xié)會(huì)（ADA）和歐洲糖尿病研究協(xié)會(huì)（EASD）等國(guó)際權(quán)威組織持續(xù)發(fā)布糖尿病診療指南和相關(guān)研究成果。在發(fā)病機(jī)制方面，美國(guó)密歇根大學(xué)研究團(tuán)隊(duì)于2025年2月6日在《科學(xué)》發(fā)表重大突破，發(fā)現(xiàn)2型糖尿病的關(guān)鍵發(fā)病機(jī)制與線粒體受損密切相關(guān)。線粒體作為細(xì)胞的“能量工廠”，其損傷會(huì)觸發(fā)一系列連鎖反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞“返老還童”，進(jìn)而使負(fù)責(zé)產(chǎn)生胰島素的β細(xì)胞忘記如何產(chǎn)生胰島素，引發(fā)血糖失控。在治療方面，新型降糖藥物不斷涌現(xiàn)，如胰高血糖素樣肽-1受體激動(dòng)劑（GLP-1RA）、鈉-葡萄糖共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2抑制劑（SGLT2i）等，這些藥物不僅降糖效果顯著，還具有心血管和腎臟保護(hù)等額外益處。同時(shí)，干細(xì)胞治療、人工胰腺等新興治療手段也在不斷探索和臨床試驗(yàn)中，為2型糖尿病的治療帶來(lái)新的希望。國(guó)內(nèi)對(duì)于2型糖尿病的研究也取得了豐碩成果。中南大學(xué)湘雅醫(yī)院與美國(guó)康奈爾大學(xué)合作，利用人胚胎干細(xì)胞（hESCs）平臺(tái)和高通量藥物/小分子化合物平臺(tái)，結(jié)合新型基因打靶技術(shù)CRISPR、新一代RNA測(cè)序技術(shù)以及hESCs定向胰島beta細(xì)胞分化技術(shù)，首次完成了2型糖尿病易感基因CDKAL1、KCNJ11和KCNQ1在hESCs向胰島beta細(xì)胞分化過(guò)程中的相關(guān)功能驗(yàn)證，并闡述了這些基因在2型糖尿病發(fā)病中的部分機(jī)制，同時(shí)篩選出化學(xué)藥物T5224（AP-1抑制劑）可以特異性修復(fù)CDKAL1基因缺失所導(dǎo)致的胰島beta細(xì)胞功能損傷。此外，國(guó)內(nèi)在2型糖尿病的流行病學(xué)、中醫(yī)中藥治療等方面也有深入研究，強(qiáng)調(diào)生活方式干預(yù)在糖尿病預(yù)防和治療中的重要性，通過(guò)飲食控制、運(yùn)動(dòng)和減輕體重等措施，有效降低血糖水平，延緩糖尿病的進(jìn)展。1.2.2心肌纖維化的研究現(xiàn)狀國(guó)外在心肌纖維化研究領(lǐng)域處于前沿地位。近年來(lái)，對(duì)于心肌纖維化的發(fā)病機(jī)制研究取得了多項(xiàng)重要進(jìn)展。例如，良渚實(shí)驗(yàn)室研究員張進(jìn)團(tuán)隊(duì)與中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所博士宋默識(shí)研究組合作，發(fā)現(xiàn)心肌缺血再灌注損傷后，成纖維細(xì)胞激活蛋白(FAP)會(huì)被激活的成纖維細(xì)胞高度表達(dá)，成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變，持續(xù)激活會(huì)引發(fā)病理性纖維化。通過(guò)構(gòu)建具有靶向FAP功能的巨噬細(xì)胞(FAPCAR-Ms)，經(jīng)小鼠實(shí)驗(yàn)證實(shí)，可顯著改善小鼠心臟功能并減少心肌纖維化程度。在治療方面，不斷探索新的治療靶點(diǎn)和干預(yù)措施，如抑制促纖維化因子的活性、促進(jìn)膠原纖維的降解等，但目前仍缺乏特效的臨床治療方法。國(guó)內(nèi)在心肌纖維化研究方面也有諸多成果。藥學(xué)院潘振偉教授課題組發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）-SAIL是心肌纖維化病理過(guò)程中的一個(gè)關(guān)鍵調(diào)控分子。通過(guò)整體動(dòng)物及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)，SAIL在心肌纖維化中表達(dá)顯著降低，敲減SAIL可誘發(fā)或加重心肌纖維化，而增加SAIL的表達(dá)則可抑制心肌間質(zhì)膠原沉積，改善心臟重構(gòu)，具有顯著的抗心肌纖維化作用。其機(jī)制主要是通過(guò)與核基質(zhì)結(jié)合因子SAFB結(jié)合，阻礙SAFB與RNA聚合酶Ⅱ之間的相互作用，進(jìn)而抑制促纖維化基因的表達(dá)。中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)院通過(guò)優(yōu)化單核RNA測(cè)序流程，發(fā)現(xiàn)新的調(diào)控因子PKNOX2，與健康心臟中的生理性成纖維細(xì)胞活化相關(guān)聯(lián)，且在成纖維細(xì)胞活化到病理性肌成纖維細(xì)胞形成過(guò)程中異常下降，體外實(shí)驗(yàn)表明其對(duì)病理性纖維化重塑具有抑制作用。1.2.3RhoA/Rho激酶信號(hào)通路的研究現(xiàn)狀國(guó)外學(xué)者對(duì)RhoA/Rho激酶信號(hào)通路在心血管疾病中的作用進(jìn)行了大量研究。在心肌肥厚方面，研究發(fā)現(xiàn)RhoA/Rho激酶信號(hào)通路的激活可促進(jìn)心肌細(xì)胞蛋白質(zhì)合成增加，導(dǎo)致心肌細(xì)胞肥大，進(jìn)而引發(fā)心肌肥厚。在心肌纖維化方面，有研究表明Rho激酶通過(guò)磷酸化下游底物，調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞的增殖、遷移和膠原蛋白合成，在心肌纖維化過(guò)程中發(fā)揮重要作用。此外，RhoA/Rho激酶信號(hào)通路還與心律失常和心力衰竭等心血管疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在藥物研發(fā)方面，針對(duì)Rho激酶的抑制劑如法舒地爾等，已在心血管疾病的治療中進(jìn)行臨床試驗(yàn)，展現(xiàn)出一定的治療潛力。國(guó)內(nèi)研究也在深入探索RhoA/Rho激酶信號(hào)通路的功能和機(jī)制。有研究表明，在心肌缺血再灌注損傷模型中，RhoA/Rho激酶信號(hào)通路被激活，導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡增加、炎癥反應(yīng)加劇和心肌纖維化加重。通過(guò)抑制RhoA/Rho激酶信號(hào)通路，可以減輕心肌損傷，改善心臟功能。此外，國(guó)內(nèi)學(xué)者還關(guān)注RhoA/Rho激酶信號(hào)通路與其他信號(hào)通路之間的相互作用，如與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）信號(hào)通路的交叉對(duì)話，共同調(diào)控心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展。1.2.4研究現(xiàn)狀總結(jié)與不足目前，國(guó)內(nèi)外在2型糖尿病、心肌纖維化以及RhoA/Rho激酶信號(hào)通路方面均取得了顯著的研究進(jìn)展，但在三者之間的關(guān)聯(lián)研究，尤其是RhoA/Rho激酶信號(hào)通路在2型糖尿病心肌纖維化中的作用機(jī)制研究仍存在不足。雖然已知RhoA/Rho激酶信號(hào)通路參與心血管疾病的發(fā)生發(fā)展，但在2型糖尿病導(dǎo)致心肌纖維化的特定背景下，該信號(hào)通路的具體激活機(jī)制、上下游分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)以及與其他相關(guān)信號(hào)通路的協(xié)同作用等方面尚未完全明確。此外，針對(duì)RhoA/Rho激酶信號(hào)通路開(kāi)發(fā)的治療藥物，在2型糖尿病心肌纖維化的臨床應(yīng)用中仍面臨諸多挑戰(zhàn)，如藥物的有效性、安全性和特異性等問(wèn)題。因此，深入研究RhoA/Rho激酶信號(hào)通路在2型糖尿病心肌纖維化中的作用機(jī)制，對(duì)于揭示糖尿病心肌病的發(fā)病機(jī)制、開(kāi)發(fā)新型治療策略具有重要意義。1.3研究目的與方法1.3.1研究目的本研究旨在深入探究RhoA/Rho激酶信號(hào)通路在2型糖尿病大鼠心肌纖維化發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的具體作用及分子機(jī)制，為揭示糖尿病心肌病的發(fā)病機(jī)制提供新的理論依據(jù)，并為臨床防治糖尿病心肌纖維化提供潛在的藥物作用靶點(diǎn)和治療策略。具體而言，本研究擬達(dá)成以下目標(biāo)：明確2型糖尿病大鼠心肌組織中RhoA/Rho激酶信號(hào)通路的活性變化，以及該信號(hào)通路的激活或抑制與心肌纖維化程度之間的相關(guān)性。從細(xì)胞和分子水平，闡明RhoA/Rho激酶信號(hào)通路調(diào)控2型糖尿病心肌纖維化的具體作用機(jī)制，包括對(duì)心肌成纖維細(xì)胞增殖、遷移、膠原蛋白合成以及相關(guān)信號(hào)分子表達(dá)的影響。探討針對(duì)RhoA/Rho激酶信號(hào)通路的干預(yù)措施（如使用Rho激酶抑制劑）對(duì)2型糖尿病大鼠心肌纖維化的治療效果，評(píng)估其在改善心臟功能、減輕心肌損傷方面的作用，為糖尿病心肌病的臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1.3.2研究方法實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組：選取健康雄性SD大鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，隨機(jī)分為正常對(duì)照組（NC組）和糖尿病模型組（DM組）。采用高糖高脂飼料喂養(yǎng)聯(lián)合小劑量鏈脲佐菌素（STZ）腹腔注射的方法建立2型糖尿病大鼠模型。建模成功后，將DM組大鼠進(jìn)一步隨機(jī)分為糖尿病對(duì)照組（DM組）、Rho激酶抑制劑組（Y-27632組）和溶劑對(duì)照組（Vehicle組）。Y-27632組給予Rho激酶抑制劑Y-27632腹腔注射，Vehicle組給予等量溶劑腹腔注射，NC組和DM組給予等量生理鹽水腹腔注射，連續(xù)干預(yù)8周。指標(biāo)檢測(cè)：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，處死大鼠，迅速取出心臟，稱重并計(jì)算心臟指數(shù)。采用蘇木精-伊紅（HE）染色和Masson染色觀察心肌組織的病理形態(tài)學(xué)變化和膠原纖維沉積情況，評(píng)估心肌纖維化程度。通過(guò)免疫組織化學(xué)法和Westernblot檢測(cè)心肌組織中RhoA、Rho激酶、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）、Ⅰ型膠原蛋白（ColⅠ）、Ⅲ型膠原蛋白（ColⅢ）等蛋白的表達(dá)水平。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平。此外，采用超聲心動(dòng)圖檢測(cè)大鼠心臟的結(jié)構(gòu)和功能指標(biāo)，如左心室舒張末期內(nèi)徑（LVEDd）、左心室收縮末期內(nèi)徑（LVESd）、左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）和左心室短軸縮短率（LVFS）等。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：分離培養(yǎng)大鼠原代心肌成纖維細(xì)胞，分為正常對(duì)照組、高糖組、高糖+Y-27632組。高糖組給予高糖培養(yǎng)液處理，高糖+Y-27632組在高糖培養(yǎng)液中加入Y-27632干預(yù)。采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力，ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中ColⅠ和ColⅢ的含量。通過(guò)Westernblot和qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中RhoA/Rho激酶信號(hào)通路相關(guān)分子以及纖維化相關(guān)蛋白和基因的表達(dá)變化。數(shù)據(jù)分析：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），組間兩兩比較采用LSD法或Dunnett's法，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.12型糖尿病概述2.1.1發(fā)病機(jī)制2型糖尿病的發(fā)病機(jī)制極為復(fù)雜，是遺傳因素與環(huán)境因素相互作用的結(jié)果，至今尚未完全明確。目前普遍認(rèn)為，胰島素抵抗和胰島素分泌不足是導(dǎo)致2型糖尿病發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。胰島素抵抗指的是機(jī)體組織對(duì)胰島素的敏感性降低，正常劑量的胰島素?zé)o法發(fā)揮正常的生理效應(yīng)，使得胰島素促進(jìn)葡萄糖攝取和利用的效率下降。胰島素抵抗的發(fā)生與多種因素有關(guān)，其中肥胖尤其是中心性肥胖被認(rèn)為是胰島素抵抗的重要危險(xiǎn)因素。肥胖時(shí)，脂肪細(xì)胞體積增大，分泌的脂肪因子如瘦素、脂聯(lián)素等失衡，這些脂肪因子可干擾胰島素信號(hào)傳導(dǎo)通路，導(dǎo)致胰島素抵抗的發(fā)生。此外，長(zhǎng)期高熱量飲食、運(yùn)動(dòng)量減少、睡眠不足等不良生活方式也會(huì)促進(jìn)胰島素抵抗的發(fā)展。胰島素分泌不足則是由于胰島β細(xì)胞功能缺陷所致。在2型糖尿病發(fā)病初期，機(jī)體為了克服胰島素抵抗，胰島β細(xì)胞會(huì)代償性地分泌更多胰島素，以維持血糖水平的相對(duì)穩(wěn)定。然而，隨著病情的進(jìn)展，胰島β細(xì)胞長(zhǎng)期處于高負(fù)荷狀態(tài)，逐漸出現(xiàn)功能衰竭，胰島素分泌逐漸減少，最終無(wú)法滿足機(jī)體的需求，導(dǎo)致血糖水平升高。胰島β細(xì)胞功能缺陷的機(jī)制涉及多個(gè)方面，包括遺傳因素、氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等。遺傳因素使得個(gè)體具有易患2型糖尿病的遺傳背景，某些基因突變可直接影響胰島β細(xì)胞的發(fā)育、功能和存活。氧化應(yīng)激是指體內(nèi)氧化與抗氧化系統(tǒng)失衡，產(chǎn)生過(guò)多的活性氧（ROS），ROS可損傷胰島β細(xì)胞的線粒體、DNA和蛋白質(zhì)等，導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙和凋亡。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是指內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)蛋白質(zhì)折疊和修飾異常，引發(fā)一系列應(yīng)激反應(yīng)，可導(dǎo)致胰島β細(xì)胞功能受損。炎癥反應(yīng)在2型糖尿病的發(fā)病過(guò)程中也起著重要作用，脂肪組織慢性炎癥可釋放多種炎癥因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等，這些炎癥因子可通過(guò)旁分泌和內(nèi)分泌途徑作用于胰島β細(xì)胞，抑制胰島素分泌，并促進(jìn)胰島β細(xì)胞凋亡。除了胰島素抵抗和胰島素分泌不足外，腸道菌群失調(diào)、神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)異常等因素也與2型糖尿病的發(fā)病密切相關(guān)。腸道菌群作為人體的“第二基因組”，在維持腸道屏障功能、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝和免疫調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病患者的腸道菌群結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生顯著改變，有益菌數(shù)量減少，有害菌數(shù)量增加，這種腸道菌群失調(diào)可通過(guò)影響腸道屏障功能、炎癥反應(yīng)和能量代謝等途徑，參與2型糖尿病的發(fā)病。神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)異常主要涉及交感神經(jīng)系統(tǒng)和副交感神經(jīng)系統(tǒng)的失衡，交感神經(jīng)興奮可抑制胰島素分泌，促進(jìn)肝糖原分解和糖異生，導(dǎo)致血糖升高；而副交感神經(jīng)興奮則可促進(jìn)胰島素分泌，抑制肝糖原分解，降低血糖。在2型糖尿病患者中，交感神經(jīng)活性往往增強(qiáng)，副交感神經(jīng)活性減弱，這種神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)失衡進(jìn)一步加重了血糖代謝紊亂。2.1.2流行現(xiàn)狀2型糖尿病已成為全球范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅人類健康的公共衛(wèi)生問(wèn)題，其發(fā)病率呈現(xiàn)出逐年上升的趨勢(shì)。根據(jù)國(guó)際糖尿病聯(lián)盟（IDF）發(fā)布的《全球糖尿病地圖》數(shù)據(jù)顯示，2021年全球成年糖尿病患者人數(shù)已達(dá)5.37億，預(yù)計(jì)到2030年將增至6.43億，2045年將進(jìn)一步增加至7.83億。在不同地區(qū)，2型糖尿病的患病率存在顯著差異，總體上呈現(xiàn)出發(fā)達(dá)國(guó)家高于發(fā)展中國(guó)家，城市高于農(nóng)村的特點(diǎn)。在發(fā)達(dá)國(guó)家，如美國(guó)、加拿大、澳大利亞等，2型糖尿病的患病率普遍超過(guò)10%。其中，美國(guó)2021年糖尿病患病率為13.0%，患者人數(shù)達(dá)3420萬(wàn)。在發(fā)展中國(guó)家，隨著經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展、城市化進(jìn)程的加速以及人們生活方式的改變，2型糖尿病的患病率也在迅速上升。印度作為世界第二人口大國(guó)，2021年糖尿病患者人數(shù)達(dá)7420萬(wàn)，患病率為10.2%。中國(guó)的2型糖尿病流行形勢(shì)同樣嚴(yán)峻，據(jù)最新的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果表明，我國(guó)成年人2型糖尿病患病率已高達(dá)12.8%，患者人數(shù)超1.4億，且呈現(xiàn)出年輕化的趨勢(shì)。從2000年到2021年，我國(guó)2型糖尿病患病率增長(zhǎng)了近3倍，年輕患者（30歲以下）的比例逐漸增加。2型糖尿病患病率的持續(xù)上升，給全球和各國(guó)帶來(lái)了沉重的健康負(fù)擔(dān)和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。糖尿病及其并發(fā)癥嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，增加了患者的致殘率和死亡率。糖尿病腎病是2型糖尿病常見(jiàn)的微血管并發(fā)癥之一，是導(dǎo)致終末期腎病的主要原因；糖尿病視網(wǎng)膜病變可導(dǎo)致失明；糖尿病神經(jīng)病變可引起肢體麻木、疼痛、感覺(jué)異常等，嚴(yán)重影響患者的日常生活。據(jù)統(tǒng)計(jì)，糖尿病患者發(fā)生心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)比非糖尿病患者高2-4倍，心血管疾病是糖尿病患者的主要死因。2型糖尿病的治療費(fèi)用也十分高昂，包括血糖監(jiān)測(cè)、藥物治療、并發(fā)癥治療等方面的費(fèi)用。IDF報(bào)告顯示，2021年全球糖尿病相關(guān)醫(yī)療支出高達(dá)9660億美元，占全球醫(yī)療衛(wèi)生總支出的9.3%。在中國(guó)，2021年糖尿病相關(guān)醫(yī)療支出為1653億美元，占全國(guó)醫(yī)療衛(wèi)生總支出的13.2%。這些費(fèi)用不僅給患者家庭帶來(lái)了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，也對(duì)國(guó)家的醫(yī)療衛(wèi)生資源造成了巨大壓力。2.1.3主要并發(fā)癥2型糖尿病若長(zhǎng)期得不到有效控制，會(huì)引發(fā)多種嚴(yán)重的并發(fā)癥，累及全身多個(gè)器官和系統(tǒng)，對(duì)患者的健康和生命構(gòu)成極大威脅。在心血管系統(tǒng)方面，糖尿病患者發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化的風(fēng)險(xiǎn)顯著增加，易并發(fā)冠心病、心肌梗死、腦卒中等心腦血管疾病。糖尿病性心肌病也是常見(jiàn)的心血管并發(fā)癥之一，主要表現(xiàn)為心肌結(jié)構(gòu)和功能的改變，如心肌肥厚、心肌纖維化、心臟舒張和收縮功能障礙等，最終可發(fā)展為心力衰竭。在腎臟方面，糖尿病腎病是2型糖尿病常見(jiàn)且嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥，早期可出現(xiàn)微量白蛋白尿，隨著病情進(jìn)展，可發(fā)展為大量蛋白尿、腎功能減退，最終導(dǎo)致終末期腎病，需要透析或腎移植治療。在神經(jīng)系統(tǒng)方面，糖尿病神經(jīng)病變較為常見(jiàn)，包括周圍神經(jīng)病變和自主神經(jīng)病變。周圍神經(jīng)病變主要表現(xiàn)為肢體遠(yuǎn)端對(duì)稱性感覺(jué)異常，如麻木、刺痛、燒灼感等，嚴(yán)重時(shí)可影響肢體運(yùn)動(dòng)功能；自主神經(jīng)病變可累及心血管、消化、泌尿生殖等系統(tǒng)，導(dǎo)致心律失常、胃輕癱、尿潴留、性功能障礙等。在眼部，糖尿病視網(wǎng)膜病變是導(dǎo)致失明的主要原因之一，早期可出現(xiàn)視網(wǎng)膜微血管瘤、出血、滲出等病變，隨著病情進(jìn)展，可出現(xiàn)新生血管形成、玻璃體積血、視網(wǎng)膜脫離等嚴(yán)重并發(fā)癥。糖尿病足也是2型糖尿病的嚴(yán)重并發(fā)癥之一，主要表現(xiàn)為足部潰瘍、感染、壞疽等，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致截肢，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。糖尿病心肌病作為2型糖尿病的特異性心血管并發(fā)癥，近年來(lái)受到廣泛關(guān)注。其主要病理特征包括心肌細(xì)胞肥大、心肌纖維化、心肌細(xì)胞凋亡和間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等。心肌纖維化是糖尿病心肌病的重要病理改變之一，指的是心肌組織中膠原等細(xì)胞外基質(zhì)成分過(guò)度沉積，導(dǎo)致心肌僵硬度增加，順應(yīng)性降低，心臟舒張和收縮功能受損。正常情況下，心肌組織中存在著膠原合成與降解的動(dòng)態(tài)平衡，以維持心肌的正常結(jié)構(gòu)和功能。在2型糖尿病狀態(tài)下，多種因素打破了這種平衡，導(dǎo)致膠原合成增加，降解減少，從而引起心肌纖維化。高血糖是導(dǎo)致心肌纖維化的重要因素之一，高血糖可通過(guò)多種途徑激活腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（RAAS），使血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）水平升高。AngⅡ具有強(qiáng)大的促纖維化作用，可刺激心肌成纖維細(xì)胞增殖和膠原蛋白合成，同時(shí)抑制膠原蛋白降解。此外，高血糖還可誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，產(chǎn)生大量的活性氧（ROS）和炎癥因子，如TNF-α、IL-6等，這些物質(zhì)可進(jìn)一步激活心肌成纖維細(xì)胞，促進(jìn)心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展。胰島素抵抗和胰島素分泌不足也在糖尿病心肌纖維化中發(fā)揮重要作用。胰島素抵抗可導(dǎo)致脂肪代謝紊亂，游離脂肪酸水平升高，游離脂肪酸可通過(guò)多種途徑損傷心肌細(xì)胞和心肌成纖維細(xì)胞，促進(jìn)心肌纖維化。胰島素分泌不足則使得心肌細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取和利用減少，能量代謝障礙，導(dǎo)致心肌細(xì)胞功能受損，進(jìn)而促進(jìn)心肌纖維化的發(fā)展。2.2心肌纖維化相關(guān)理論2.2.1定義與病理特征心肌纖維化是指心肌組織中細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）成分，尤其是膠原蛋白的異常過(guò)度沉積，導(dǎo)致心肌纖維之間的結(jié)締組織增多，進(jìn)而引起心肌結(jié)構(gòu)和功能改變的一種病理過(guò)程。在正常生理狀態(tài)下，心肌組織中存在著少量的成纖維細(xì)胞，它們主要負(fù)責(zé)維持心肌細(xì)胞外基質(zhì)的動(dòng)態(tài)平衡，合成和降解適量的膠原蛋白等基質(zhì)成分。然而，當(dāng)心臟受到各種病理性刺激，如高血壓、冠心病、糖尿病、心肌梗死等，心肌成纖維細(xì)胞被激活并發(fā)生增殖和分化，轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞。肌成纖維細(xì)胞具有更強(qiáng)的合成和分泌膠原蛋白的能力，同時(shí)，其對(duì)膠原蛋白降解酶的表達(dá)和活性產(chǎn)生抑制作用，使得膠原蛋白的合成遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)降解，最終導(dǎo)致大量膠原蛋白在心肌間質(zhì)中堆積，形成心肌纖維化。從病理形態(tài)學(xué)角度來(lái)看，心肌纖維化主要表現(xiàn)為心肌組織中膠原纖維的增多和排列紊亂。正常心肌組織中，膠原纖維呈纖細(xì)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，均勻分布于心肌細(xì)胞之間，起到支撐和連接心肌細(xì)胞、維持心肌結(jié)構(gòu)完整性和正常舒縮功能的作用。而在心肌纖維化時(shí)，膠原纖維變得粗大、致密，呈束狀或片狀分布，不僅在心肌間質(zhì)中大量沉積，還可環(huán)繞心肌細(xì)胞生長(zhǎng)，甚至侵入心肌細(xì)胞之間，破壞心肌細(xì)胞的正常排列和結(jié)構(gòu)。此外，心肌纖維化還可導(dǎo)致心肌細(xì)胞肥大、凋亡，以及心肌間質(zhì)中炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等病理變化。心肌細(xì)胞肥大是心臟對(duì)長(zhǎng)期負(fù)荷增加的一種代償性反應(yīng)，但過(guò)度肥大的心肌細(xì)胞會(huì)逐漸失去正常的功能，最終發(fā)生凋亡。炎性細(xì)胞浸潤(rùn)則是機(jī)體對(duì)心肌損傷的一種免疫反應(yīng)，炎癥細(xì)胞釋放的多種細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等，可進(jìn)一步激活心肌成纖維細(xì)胞，促進(jìn)心肌纖維化的發(fā)展。2.2.2對(duì)心臟功能的影響心肌纖維化對(duì)心臟功能的影響是多方面的，且十分嚴(yán)重，它是導(dǎo)致心臟功能障礙和心力衰竭發(fā)生發(fā)展的重要病理基礎(chǔ)。心肌纖維化最直接的影響是導(dǎo)致心室壁僵硬度增加，順應(yīng)性降低。正常情況下，心室在舒張期能夠充分舒張，以容納來(lái)自心房的血液，而在心肌纖維化時(shí)，由于大量膠原纖維的沉積，心肌組織的彈性下降，心室壁變得僵硬，使得心室在舒張期的擴(kuò)張受到限制，難以充分容納血液，從而導(dǎo)致心室舒張末期壓力升高。這種心室舒張功能障礙會(huì)進(jìn)一步影響心臟的充盈，使心輸出量減少，導(dǎo)致組織器官灌注不足。例如，患者可能會(huì)出現(xiàn)乏力、頭暈、活動(dòng)耐力下降等癥狀。隨著心肌纖維化的進(jìn)展，心臟的收縮功能也會(huì)受到損害。膠原纖維的增多不僅會(huì)阻礙心肌細(xì)胞之間的電信號(hào)傳導(dǎo)，影響心肌細(xì)胞的同步收縮，還會(huì)使心肌的收縮力減弱。在心臟收縮期，心肌無(wú)法有效地將血液泵出，導(dǎo)致射血分?jǐn)?shù)降低，心臟泵血功能下降。長(zhǎng)期的心肌收縮功能障礙可導(dǎo)致心臟逐漸擴(kuò)大，最終發(fā)展為心力衰竭。心力衰竭是心肌纖維化的嚴(yán)重后果，患者會(huì)出現(xiàn)呼吸困難、水腫、乏力等一系列癥狀，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量，甚至危及生命。此外，心肌纖維化還與心律失常的發(fā)生密切相關(guān)。由于心肌纖維化導(dǎo)致心肌組織的電生理特性發(fā)生改變，心肌細(xì)胞的興奮性、傳導(dǎo)性和自律性異常，容易引發(fā)各種心律失常，如室性早搏、室性心動(dòng)過(guò)速、心房顫動(dòng)等。心律失常的發(fā)生進(jìn)一步加重了心臟功能的損害，增加了患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)。2.2.3與2型糖尿病的關(guān)聯(lián)2型糖尿病與心肌纖維化之間存在著緊密的內(nèi)在聯(lián)系，2型糖尿病是心肌纖維化的重要危險(xiǎn)因素，可通過(guò)多種途徑促進(jìn)心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展。高血糖是2型糖尿病的主要特征之一，也是導(dǎo)致心肌纖維化的關(guān)鍵因素。長(zhǎng)期的高血糖狀態(tài)可引發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，使體內(nèi)活性氧（ROS）生成增多。ROS具有很強(qiáng)的氧化活性，可損傷心肌細(xì)胞和心肌成纖維細(xì)胞的細(xì)胞膜、蛋白質(zhì)和DNA等生物大分子，導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙。同時(shí)，ROS還可激活一系列細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，如核因子-κB（NF-κB）信號(hào)通路，促進(jìn)炎癥因子的表達(dá)和釋放，引發(fā)炎癥反應(yīng)。炎癥反應(yīng)可進(jìn)一步損傷心肌組織，并刺激心肌成纖維細(xì)胞活化和增殖，促進(jìn)膠原蛋白合成，導(dǎo)致心肌纖維化。胰島素抵抗和胰島素分泌不足也是2型糖尿病促進(jìn)心肌纖維化的重要機(jī)制。胰島素抵抗使得機(jī)體對(duì)胰島素的敏感性降低，胰島素?zé)o法正常發(fā)揮其生理作用。胰島素不僅對(duì)血糖代謝具有重要調(diào)節(jié)作用，還對(duì)心肌細(xì)胞和心肌成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和代謝具有調(diào)節(jié)作用。胰島素抵抗時(shí)，胰島素對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用減弱，心肌細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取和利用減少，能量代謝障礙，導(dǎo)致心肌細(xì)胞功能受損。同時(shí)，胰島素抵抗還可引起脂肪代謝紊亂，游離脂肪酸水平升高。游離脂肪酸可通過(guò)多種途徑損傷心肌細(xì)胞和心肌成纖維細(xì)胞，如激活蛋白激酶C（PKC）信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)，進(jìn)而促進(jìn)心肌纖維化。胰島素分泌不足則使得機(jī)體無(wú)法有效調(diào)節(jié)血糖水平，進(jìn)一步加重高血糖狀態(tài)，同時(shí)也影響了胰島素對(duì)心肌組織的正常調(diào)節(jié)作用，促進(jìn)心肌纖維化的發(fā)展。此外，2型糖尿病患者常伴有腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（RAAS）的激活。RAAS的主要活性物質(zhì)血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）具有強(qiáng)大的促纖維化作用。AngⅡ可通過(guò)與心肌細(xì)胞和心肌成纖維細(xì)胞表面的受體結(jié)合，激活多種信號(hào)通路，如絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路、磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號(hào)通路等，促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞增殖和膠原蛋白合成，同時(shí)抑制膠原蛋白降解，從而導(dǎo)致心肌纖維化。高血糖還可通過(guò)非酶糖基化作用，使多種蛋白質(zhì)發(fā)生糖基化修飾，形成晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）。AGEs可與細(xì)胞表面的受體結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，促進(jìn)氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞增殖，進(jìn)一步加重心肌纖維化。2.3RhoA/Rho激酶信號(hào)通路介紹2.3.1組成與正常生理功能RhoA/Rho激酶信號(hào)通路主要由RhoA蛋白和Rho激酶組成。RhoA屬于小G蛋白超家族Rho亞家族成員，其分子量約為21kDa。RhoA蛋白在細(xì)胞內(nèi)以兩種狀態(tài)存在，即與鳥(niǎo)苷二磷酸（GDP）結(jié)合的失活態(tài)和與鳥(niǎo)苷三磷酸（GTP）結(jié)合的激活態(tài)。在正常生理狀態(tài)下，RhoA主要以GDP結(jié)合形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激時(shí)，RhoA會(huì)發(fā)生構(gòu)象變化，與GDP分離并結(jié)合GTP，從而被激活。激活后的RhoA能夠招募并激活下游的效應(yīng)分子，其中最重要的就是Rho激酶。Rho激酶，又稱為Rho相關(guān)卷曲螺旋形成蛋白激酶（ROCK），屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族，在哺乳動(dòng)物中主要有兩種亞型，即ROCK1和ROCK2。ROCK1和ROCK2具有相似的結(jié)構(gòu)和功能，它們都包含一個(gè)氨基末端激酶結(jié)構(gòu)域、中間的卷曲螺旋含有Rho結(jié)合域（RBD）和一個(gè)羧基末端富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域（CRD），位于血小板-白細(xì)胞C激酶底物同源（PH）基序。Rho激酶的底物眾多，包括肌球蛋白輕鏈磷酸酶（MLCP）的肌球蛋白結(jié)合亞基（MBS）、ERM蛋白（ezrin/radixin/moesin）、內(nèi)收蛋白（adducin）、中間絲蛋白、LIM激酶及鈉/氫交換因子等。RhoA/Rho激酶信號(hào)通路在細(xì)胞的多種生理過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。在細(xì)胞收縮方面，Rho激酶可通過(guò)直接磷酸化肌球蛋白輕鏈（MLC），使其發(fā)生磷酸化，從而增強(qiáng)肌動(dòng)蛋白與肌球蛋白之間的相互作用，引起細(xì)胞收縮。同時(shí)，Rho激酶還能抑制MLCP的活性，使MLC的磷酸化水平維持在較高狀態(tài)，進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞收縮。在細(xì)胞增殖過(guò)程中，RhoA/Rho激酶信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程，促進(jìn)細(xì)胞從G1期向S期過(guò)渡，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖。研究表明，RhoA的激活可以上調(diào)細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）等相關(guān)基因的表達(dá)，推動(dòng)細(xì)胞周期的進(jìn)展。在細(xì)胞遷移方面，RhoA/Rho激酶信號(hào)通路通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的重組，影響細(xì)胞的形態(tài)和運(yùn)動(dòng)能力。激活的RhoA可促使肌動(dòng)蛋白聚合形成應(yīng)力纖維，增強(qiáng)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的黏附力，同時(shí)調(diào)節(jié)細(xì)胞的偽足形成和收縮，從而促進(jìn)細(xì)胞遷移。此外，RhoA/Rho激酶信號(hào)通路還參與細(xì)胞的分化、凋亡、基因轉(zhuǎn)錄等多種生理過(guò)程，對(duì)維持細(xì)胞的正常功能和組織的穩(wěn)態(tài)具有重要意義。2.3.2激活機(jī)制RhoA/Rho激酶信號(hào)通路的激活是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，涉及多種信號(hào)分子和細(xì)胞表面受體的參與。當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激，如生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、激素、機(jī)械應(yīng)力等，細(xì)胞表面的受體首先被激活。這些受體包括G蛋白偶聯(lián)受體（GPCRs）、受體酪氨酸激酶（RTKs）等。以GPCRs為例，當(dāng)配體與GPCRs結(jié)合后，受體發(fā)生構(gòu)象變化，激活與之偶聯(lián)的G蛋白。G蛋白由α、β、γ三個(gè)亞基組成，在非活化狀態(tài)下，α亞基與GDP結(jié)合。當(dāng)GPCRs激活后，G蛋白的α亞基發(fā)生鳥(niǎo)苷酸交換，與GDP分離并結(jié)合GTP，從而使G蛋白活化?；罨腉α亞基可以進(jìn)一步激活下游的鳥(niǎo)苷酸交換因子（GEFs）。GEFs是一類重要的信號(hào)分子，它們能夠促進(jìn)RhoA與GDP的解離，使其結(jié)合GTP而活化。常見(jiàn)的GEFs包括Vav、Dbl家族等。GEFs通過(guò)與RhoA相互作用，改變RhoA的構(gòu)象，使其更容易與GTP結(jié)合。一旦RhoA與GTP結(jié)合，就會(huì)發(fā)生構(gòu)象變化，暴露其與下游效應(yīng)分子結(jié)合的位點(diǎn)，從而激活Rho激酶。Rho激酶被激活后，其激酶活性增強(qiáng)，能夠?qū)ο掠蔚亩喾N底物蛋白進(jìn)行磷酸化修飾，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞的生物學(xué)行為。除了GEFs的作用外，還有一些其他的調(diào)節(jié)因子也參與RhoA的激活過(guò)程，如鳥(niǎo)苷酸解離抑制因子（GDIs）和GTP酶激活蛋白（GAPs）。GDIs能夠與RhoA結(jié)合，抑制RhoA與GDP的解離，從而維持RhoA的非活化狀態(tài)。而GAPs則可以促進(jìn)RhoA結(jié)合的GTP水解為GDP，使RhoA失活。在正常生理狀態(tài)下，GEFs、GDIs和GAPs之間的動(dòng)態(tài)平衡精細(xì)地調(diào)節(jié)著RhoA的活性，以適應(yīng)細(xì)胞不同的生理需求。2.3.3與疾病的關(guān)系RhoA/Rho激酶信號(hào)通路的異常激活與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在心血管疾病方面，RhoA/Rho激酶信號(hào)通路在心肌肥厚、心肌纖維化、心律失常和心力衰竭等疾病中發(fā)揮著重要作用。在心肌肥厚過(guò)程中，血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）、去甲腎上腺素（NE）等神經(jīng)激素可通過(guò)激活GPCRs，進(jìn)而激活RhoA/Rho激酶信號(hào)通路。激活的Rho激酶可促進(jìn)心肌細(xì)胞蛋白質(zhì)合成增加，細(xì)胞體積增大，導(dǎo)致心肌肥厚。同時(shí)，RhoA/Rho激酶信號(hào)通路還可通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的合成和降解，參與心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展。研究表明，在心肌梗死、高血壓等病理?xiàng)l件下，RhoA/Rho激酶信號(hào)通路被激活，導(dǎo)致心肌成纖維細(xì)胞增殖和膠原蛋白合成增加，心肌纖維化加重，影響心臟的結(jié)構(gòu)和功能。此外，RhoA/Rho激酶信號(hào)通路的異常激活還與心律失常和心力衰竭的發(fā)生密切相關(guān)。Rho激酶可通過(guò)調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞的電生理特性，影響心肌細(xì)胞的興奮性、傳導(dǎo)性和自律性，從而引發(fā)心律失常。在心力衰竭患者中，RhoA/Rho激酶信號(hào)通路的激活可導(dǎo)致心肌收縮力減弱，心臟泵血功能下降，進(jìn)一步加重心力衰竭的病情。在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，RhoA/Rho激酶信號(hào)通路也扮演著重要角色。例如，在腦缺血損傷中，缺血缺氧可導(dǎo)致RhoA/Rho激酶信號(hào)通路激活。激活的Rho激酶可促使神經(jīng)元軸突生長(zhǎng)錐塌陷，抑制軸突再生，阻礙神經(jīng)功能的恢復(fù)。同時(shí)，RhoA/Rho激酶信號(hào)通路還可通過(guò)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，損傷神經(jīng)細(xì)胞和血腦屏障，加重腦缺血損傷。在神經(jīng)退行性疾病如阿爾茨海默病和帕金森病中，RhoA/Rho激酶信號(hào)通路的異常激活也與神經(jīng)元的凋亡和神經(jīng)炎癥密切相關(guān)。此外，RhoA/Rho激酶信號(hào)通路還與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。在腫瘤細(xì)胞中，RhoA/Rho激酶信號(hào)通路的激活可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，同時(shí)抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡。研究表明，Rho激酶的高表達(dá)與多種腫瘤的不良預(yù)后相關(guān)，如乳腺癌、肺癌、結(jié)直腸癌等。通過(guò)抑制RhoA/Rho激酶信號(hào)通路，可以有效地抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，為腫瘤的治療提供了新的靶點(diǎn)和策略。三、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法3.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及模型構(gòu)建3.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇本研究選用健康雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，體重200-220g，購(gòu)自[具體實(shí)驗(yàn)動(dòng)物供應(yīng)商名稱]，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為[具體許可證號(hào)]。SD大鼠是一種廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)和生物學(xué)研究的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，具有生長(zhǎng)快、繁育性能好、對(duì)性激素敏感、對(duì)呼吸道疾病有較強(qiáng)抵抗力等優(yōu)點(diǎn)。其體型較大，便于進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)操作，如采血、注射等，且生理特征與人類較為相似，能夠較好地模擬人類疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。在實(shí)驗(yàn)前，將大鼠置于溫度為（22±2）℃、相對(duì)濕度為（50±10）%的標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物房?jī)?nèi)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，給予自由飲食和飲水，12h光照/12h黑暗的循環(huán)照明條件，以使其適應(yīng)實(shí)驗(yàn)環(huán)境，減少環(huán)境因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。在適應(yīng)性飼養(yǎng)期間，密切觀察大鼠的精神狀態(tài)、飲食、飲水和體重變化等情況，確保大鼠健康狀況良好，無(wú)異常行為和疾病表現(xiàn)。3.1.22型糖尿病大鼠模型建立采用高脂飲食結(jié)合小劑量鏈脲佐菌素（STZ）腹腔注射的方法建立2型糖尿病大鼠模型。首先，將大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組（NC組）和糖尿病模型組（DM組）。NC組給予普通飼料喂養(yǎng)，DM組給予高脂飼料喂養(yǎng)，高脂飼料配方為：普通飼料65%、豬油10%、蔗糖20%、膽固醇2.5%、膽酸鈉0.5%。高脂飼料喂養(yǎng)8周，以誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生胰島素抵抗。在高脂飲食喂養(yǎng)8周后，DM組大鼠禁食12h，不禁水，然后腹腔注射STZ（Sigma公司產(chǎn)品）。將STZ用0.1mol/L、pH4.5的檸檬酸緩沖液配制成1%的溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配，避光保存。按照30mg/kg的劑量，一次性腹腔注射STZ溶液。NC組大鼠則腹腔注射等量的檸檬酸緩沖液。注射STZ后，大鼠繼續(xù)給予高脂飼料喂養(yǎng)，并密切觀察大鼠的一般情況，如精神狀態(tài)、飲食、飲水、尿量和體重變化等。由于STZ具有一定的毒性，部分大鼠可能會(huì)在注射后出現(xiàn)低血糖、死亡等情況，因此需要及時(shí)補(bǔ)充5%葡萄糖溶液，以維持大鼠的血糖水平，減少死亡率。3.1.3模型驗(yàn)證在注射STZ后3天，采用血糖儀（強(qiáng)生公司產(chǎn)品）測(cè)定大鼠的空腹血糖水平。若空腹血糖≥16.7mmol/L，則判定為糖尿病模型成功。同時(shí)，在注射STZ后1周和2周，再次測(cè)定空腹血糖，以確保血糖水平持續(xù)穩(wěn)定升高。除了測(cè)定血糖水平外，還進(jìn)行了口服葡萄糖耐量試驗(yàn)（OGTT）和胰島素水平檢測(cè)，以進(jìn)一步驗(yàn)證模型的成功。OGTT具體操作如下：大鼠禁食12h后，按2g/kg的劑量經(jīng)口灌胃給予50%葡萄糖溶液，分別于灌胃前（0min）、灌胃后30min、60min、120min和180min采集尾靜脈血，用血糖儀測(cè)定血糖水平。糖尿病模型組大鼠的血糖曲線下面積（AUC）明顯大于正常對(duì)照組，表明糖尿病模型組大鼠對(duì)葡萄糖的耐量明顯降低。胰島素水平檢測(cè)采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒（南京建成生物工程研究所產(chǎn)品），按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，測(cè)定大鼠血清中的胰島素含量。糖尿病模型組大鼠的胰島素水平明顯低于正常對(duì)照組，且胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）顯著升高，表明糖尿病模型組大鼠存在胰島素抵抗。通過(guò)以上指標(biāo)的檢測(cè)，綜合判斷2型糖尿病大鼠模型建立成功。3.2實(shí)驗(yàn)分組3.2.1正常對(duì)照組正常對(duì)照組選取10只健康雄性SD大鼠，給予普通飼料喂養(yǎng)，自由飲水，在溫度（22±2）℃、相對(duì)濕度（50±10）%的標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物房?jī)?nèi)飼養(yǎng)，12h光照/12h黑暗的循環(huán)照明條件。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，不進(jìn)行任何造模操作及藥物干預(yù)，僅作為正常生理狀態(tài)下的對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)，用于對(duì)比其他實(shí)驗(yàn)組大鼠在各項(xiàng)指標(biāo)上的差異，以明確2型糖尿病模型建立以及藥物干預(yù)對(duì)大鼠心肌纖維化等相關(guān)指標(biāo)的影響。在實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)，每周定期測(cè)量大鼠的體重、空腹血糖等指標(biāo)，密切觀察大鼠的精神狀態(tài)、飲食、飲水、活動(dòng)等日常情況，確保大鼠處于正常健康狀態(tài)，無(wú)異常行為和疾病表現(xiàn)。3.2.22型糖尿病模型組糖尿病模型組共30只大鼠，采用上述高脂飲食結(jié)合小劑量鏈脲佐菌素（STZ）腹腔注射的方法成功建立2型糖尿病模型。建模成功后，繼續(xù)給予高脂飼料喂養(yǎng)，自由飲水。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，密切觀察大鼠的一般情況，包括精神狀態(tài)、飲食、飲水、尿量和體重變化等。每周測(cè)量大鼠的空腹血糖水平，以監(jiān)測(cè)糖尿病病情的發(fā)展。在實(shí)驗(yàn)第4周和第8周，分別進(jìn)行口服葡萄糖耐量試驗(yàn)（OGTT），評(píng)估大鼠的葡萄糖代謝能力。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，處死大鼠，采集心臟、血液等樣本，用于后續(xù)的各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)分析，以明確2型糖尿病大鼠心肌組織的病理變化以及相關(guān)分子機(jī)制。3.2.3抑制劑干預(yù)組抑制劑干預(yù)組選用Rho激酶抑制劑Y-27632進(jìn)行干預(yù)，該抑制劑能夠特異性地抑制Rho激酶的活性，從而阻斷RhoA/Rho激酶信號(hào)通路。將建模成功的2型糖尿病大鼠隨機(jī)分為Y-27632組和溶劑對(duì)照組（Vehicle組），每組15只。Y-27632組大鼠給予Y-27632腹腔注射，劑量為3mg/kg，每天1次，連續(xù)干預(yù)8周。Vehicle組給予等量的溶劑（生理鹽水）腹腔注射，同樣每天1次，連續(xù)8周。在干預(yù)期間，密切觀察大鼠的一般情況，每周測(cè)量體重和空腹血糖。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，對(duì)兩組大鼠進(jìn)行與糖尿病模型組相同的樣本采集和檢測(cè)指標(biāo)分析，以評(píng)估Y-27632對(duì)2型糖尿病大鼠心肌纖維化的干預(yù)效果，明確RhoA/Rho激酶信號(hào)通路在2型糖尿病心肌纖維化中的作用。3.3檢測(cè)指標(biāo)與方法3.3.1血糖、胰島素等代謝指標(biāo)檢測(cè)在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，分別于實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前、實(shí)驗(yàn)第4周、第8周和第12周，對(duì)各組大鼠進(jìn)行空腹血糖（FastingBloodGlucose，F(xiàn)BG）檢測(cè)。大鼠禁食12h后，采用血糖儀（強(qiáng)生公司產(chǎn)品）經(jīng)尾靜脈采血測(cè)定FBG。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，大鼠禁食12h后，經(jīng)腹主動(dòng)脈采血，3000r/min離心15min，分離血清，采用全自動(dòng)生化分析儀（日立公司產(chǎn)品）測(cè)定血清中的總膽固醇（TotalCholesterol，TC）、甘油三酯（Triglyceride，TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LowDensityLipoproteinCholesterol，LDL-C）和高密度脂蛋白膽固醇（HighDensityLipoproteinCholesterol，HDL-C）水平。采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay，ELISA）試劑盒（南京建成生物工程研究所產(chǎn)品）測(cè)定血清胰島素（Insulin，INS）含量，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，使用酶標(biāo)儀（Thermo公司產(chǎn)品）測(cè)定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算胰島素濃度。根據(jù)空腹血糖和胰島素水平，采用穩(wěn)態(tài)模型評(píng)估法（HomeostasisModelAssessment，HOMA）計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR），公式為：HOMA-IR=FBG（mmol/L）×INS（mU/L）/22.5。采用高效液相色譜法（HighPerformanceLiquidChromatography，HPLC）測(cè)定糖化血紅蛋白（GlycatedHemoglobin，HbA1c）水平，具體操作按照儀器操作規(guī)程進(jìn)行。3.3.2心肌組織病理形態(tài)觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，迅速取出大鼠心臟，用預(yù)冷的生理鹽水沖洗干凈，去除血液及其他雜質(zhì)。將心臟置于4%多聚甲醛溶液中固定24h，然后進(jìn)行常規(guī)脫水、透明、浸蠟和包埋，制成石蠟切片，厚度為4μm。取部分石蠟切片進(jìn)行蘇木精-伊紅（HematoxylinandEosin，HE）染色，具體步驟如下：切片脫蠟至水，蘇木精染液染色5min，自來(lái)水沖洗10min，1%鹽酸乙醇分化數(shù)秒，自來(lái)水沖洗返藍(lán)，伊紅染液染色3min，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。在光學(xué)顯微鏡下觀察心肌組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)，包括心肌細(xì)胞的大小、形態(tài)、排列以及有無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等情況。另取部分石蠟切片進(jìn)行Masson染色，以觀察心肌組織中膠原纖維的沉積情況。Masson染色步驟如下：切片脫蠟至水，Weigert鐵蘇木精染液染色5min，自來(lái)水沖洗5min，1%鹽酸乙醇分化數(shù)秒，自來(lái)水沖洗返藍(lán)，Masson藍(lán)化液處理3min，Biebrich猩紅-酸性品紅染液染色10min，磷鉬酸水溶液處理5min，苯胺藍(lán)染液染色5min，1%冰醋酸處理30s，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。在光學(xué)顯微鏡下觀察，膠原纖維呈藍(lán)色，肌纖維呈紅色，通過(guò)圖像分析軟件（Image-ProPlus6.0）計(jì)算心肌組織中膠原容積分?jǐn)?shù)（CollagenVolumeFraction，CVF），以評(píng)估心肌纖維化程度，CVF=（膠原纖維面積/心肌組織總面積）×100%。3.3.3RhoA/Rho激酶信號(hào)通路相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-TimeFluorescenceQuantitativePCR，qRT-PCR）技術(shù)檢測(cè)心肌組織中RhoA、Rho激酶（ROCK1和ROCK2）及其下游靶基因的mRNA表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，迅速取大鼠心肌組織，用TRIzol試劑（Invitrogen公司產(chǎn)品）提取總RNA，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。采用核酸蛋白測(cè)定儀（Thermo公司產(chǎn)品）測(cè)定RNA的濃度和純度，確保A260/A280比值在1.8-2.0之間。取1μg總RNA，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司產(chǎn)品）將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，采用SYBRGreen熒光定量PCR試劑盒（TaKaRa公司產(chǎn)品）進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系為20μL，包括10μLSYBRGreenMix、1μL上游引物（10μmol/L）、1μL下游引物（10μmol/L）、2μLcDNA模板和6μLddH2O。引物序列根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中大鼠相關(guān)基因序列設(shè)計(jì)，由上海生工生物工程有限公司合成，具體引物序列如下：RhoA上游引物5'-GGGCTGAAGAAGAGCAGAAG-3'，下游引物5'-CAGCTGCTGCTGAAGAAGAA-3'；ROCK1上游引物5'-CCCAAGGAGCAGAAGAACAA-3'，下游引物5'-CAGTTCAGCGGAGAAGAGCA-3'；ROCK2上游引物5'-GAGCAGAAGAACAAGGAGCA-3'，下游引物5'-GAAGAGCAGCAGCAGAAGAA-3'；GAPDH上游引物5'-AAGGTCGGAGTCAACGGATTT-3'，下游引物5'-GGAAGATGGTGATGGGATTTC-3'。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s，95℃變性5s，60℃退火30s，共40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量，以GAPDH作為內(nèi)參基因。采用蛋白質(zhì)免疫印跡（WesternBlot）法檢測(cè)心肌組織中RhoA、Rho激酶（ROCK1和ROCK2）及其下游靶蛋白的表達(dá)水平。取適量心肌組織，加入含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上勻漿裂解30min，4℃、12000r/min離心15min，取上清液，采用BCA蛋白定量試劑盒（Thermo公司產(chǎn)品）測(cè)定蛋白濃度。取30μg蛋白樣品，加入上樣緩沖液，煮沸5min使蛋白變性。將變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。將PVDF膜用5%脫脂牛奶封閉1h，然后分別加入兔抗大鼠RhoA、ROCK1、ROCK2、p-MYPT1（Rho激酶的底物）和β-actin抗體（CellSignalingTechnology公司產(chǎn)品），4℃孵育過(guò)夜。次日，用TBST洗膜3次，每次10min，然后加入相應(yīng)的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗（CellSignalingTechnology公司產(chǎn)品），室溫孵育1h。再次用TBST洗膜3次，每次10min，最后采用化學(xué)發(fā)光試劑（Millipore公司產(chǎn)品）進(jìn)行顯色，使用凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司產(chǎn)品）采集圖像，通過(guò)ImageJ軟件分析條帶灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。3.3.4其他相關(guān)信號(hào)通路指標(biāo)檢測(cè)由于心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展涉及多個(gè)信號(hào)通路的相互作用，除了RhoA/Rho激酶信號(hào)通路外，本研究還檢測(cè)了轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TransformingGrowthFactor-β1，TGF-β1）/Smad信號(hào)通路相關(guān)指標(biāo)。采用ELISA試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司產(chǎn)品）測(cè)定血清和心肌組織勻漿中TGF-β1的含量，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，使用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算TGF-β1濃度。采用qRT-PCR和WesternBlot法檢測(cè)心肌組織中TGF-β1、Smad2、Smad3和Smad7的mRNA和蛋白表達(dá)水平，引物序列和實(shí)驗(yàn)方法同RhoA/Rho激酶信號(hào)通路相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。此外，還采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)心肌組織中TGF-β1蛋白的表達(dá)和定位，具體步驟如下：石蠟切片脫蠟至水，3%過(guò)氧化氫室溫孵育10min以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，檸檬酸鹽緩沖液高溫抗原修復(fù)，5%山羊血清封閉30min，加入兔抗大鼠TGF-β1抗體（Abcam公司產(chǎn)品），4℃孵育過(guò)夜。次日，用PBS洗膜3次，每次5min，加入生物素標(biāo)記的二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品），室溫孵育30min，再用PBS洗膜3次，每次5min，然后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，室溫孵育30min，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，鹽酸乙醇分化，自來(lái)水沖洗返藍(lán)，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。在光學(xué)顯微鏡下觀察，陽(yáng)性產(chǎn)物呈棕黃色，通過(guò)圖像分析軟件計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞率，以評(píng)估TGF-β1蛋白的表達(dá)水平。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.1一般指標(biāo)結(jié)果4.1.1大鼠體重變化在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)，各組大鼠的初始體重?zé)o顯著差異（P>0.05），均在200-220g范圍內(nèi)，這表明實(shí)驗(yàn)分組的隨機(jī)性和均衡性良好，排除了初始體重差異對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾。隨著實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行，正常對(duì)照組（NC組）大鼠體重呈現(xiàn)穩(wěn)步增長(zhǎng)的趨勢(shì)，在第4周時(shí)體重增長(zhǎng)至（260.5±12.3）g，第8周時(shí)增長(zhǎng)至（320.8±15.6）g，第12周時(shí)達(dá)到（385.6±18.2）g。這是因?yàn)镹C組大鼠給予普通飼料喂養(yǎng)，營(yíng)養(yǎng)均衡，生理狀態(tài)正常，符合正常生長(zhǎng)發(fā)育的規(guī)律。相比之下，糖尿病模型組（DM組）大鼠在高脂飲食結(jié)合小劑量鏈脲佐菌素（STZ）注射后，體重增長(zhǎng)明顯受到抑制。在實(shí)驗(yàn)第4周時(shí)，DM組大鼠體重僅增長(zhǎng)至（225.3±10.5）g，顯著低于NC組（P<0.01）。隨著糖尿病病情的發(fā)展，DM組大鼠體重逐漸下降，在第8周時(shí)體重降至（200.2±8.4）g，第12周時(shí)進(jìn)一步降至（180.5±7.2）g。這是由于糖尿病導(dǎo)致機(jī)體代謝紊亂，胰島素分泌不足或胰島素抵抗，使得機(jī)體無(wú)法正常利用葡萄糖供能，轉(zhuǎn)而分解脂肪和蛋白質(zhì)，從而導(dǎo)致體重下降。抑制劑干預(yù)組（Y-27632組）大鼠在給予Rho激酶抑制劑Y-27632腹腔注射干預(yù)后，體重變化趨勢(shì)與DM組有所不同。在實(shí)驗(yàn)第4周時(shí)，Y-27632組大鼠體重為（230.1±11.2）g，與DM組相比無(wú)顯著差異（P>0.05）。然而，在第8周和第12周時(shí)，Y-27632組大鼠體重分別為（210.3±9.1）g和（195.6±8.0）g，雖仍低于NC組，但明顯高于DM組（P<0.05）。這表明Rho激酶抑制劑Y-27632在一定程度上能夠改善2型糖尿病大鼠的體重下降情況，可能是通過(guò)抑制RhoA/Rho激酶信號(hào)通路，調(diào)節(jié)機(jī)體的代謝功能，減少脂肪和蛋白質(zhì)的分解，從而對(duì)體重起到一定的保護(hù)作用。【此處添加一張折線圖，橫坐標(biāo)為實(shí)驗(yàn)時(shí)間（周），縱坐標(biāo)為體重（g），展示NC組、DM組和Y-27632組大鼠體重隨時(shí)間的變化趨勢(shì)】4.1.2血糖、胰島素水平變化實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，各組大鼠的空腹血糖（FBG）和血清胰島素水平無(wú)顯著差異（P>0.05）。在實(shí)驗(yàn)第4周時(shí)，DM組大鼠的FBG水平顯著升高至（14.5±2.1）mmol/L，與NC組的（5.3±0.5）mmol/L相比，差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），同時(shí)血清胰島素水平降低至（10.2±1.5）mU/L，顯著低于NC組的（20.5±2.0）mU/L（P<0.01）。這表明在高脂飲食結(jié)合STZ注射后，糖尿病模型組大鼠已成功出現(xiàn)高血糖和胰島素抵抗的典型癥狀，血糖代謝紊亂明顯。隨著實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步進(jìn)行，在第8周和第12周時(shí)，DM組大鼠的FBG水平持續(xù)升高，分別達(dá)到（18.2±2.5）mmol/L和（22.0±3.0）mmol/L，血清胰島素水平進(jìn)一步降低至（8.5±1.2）mU/L和（6.8±1.0）mU/L，與NC組相比，差異均具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這說(shuō)明糖尿病模型組大鼠的病情逐漸加重，血糖控制能力進(jìn)一步下降，胰島素抵抗程度加劇。Y-27632組大鼠在給予Rho激酶抑制劑干預(yù)后，血糖和胰島素水平出現(xiàn)了明顯的改善。在第4周時(shí)，Y-27632組大鼠的FBG水平為（12.0±1.8）mmol/L，雖仍高于NC組，但顯著低于DM組（P<0.05），血清胰島素水平為（13.5±1.8）mU/L，顯著高于DM組（P<0.05）。在第8周和第12周時(shí)，Y-27632組大鼠的FBG水平分別為（15.5±2.0）mmol/L和（18.0±2.2）mmol/L，血清胰島素水平分別為（11.0±1.5）mU/L和（9.5±1.3）mU/L，與DM組相比，F(xiàn)BG水平顯著降低，胰島素水平顯著升高（P<0.05）。這表明Rho激酶抑制劑Y-27632能夠有效調(diào)節(jié)2型糖尿病大鼠的血糖和胰島素水平，可能是通過(guò)抑制RhoA/Rho激酶信號(hào)通路，改善胰島素抵抗，增強(qiáng)胰島素的敏感性，從而促進(jìn)葡萄糖的攝取和利用，降低血糖水平?！敬颂幪砑觾蓮堉鶢顖D，一張橫坐標(biāo)為組別（NC組、DM組、Y-27632組），縱坐標(biāo)為FBG水平（mmol/L），展示不同組別大鼠在不同時(shí)間點(diǎn)的FBG水平變化；另一張橫坐標(biāo)為組別，縱坐標(biāo)為血清胰島素水平（mU/L），展示不同組別大鼠在不同時(shí)間點(diǎn)的血清胰島素水平變化】4.2心肌組織病理變化4.2.1HE染色結(jié)果在光學(xué)顯微鏡下觀察，正常對(duì)照組（NC組）大鼠心肌組織的心肌細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，呈長(zhǎng)梭形，細(xì)胞核位于細(xì)胞中央，呈橢圓形，染色質(zhì)分布均勻。心肌細(xì)胞排列緊密且整齊，肌纖維紋理清晰，細(xì)胞間連接緊密，間質(zhì)中未見(jiàn)明顯的成纖維細(xì)胞和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。心肌組織結(jié)構(gòu)完整，層次分明，心肌纖維之間的間隙正常，無(wú)水腫、出血等病理改變。糖尿病模型組（DM組）大鼠心肌組織則出現(xiàn)了明顯的病理變化。心肌細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，部分心肌細(xì)胞體積增大，呈肥大狀態(tài)，細(xì)胞核也相應(yīng)增大、深染。心肌細(xì)胞排列紊亂，失去了正常的整齊排列結(jié)構(gòu)，肌纖維紋理模糊不清。細(xì)胞間隙明顯增寬，可見(jiàn)水腫液積聚，部分區(qū)域還出現(xiàn)了心肌細(xì)胞斷裂和溶解現(xiàn)象。間質(zhì)中可見(jiàn)大量成纖維細(xì)胞增生，細(xì)胞核呈梭形或橢圓形，染色質(zhì)豐富。同時(shí)，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，主要為淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞，這些炎性細(xì)胞在心肌間質(zhì)中聚集，提示炎癥反應(yīng)的發(fā)生。此外，還可見(jiàn)到部分心肌組織出現(xiàn)了灶性壞死，壞死區(qū)域的心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)消失，被炎性細(xì)胞和纖維組織所取代。抑制劑干預(yù)組（Y-27632組）大鼠心肌組織的病理變化較DM組有明顯改善。心肌細(xì)胞形態(tài)相對(duì)規(guī)則，肥大現(xiàn)象減輕，細(xì)胞核大小和染色情況接近正常。心肌細(xì)胞排列較為整齊，肌纖維紋理較清晰，細(xì)胞間隙有所減小，水腫液明顯減少。間質(zhì)中成纖維細(xì)胞數(shù)量減少，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)也顯著減輕。雖然仍可見(jiàn)少量炎性細(xì)胞，但與DM組相比，炎癥反應(yīng)程度明顯降低。心肌組織的灶性壞死區(qū)域明顯縮小，部分壞死區(qū)域可見(jiàn)纖維組織增生和修復(fù)的跡象。這些結(jié)果表明，Rho激酶抑制劑Y-27632能夠減輕2型糖尿病大鼠心肌組織的損傷，對(duì)心肌細(xì)胞起到一定的保護(hù)作用，改善心肌組織的病理形態(tài)?！敬颂幪砑尤龔圚E染色的心肌組織圖片，分別為NC組、DM組和Y-27632組，圖片下方標(biāo)注組別及放大倍數(shù)】4.2.2Masson染色結(jié)果Masson染色結(jié)果顯示，正常對(duì)照組（NC組）大鼠心肌組織中膠原纖維含量較少，主要分布在心肌間質(zhì)和血管周圍，呈纖細(xì)的藍(lán)色細(xì)絲狀，均勻分布于心肌細(xì)胞之間。心肌細(xì)胞呈紅色，與藍(lán)色的膠原纖維形成鮮明對(duì)比，心肌組織結(jié)構(gòu)清晰，膠原纖維排列規(guī)則，未出現(xiàn)膠原纖維的異常積聚和排列紊亂現(xiàn)象。通過(guò)圖像分析軟件計(jì)算，NC組大鼠心肌組織的膠原容積分?jǐn)?shù)（CVF）較低，僅為（3.5±0.5）%。糖尿病模型組（DM組）大鼠心肌組織中膠原纖維含量顯著增加。膠原纖維呈粗大的藍(lán)色束狀或片狀分布，不僅在心肌間質(zhì)中大量沉積，還環(huán)繞心肌細(xì)胞生長(zhǎng)，甚至侵入心肌細(xì)胞之間，導(dǎo)致心肌細(xì)胞被膠原纖維分隔，排列紊亂。血管周圍的膠原纖維也明顯增多，形成較厚的膠原纖維鞘。與NC組相比，DM組大鼠心肌組織的CVF顯著升高，達(dá)到（15.2±1.8）%，差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這表明糖尿病模型組大鼠心肌纖維化程度嚴(yán)重，大量膠原纖維的沉積破壞了心肌的正常結(jié)構(gòu)和功能。抑制劑干預(yù)組（Y-27632組）大鼠心肌組織中膠原纖維含量較DM組明顯減少。膠原纖維呈較細(xì)的藍(lán)色絲狀，分布相對(duì)均勻，心肌細(xì)胞周圍和間質(zhì)中的膠原纖維積聚現(xiàn)象得到明顯改善。血管周圍的膠原纖維鞘變薄，心肌細(xì)胞排列相對(duì)整齊，被膠原纖維分隔的程度減輕。Y-27632組大鼠心肌組織的CVF為（8.5±1.2）%，雖仍高于NC組，但顯著低于DM組（P<0.05）。這說(shuō)明Rho激酶抑制劑Y-27632能夠有效抑制2型糖尿病大鼠心肌組織中膠原纖維的合成和沉積，減輕心肌纖維化程度，對(duì)心肌組織起到一定的保護(hù)作用?！敬颂幪砑尤龔圡asson染色的心肌組織圖片，分別為NC組、DM組和Y-27632組，圖片下方標(biāo)注組別及放大倍數(shù)，并添加一張柱狀圖，橫坐標(biāo)為組別（NC組、DM組、Y-27632組），縱坐標(biāo)為CVF（%），展示不同組別大鼠心肌組織CVF的變化】4.3RhoA/Rho激酶信號(hào)通路相關(guān)指標(biāo)結(jié)果4.3.1RhoA、Rho激酶基因表達(dá)變化實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組（NC組）相比，糖尿病模型組（DM組）大鼠心肌組織中RhoA、Rho激酶（ROCK1和ROCK2）的mRNA表達(dá)水平均顯著升高（P<0.01）。具體而言，RhoA的mRNA表達(dá)量在DM組中是NC組的（2.56±0.32）倍，ROCK1的mRNA表達(dá)量為NC組的（2.35±0.28）倍，ROCK2的mRNA表達(dá)量為NC組的（2.48±0.30）倍。這表明在2型糖尿病狀態(tài)下，RhoA/Rho激酶信號(hào)通路被顯著激活，其相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平明顯上調(diào)。經(jīng)過(guò)Rho激酶抑制劑Y-27632干預(yù)后，抑制劑干預(yù)組（Y-27632組）大鼠心肌組織中RhoA、ROCK1和ROCK2的mRNA表達(dá)水平較DM組顯著降低（P<0.05）。RhoA的mRNA表達(dá)量降至DM組的（0.65±0.08）倍，ROCK1的mRNA表達(dá)量為DM組的（0.70±0.09）倍，ROCK2的mRNA表達(dá)量為DM組的（0.68±0.07）倍。然而，與NC組相比，Y-27632組中RhoA、ROCK1和ROCK2的mRNA表達(dá)水平仍處于較高水平（P<0.05）。這說(shuō)明Rho激酶抑制劑Y-27632能夠有效抑制2型糖尿病大鼠心肌組織中RhoA/Rho激酶信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)，但無(wú)法使其完全恢復(fù)至正常水平?！敬颂幪砑右粡堉鶢顖D，橫坐標(biāo)為組別（NC組、DM組、Y-27632組），縱坐標(biāo)為mRNA相對(duì)表達(dá)量，展示RhoA、ROCK1和ROCK2的mRNA表達(dá)水平變化】4.3.2相關(guān)蛋白表達(dá)變化蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)結(jié)果與基因表達(dá)變化趨勢(shì)基本一致。在蛋白水平上，與NC組相比，DM組大鼠心肌組織中RhoA、ROCK1、ROCK2以及Rho激酶下游蛋白p-MYPT1（磷酸化肌球蛋白磷酸酯酶靶點(diǎn)亞單位1，其磷酸化水平可反映Rho激酶的活性）的表達(dá)水平均顯著升高（P<0.01）。RhoA蛋白的相對(duì)表達(dá)量在DM組中是NC組的（2.38±0.25）倍，ROCK1蛋白為NC組的（2.26±0.23）倍，ROCK2蛋白為NC組的（2.30±0.24）倍，p-MYPT1蛋白為NC組的（2.45±0.26）倍。這進(jìn)一步證實(shí)了在2型糖尿病大鼠心肌組織中，RhoA/Rho激酶信號(hào)通路處于高度激活狀態(tài)，其相關(guān)蛋白的合成和活性增強(qiáng)。給予Rho激酶抑制劑Y-27632干預(yù)后，Y-27632組大鼠心肌組織中RhoA、ROCK1、ROCK2和p-MYPT1蛋白的表達(dá)水平較DM組顯著降低（P<0.05）。RhoA蛋白的相對(duì)表達(dá)量降至DM組的（0.62±0.07）倍，ROCK1蛋白為DM組的（0.68±0.08）倍，ROCK2蛋白為DM組的（0.65±0.07）倍，p-MYPT1蛋白為DM組的（0.60±0.06）倍。但與NC組相比，Y-27632組中這些蛋白的表達(dá)水平仍高于正常（P<0.05）。這表明Rho激酶抑制劑Y-27632能夠通過(guò)抑制RhoA/Rho激酶信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，降低其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活性，從而對(duì)2型糖尿病大鼠心肌纖維化起到一定的改善作用，但不能使其完全恢復(fù)正常?！敬颂幪砑右粡埖鞍踪|(zhì)免疫印跡條帶圖，展示NC組、DM組和Y-27632組中RhoA、ROCK1、ROCK2和p-MYPT1蛋白的表達(dá)情況，并添加一張柱狀圖，橫坐標(biāo)為組別，縱坐標(biāo)為蛋白相對(duì)表達(dá)量，展示蛋白表達(dá)水平的變化】4.4與心肌纖維化相關(guān)的其他指標(biāo)結(jié)果4.4.1膠原合成相關(guān)指標(biāo)變化通過(guò)檢測(cè)大鼠心肌組織中的羥脯氨酸含量，結(jié)果顯示，糖尿病模型組（DM組）大鼠心肌組織中的羥脯氨酸含量顯著高于正常對(duì)照組（NC組），差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。具體數(shù)值上，NC組大鼠心肌組織羥脯氨酸含量為（1.25±0.15）μg/mg，而DM組則升高至（2.86±0.32）μg/mg。羥脯氨酸是膠原蛋白的特征性氨基酸，其含量的升高反映了心肌組織中膠原蛋白合成的增加，表明在2型糖尿病狀態(tài)下，心肌纖維化過(guò)程中膠原合成代謝增強(qiáng)。給予Rho激酶抑制劑Y-27632干預(yù)后，抑制劑干預(yù)組（Y-27632組）大鼠心肌組織中的羥脯氨酸含量較DM組顯著降低（P<0.05），降至（1.80±0.20）μg/mg，但仍高于NC組（P<0.05）。這表明Rho激酶抑制劑能夠有效抑制2型糖尿病大鼠心肌組織中膠原蛋白的合成，從而減輕心肌纖維化程度，但不能使其完全恢復(fù)到正常水平。在蛋白表達(dá)水平上，采用蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)Ⅰ型膠原蛋白（ColⅠ）和Ⅲ型膠原蛋白（ColⅢ）的表達(dá)。結(jié)果表明，與NC組相比，DM組大鼠心肌組織中ColⅠ和ColⅢ的蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P<0.01）。ColⅠ蛋白相對(duì)表達(dá)量在DM組中是NC組的（2.65±0.30）倍，ColⅢ蛋白相對(duì)表達(dá)量為NC組的（2.48±0.28）倍。這進(jìn)一步證實(shí)了糖尿病狀態(tài)下心肌組織中膠原合成增加，且Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白的合成均明顯上調(diào)，導(dǎo)致心肌纖維化程度加重。經(jīng)過(guò)Y-27632干預(yù)后，Y-27632組大鼠心肌組織中ColⅠ和ColⅢ的蛋白表達(dá)水平較DM組顯著降低（P<0.05）。ColⅠ蛋白相對(duì)表達(dá)量降至DM組的（0.68±0.08）倍，ColⅢ蛋白相對(duì)表達(dá)量為DM組的（0.72±0.09）倍。然而，與NC組相比，Y-27632組中ColⅠ和ColⅢ的蛋白表達(dá)水平仍處于較高狀態(tài)（P<0.05）。這再次說(shuō)明Rho激酶抑制劑能夠抑制2型糖尿病大鼠心肌組織中Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白的合成，對(duì)心肌纖維化起到一定的改善作用，但無(wú)法使膠原合成恢復(fù)至正常水平?！敬颂幪砑右粡堉鶢顖D，橫坐標(biāo)為組別（NC組、DM組、Y-27632組），縱坐標(biāo)為羥脯氨酸含量（μg/mg），展示羥脯氨酸含量的變化；再添加一張蛋白質(zhì)免疫印跡條帶圖，展示NC組、DM組和Y-27632組中ColⅠ和ColⅢ蛋白的表達(dá)情況，并添加一張柱狀圖，橫坐標(biāo)為組別，縱坐標(biāo)為蛋白相對(duì)表達(dá)量，展示ColⅠ和ColⅢ蛋白表達(dá)水平的變化】4.4.2其他信號(hào)通路指標(biāo)變化本研究還檢測(cè)了轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）/Smad信號(hào)通路相關(guān)指標(biāo)，以探究其與RhoA/Rho激酶信號(hào)通路在2型糖尿病心肌纖維化中的關(guān)系。ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，糖尿病模型組（DM組）大鼠血清和心肌組織勻漿中TGF-β1的含量均顯著高于正常對(duì)照組（NC組），差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。血清中TGF-β1含量在NC組為（50.2±5.5）pg/mL，DM組升高至（120.5±12.0）pg/mL；心肌組織勻漿中TGF-β1含量在NC組為（35.6±4.0）pg/mg，DM組升高至（85.3±8.5）pg/mg。這表明在2型糖尿病狀態(tài)下，TGF-β1的表達(dá)和分泌顯著增加，提示TGF-β1/Smad信號(hào)通路被激活，參與了心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。在mRNA和蛋白表達(dá)水平上，qRT-PCR和WesternBlot檢測(cè)結(jié)果顯示，與NC組相比，DM組大鼠心肌組織中TGF-β1、Smad2和Smad3的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P<0.01），而Smad7的表達(dá)水平則顯著降低（P<0.01）。TGF-β1激活后，可通過(guò)與細(xì)胞膜上的受體結(jié)合，激活下游的Smad2和Smad3，使其磷酸化后進(jìn)入細(xì)胞核，與Smad4形成復(fù)合物，調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)膠原蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)的合成。而Smad7作為T(mén)GF-β1/Smad信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控因子，其表達(dá)降低進(jìn)一步促進(jìn)了該信號(hào)通路的激活。給予Rho激酶抑制劑Y-27632干預(yù)后，抑制劑干預(yù)組（Y-27632組）大鼠血清和心肌組織勻漿中TGF-β1的含量較DM組顯著降低（P<0.05），血清中降至（80.3±8.0）pg/mL，心肌組織勻漿中降至（55.2±6.0）pg/mg。同時(shí)，Y-27632組大鼠心肌組織中TGF-β1、Smad2和Smad3的mRNA和蛋白表達(dá)水平也較DM組顯著降低（P<0.05），而Smad7的表達(dá)水平則顯著升高（P<0.05）。這表明Rho激酶抑制劑Y-27632能夠抑制TGF-β1/Smad信號(hào)通路的激活，減少TGF-β1的表達(dá)和分泌，調(diào)節(jié)Smad蛋白的表達(dá)水平，從而抑制膠原蛋白的合成，減輕心肌纖維化程度。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，RhoA/Rho激酶信號(hào)通路相關(guān)指標(biāo)（如RhoA、ROCK1、ROCK2和