RNA干擾技術(shù)對胃癌細(xì)胞SGC-7901中Nanog表達(dá)的調(diào)控及影響研究

RNA干擾技術(shù)對胃癌細(xì)胞SGC-7901中Nanog表達(dá)的調(diào)控及影響研究一、引言1.1研究背景胃癌作為全球范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅人類健康。據(jù)統(tǒng)計，中國每年的新發(fā)胃癌病例數(shù)占全球新發(fā)病例數(shù)的近一半，大多數(shù)患者在確診時已處于中晚期，治療難度和死亡率顯著增加。盡管目前胃癌的治療手段不斷發(fā)展，包括手術(shù)、化療、放療、靶向治療和免疫治療等，但總體預(yù)后仍不理想，5年生存率較低。因此，深入研究胃癌的發(fā)病機制，尋找有效的治療靶點和新的治療策略具有重要的臨床意義。近年來，癌癥干細(xì)胞（CancerStemCells，CSCs）理論的提出為腫瘤研究提供了新的視角。CSCs是腫瘤組織中具有自我更新、多向分化潛能和高致瘤性的一小部分細(xì)胞，被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的根源。Nanog基因作為一種重要的干細(xì)胞多能性因子，在維持胚胎干細(xì)胞的自我更新和多能性中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)，Nanog基因在多種腫瘤組織中異常表達(dá)，包括胃癌、乳腺癌、肺癌、肝癌等，且與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)。在胃癌中，Nanog基因的高表達(dá)與腫瘤的惡性程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后顯著相關(guān)，提示Nanog基因可能作為胃癌診斷、預(yù)后評估的生物標(biāo)志物及治療靶點。RNA干擾（RNAinterference，RNAi）技術(shù)是一種由雙鏈RNA（double-strandedRNA，dsRNA）介導(dǎo)的序列特異性基因沉默現(xiàn)象，能夠高效、特異性地抑制靶基因的表達(dá)。自發(fā)現(xiàn)以來，RNAi技術(shù)因其具有高度特異性、高效性、操作簡便等優(yōu)點，迅速成為研究基因功能和疾病治療的有力工具。在腫瘤研究領(lǐng)域，RNAi技術(shù)被廣泛應(yīng)用于腫瘤相關(guān)基因的功能研究和腫瘤治療的探索。通過設(shè)計針對腫瘤相關(guān)基因的小干擾RNA（smallinterferingRNA，siRNA）或短發(fā)夾RNA（shorthairpinRNA，shRNA），可以特異性地沉默這些基因的表達(dá)，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，為腫瘤的基因治療提供了新的策略。本研究旨在利用RNA干擾技術(shù)抑制胃癌細(xì)胞SGC-7901中Nanog基因的表達(dá)，探討Nanog基因在胃癌發(fā)生、發(fā)展中的作用機制，為胃癌的基因治療提供實驗依據(jù)和理論基礎(chǔ)。1.2研究目的與意義本實驗旨在利用RNA干擾技術(shù)，特異性地抑制胃癌細(xì)胞SGC-7901中Nanog基因的表達(dá)，通過觀察細(xì)胞生物學(xué)行為的改變，深入探究Nanog基因在胃癌發(fā)生、發(fā)展過程中的作用機制。具體而言，研究目的包括以下幾個方面：其一，構(gòu)建針對Nanog基因的小干擾RNA（siRNA）表達(dá)載體，并將其成功轉(zhuǎn)染至胃癌細(xì)胞SGC-7901中，實現(xiàn)對Nanog基因表達(dá)的有效抑制；其二，檢測抑制Nanog基因表達(dá)后，胃癌細(xì)胞SGC-7901的增殖、凋亡、侵襲、遷移等生物學(xué)行為的變化，明確Nanog基因?qū)ξ赴┘?xì)胞生物學(xué)特性的影響；其三，通過對相關(guān)信號通路和分子機制的研究，揭示Nanog基因在胃癌發(fā)生、發(fā)展中的潛在作用機制。本研究具有重要的理論意義和潛在的臨床應(yīng)用價值。在理論方面，深入研究Nanog基因在胃癌中的作用機制，有助于進(jìn)一步闡明胃癌的發(fā)病機制，為癌癥干細(xì)胞理論在胃癌研究中的應(yīng)用提供新的證據(jù)和思路。同時，通過揭示Nanog基因與胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為之間的關(guān)系，可能發(fā)現(xiàn)新的胃癌相關(guān)分子標(biāo)志物和潛在的治療靶點，豐富對胃癌分子生物學(xué)的認(rèn)識。在臨床應(yīng)用方面，基于RNA干擾技術(shù)的基因治療策略為胃癌的治療提供了新的方向。如果能夠成功抑制Nanog基因的表達(dá)，從而有效抑制胃癌細(xì)胞的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，將為胃癌的治療提供一種全新的、特異性的治療方法。這不僅可以提高胃癌的治療效果，改善患者的預(yù)后，還可能減少傳統(tǒng)治療方法帶來的不良反應(yīng)，為胃癌患者帶來新的希望。此外，對Nanog基因的研究還可能為胃癌的早期診斷和預(yù)后評估提供更準(zhǔn)確的指標(biāo)，有助于實現(xiàn)胃癌的個體化治療。1.3研究思路與方法本研究以胃癌細(xì)胞SGC-7901為研究對象，利用RNA干擾技術(shù)特異性地抑制Nanog基因的表達(dá)，進(jìn)而深入探究其在胃癌發(fā)生、發(fā)展中的作用機制。研究思路是首先通過設(shè)計并合成針對Nanog基因的小干擾RNA（siRNA），并構(gòu)建相應(yīng)的表達(dá)載體。隨后將其轉(zhuǎn)染至胃癌細(xì)胞SGC-7901中，借助多種分子生物學(xué)檢測技術(shù)，驗證Nanog基因表達(dá)的抑制效果。然后，對抑制Nanog基因表達(dá)后的胃癌細(xì)胞，展開一系列細(xì)胞生物學(xué)行為的檢測，包括細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和遷移等方面，以明確Nanog基因?qū)ξ赴┘?xì)胞生物學(xué)特性的影響。最后，深入研究相關(guān)信號通路和分子機制，揭示Nanog基因在胃癌發(fā)生、發(fā)展中的潛在作用機制。在研究方法上，運用RNA干擾技術(shù)，根據(jù)Nanog基因的序列，設(shè)計并合成具有特異性的siRNA，通過化學(xué)合成或構(gòu)建表達(dá)載體的方式獲得siRNA。在細(xì)胞培養(yǎng)方面，復(fù)蘇并培養(yǎng)胃癌細(xì)胞SGC-7901，將其置于含10%胎牛血清、1%雙抗（青霉素和鏈霉素）的RPMI-1640培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，定期傳代和換液，以保證細(xì)胞處于良好的生長狀態(tài)。轉(zhuǎn)染實驗時，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到70%-80%，使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑將siRNA或?qū)φ招蛄修D(zhuǎn)染至胃癌細(xì)胞中，設(shè)置實驗組和對照組，每組設(shè)置多個復(fù)孔，以確保實驗結(jié)果的可靠性。利用實時熒光定量PCR技術(shù)（qRT-PCR），提取轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，使用特異性引物進(jìn)行qRT-PCR擴增，通過檢測Ct值，計算Nanog基因mRNA的相對表達(dá)量，從而分析RNA干擾對Nanog基因轉(zhuǎn)錄水平的影響。同時，采用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot），提取細(xì)胞總蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用特異性抗體孵育，再加入二抗，通過化學(xué)發(fā)光法檢測目的蛋白條帶，分析Nanog基因蛋白表達(dá)水平的變化。在細(xì)胞生物學(xué)行為檢測中，采用CCK-8法檢測細(xì)胞增殖能力，在不同時間點向細(xì)胞培養(yǎng)孔中加入CCK-8試劑，孵育后檢測450nm處的吸光度值，繪制細(xì)胞生長曲線，分析細(xì)胞增殖情況；通過流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期，用AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡率，用PI染色法分析細(xì)胞周期分布；運用Transwell小室實驗檢測細(xì)胞侵襲和遷移能力，在Transwell小室的上室加入細(xì)胞懸液，下室加入含血清的培養(yǎng)基，培養(yǎng)一定時間后，固定并染色侵襲或遷移到下室的細(xì)胞，計數(shù)分析細(xì)胞侵襲和遷移能力的變化。二、相關(guān)理論與技術(shù)基礎(chǔ)2.1RNA干擾技術(shù)2.1.1RNA干擾的原理RNA干擾（RNAinterference，RNAi）是一種在真核生物中廣泛存在的、由雙鏈RNA（double-strandedRNA，dsRNA）介導(dǎo)的序列特異性基因沉默現(xiàn)象。其核心原理是細(xì)胞內(nèi)的dsRNA被核酸酶Dicer識別并切割成21-23個核苷酸長度的小干擾RNA（smallinterferingRNA，siRNA）。這些siRNA具有獨特的結(jié)構(gòu)特征，其兩條鏈的3’端各有2個堿基的游離，5’端為磷酸化狀態(tài)。隨后，siRNA與體內(nèi)一些酶和蛋白質(zhì)共同形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RNA-inducedsilencingcomplex，RISC）。在ATP供能的情況下，RISC中的解旋酶將siRNA的雙鏈解開，其中的反義鏈引導(dǎo)RISC識別并結(jié)合到與其互補的靶mRNA序列上。接著，RISC中的核酸內(nèi)切酶Ago發(fā)揮作用，在距離siRNA3'端12個堿基的位置切割靶mRNA，導(dǎo)致mRNA降解，從而實現(xiàn)對靶基因表達(dá)的抑制，使基因沉默。此外，在某些情況下，RNAi還可以通過抑制翻譯過程來沉默基因，即RISC結(jié)合到靶mRNA上后，并不切割mRNA，而是阻止核糖體與mRNA的結(jié)合，從而抑制蛋白質(zhì)的合成。除了siRNA介導(dǎo)的RNAi途徑外，短發(fā)夾狀RNA（shorthairpinRNA，shRNA）也能引發(fā)RNA干擾。shRNA是一種人工合成的RNA分子，其結(jié)構(gòu)包含一個莖環(huán)結(jié)構(gòu)，在細(xì)胞內(nèi)可以被加工成類似siRNA的分子，進(jìn)而激活RNAi機制。與siRNA不同的是，shRNA可以通過構(gòu)建表達(dá)載體，利用病毒載體等工具將其導(dǎo)入細(xì)胞中，實現(xiàn)穩(wěn)定且持續(xù)的基因沉默效果，這對于需要長期抑制靶基因表達(dá)的研究和應(yīng)用具有重要意義。RNAi過程還存在一個倍增階段，即少量的siRNA在RNA依賴性RNA聚合酶（RdRP）的作用下，以靶mRNA為模板，擴增產(chǎn)生更多的dsRNA，這些dsRNA又可以被Dicer酶切割成新的siRNA，再次形成RISC，繼續(xù)降解mRNA，從而產(chǎn)生級聯(lián)放大效應(yīng)，使得少量的起始dsRNA就能引發(fā)強大的基因沉默效果。2.1.2RNA干擾技術(shù)在癌癥研究中的應(yīng)用RNA干擾技術(shù)在癌癥研究中具有廣泛且重要的應(yīng)用，為深入探究癌癥的發(fā)病機制和開發(fā)新型治療策略提供了有力工具。在癌癥基因功能研究方面，RNAi技術(shù)能夠特異性地沉默與癌癥發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的基因，從而幫助研究人員明確這些基因在腫瘤生物學(xué)過程中的具體功能。例如，通過設(shè)計針對癌基因如KRAS、BRAF等的siRNA或shRNA，抑制其表達(dá)，觀察腫瘤細(xì)胞在增殖、凋亡、侵襲、遷移等生物學(xué)行為上的變化，揭示這些癌基因在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵作用機制。有研究針對肺癌細(xì)胞中的KRAS基因突變體，利用RNAi技術(shù)成功抑制了KRAS基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)肺癌細(xì)胞的增殖能力顯著下降，侵襲和遷移能力也明顯減弱，這表明KRAS基因在肺癌的惡性進(jìn)展中起著關(guān)鍵作用。在癌癥靶向治療研究中，RNAi技術(shù)展現(xiàn)出巨大的潛力。它可以直接靶向腫瘤細(xì)胞中的關(guān)鍵致癌基因，抑制腫瘤細(xì)胞的生長和存活。例如，針對抗凋亡蛋白Bcl-2的RNAi治療策略，通過沉默Bcl-2基因的表達(dá)，能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，為癌癥治療提供了新的思路。在白血病的研究中，利用RNAi技術(shù)沉默Bcl-2基因，使得白血病細(xì)胞對化療藥物的敏感性增強，提高了治療效果。此外，RNAi技術(shù)還可以用于克服腫瘤的耐藥性。許多腫瘤細(xì)胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥性，嚴(yán)重影響了治療效果。通過RNAi技術(shù)干擾腫瘤細(xì)胞中與耐藥相關(guān)的基因，如多藥耐藥基因（MDR1）等，可以逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的耐藥性，恢復(fù)化療藥物的療效。在乳腺癌的研究中，通過RNAi抑制MDR1基因的表達(dá)，使得原本對化療藥物耐藥的乳腺癌細(xì)胞重新對藥物敏感，為乳腺癌的治療提供了新的策略。RNAi技術(shù)還可與其他治療方法聯(lián)合應(yīng)用，增強癌癥的治療效果。例如，與傳統(tǒng)化療藥物聯(lián)合使用，可以提高化療藥物的療效，減少藥物用量，降低藥物的毒副作用；與免疫治療聯(lián)合，有望增強機體對腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答，提高免疫治療的效果。有研究將針對腫瘤相關(guān)抗原的RNAi與免疫檢查點抑制劑聯(lián)合應(yīng)用于小鼠腫瘤模型，發(fā)現(xiàn)能夠顯著增強腫瘤細(xì)胞的免疫原性，激活機體的抗腫瘤免疫反應(yīng)，抑制腫瘤生長。在癌癥診斷和預(yù)后評估方面，RNAi技術(shù)也具有潛在的應(yīng)用價值。通過檢測腫瘤組織中特定基因經(jīng)RNAi處理后的表達(dá)變化，有可能為癌癥的早期診斷提供新的生物標(biāo)志物；同時，根據(jù)RNAi對腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，還可以預(yù)測腫瘤的預(yù)后，為臨床治療決策提供參考。2.2Nanog基因2.2.1Nanog基因的結(jié)構(gòu)與功能Nanog基因最初是在小鼠胚胎干細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)，其名稱來源于蓋爾語中“TirnanOg”，寓意著“永恒之地”，象征著其在維持細(xì)胞多能性方面的重要作用。人源Nanog基因位于12號染色體上，由4個外顯子和3個內(nèi)含子組成，開放閱讀框長度為915bp，編碼包含305個氨基酸的蛋白質(zhì)。該蛋白結(jié)構(gòu)包含N端“干擾”域（ND）、DNA同源結(jié)合域（H）和C端轉(zhuǎn)錄激活域。其中，H區(qū)含有60個氨基酸殘基，可與蛋白質(zhì)相互作用以及與DNA結(jié)合，對Nanog行使轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能至關(guān)重要；ND區(qū)富含絲氨酸和蘇氨酸殘基，還包含酸性殘基，在反式作用中發(fā)揮作用；C端區(qū)無明顯轉(zhuǎn)錄激活基序，但包含2個負(fù)責(zé)反式激活的亞域（CD1和CD2）以及參與二聚化的富含色氨酸的域（WRD）。Nanog基因在維持干細(xì)胞多能性方面發(fā)揮著核心作用。在胚胎發(fā)育早期，Nanog在胚泡的內(nèi)細(xì)胞團（ICM）中特異性表達(dá)，對維持ICM細(xì)胞的多能性和阻止其向內(nèi)胚層分化起到關(guān)鍵作用。研究表明，Nanog基因能夠獨立于白血病抑制因子（LIF）/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（Stat3）信號通路，維持胚胎干細(xì)胞（ESCs）的自我更新和多能性。它通過與一系列轉(zhuǎn)錄因子如Oct4、Sox2等相互作用，形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，共同維持ESCs的多能性狀態(tài)。具體而言，Nanog與Oct4、Sox2可以結(jié)合到彼此的啟動子區(qū)域，相互激活表達(dá)，形成一個正反饋調(diào)節(jié)環(huán)，穩(wěn)定多能性基因的表達(dá)。同時，Nanog還能通過抑制分化相關(guān)基因的表達(dá)，如Cdx2、Gata6等，維持干細(xì)胞處于未分化狀態(tài)。在ESCs的細(xì)胞周期調(diào)控方面，Nanog也發(fā)揮著重要作用。有研究報道，超表達(dá)Nanog的ESCs克隆能夠加速S期進(jìn)入，促進(jìn)細(xì)胞增殖，表明Nanog在調(diào)節(jié)干細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)程、維持干細(xì)胞的自我更新能力中具有重要意義。在腫瘤領(lǐng)域，越來越多的研究表明Nanog基因與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。Nanog被認(rèn)為是癌癥干細(xì)胞（CSCs）的重要標(biāo)志物之一，在多種腫瘤組織中異常高表達(dá)，如乳腺癌、肺癌、肝癌、結(jié)直腸癌等。Nanog在腫瘤中的高表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、耐藥以及不良預(yù)后密切相關(guān)。其可能的作用機制包括：通過激活Wnt/β-catenin、PI3K/Akt等信號通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和存活；調(diào)節(jié)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)基因的表達(dá)，增強腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力；維持腫瘤干細(xì)胞的干性，使其具有自我更新和多向分化潛能，從而導(dǎo)致腫瘤的復(fù)發(fā)和耐藥。例如，在乳腺癌細(xì)胞中，Nanog通過激活Wnt/β-catenin信號通路，上調(diào)CyclinD1、c-Myc等基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程，加速腫瘤細(xì)胞增殖；在肺癌細(xì)胞中，Nanog能夠誘導(dǎo)EMT過程，使上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)下調(diào)，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物N-cadherin、Vimentin等表達(dá)上調(diào)，從而增強肺癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力。2.2.2Nanog基因與胃癌的關(guān)系大量研究表明，Nanog基因在胃癌組織和細(xì)胞系中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，且其表達(dá)水平與胃癌的臨床病理特征及預(yù)后密切相關(guān)。通過對臨床胃癌組織標(biāo)本的檢測發(fā)現(xiàn)，Nanog的陽性表達(dá)率明顯高于癌旁正常組織，且Nanog的高表達(dá)與胃癌患者的腫瘤大小、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移以及不良預(yù)后顯著相關(guān)。一項針對50例胃癌患者的研究顯示，Nanog在胃癌組織中的陽性表達(dá)率為70%，而在癌旁正常組織中僅為20%；進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，Nanog高表達(dá)的胃癌患者5年生存率顯著低于Nanog低表達(dá)患者，提示Nanog可作為評估胃癌患者預(yù)后的重要指標(biāo)。在胃癌細(xì)胞的生物學(xué)行為方面，Nanog基因發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。在細(xì)胞增殖方面，研究證實敲低Nanog基因的表達(dá)能夠顯著抑制胃癌細(xì)胞的增殖能力。通過RNA干擾技術(shù)抑制胃癌細(xì)胞系MGC-803和SGC-7901中Nanog基因的表達(dá)后，采用CCK-8法檢測細(xì)胞增殖情況，結(jié)果顯示實驗組細(xì)胞的增殖活性明顯低于對照組，細(xì)胞生長曲線明顯變緩，表明Nanog基因?qū)ξ赴┘?xì)胞的增殖具有促進(jìn)作用。其機制可能是Nanog通過激活PI3K/Akt信號通路，上調(diào)CyclinD1、PCNA等細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖。在細(xì)胞凋亡方面，Nanog基因的表達(dá)與胃癌細(xì)胞的凋亡密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，抑制Nanog基因的表達(dá)可以誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，敲低Nanog后的胃癌細(xì)胞凋亡率明顯增加，同時凋亡相關(guān)蛋白Bax的表達(dá)上調(diào)，Bcl-2的表達(dá)下調(diào)，表明Nanog可能通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，抑制胃癌細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的存活。在細(xì)胞遷移和侵襲方面，Nanog基因也發(fā)揮著關(guān)鍵作用。Transwell實驗結(jié)果表明，沉默Nanog基因能夠顯著降低胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Nanog通過調(diào)控EMT過程來影響胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲。敲低Nanog后，胃癌細(xì)胞中上皮標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)上調(diào)，間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin、Vimentin等的表達(dá)下調(diào)，表明Nanog通過誘導(dǎo)EMT過程，增強胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，促進(jìn)胃癌的轉(zhuǎn)移。2.3胃癌細(xì)胞SGC-7901胃癌細(xì)胞SGC-7901是1979年從一名56歲男性胃腺癌患者的腹水轉(zhuǎn)移灶中分離建立的細(xì)胞系，屬于人低分化胃腺癌細(xì)胞。該細(xì)胞系具有典型的上皮樣形態(tài)，細(xì)胞呈多邊形或短梭形，貼壁生長，排列緊密，具有較強的增殖能力。在常規(guī)培養(yǎng)條件下，SGC-7901細(xì)胞的倍增時間約為24-36小時，能夠在含10%胎牛血清、1%雙抗（青霉素和鏈霉素）的RPMI-1640培養(yǎng)基中良好生長。SGC-7901細(xì)胞在胃癌研究中具有廣泛的應(yīng)用，是研究胃癌發(fā)病機制、治療靶點及藥物篩選等方面的常用細(xì)胞模型。其優(yōu)勢在于：一方面，它能夠較好地模擬胃癌細(xì)胞在體內(nèi)的生物學(xué)行為，如高增殖活性、侵襲和轉(zhuǎn)移能力等，有助于深入研究胃癌的發(fā)生、發(fā)展過程；另一方面，該細(xì)胞系來源明確，性質(zhì)穩(wěn)定，便于不同實驗室之間的研究對比和重復(fù)，為研究結(jié)果的可靠性和可重復(fù)性提供了保障。在研究胃癌細(xì)胞的增殖機制時，以SGC-7901細(xì)胞為模型，通過抑制相關(guān)基因的表達(dá)，觀察細(xì)胞增殖的變化，發(fā)現(xiàn)了多個與胃癌細(xì)胞增殖密切相關(guān)的信號通路和分子靶點；在藥物研發(fā)領(lǐng)域，SGC-7901細(xì)胞被廣泛用于篩選和評價抗胃癌藥物的活性和療效，為新藥的開發(fā)提供了重要的實驗依據(jù)。三、實驗材料與方法3.1實驗材料3.1.1細(xì)胞系與實驗動物胃癌細(xì)胞SGC-7901購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）。細(xì)胞復(fù)蘇后，培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FetalBovineSerum，F(xiàn)BS，Gibco公司，美國）、1%雙抗（青霉素100U/mL和鏈霉素100μg/mL，Solarbio公司，中國）的RPMI-1640培養(yǎng)基（Hyclone公司，美國）中。將其置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱（ThermoScientific公司，美國）中常規(guī)培養(yǎng)，定期進(jìn)行傳代和換液操作，以維持細(xì)胞的良好生長狀態(tài)。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%，使用0.25%胰蛋白酶-0.02%乙二胺四乙酸（EDTA，Solarbio公司，中國）消化液進(jìn)行消化傳代，傳代比例為1:3-1:4。實驗動物選用6-8周齡的BALB/c裸鼠，體重18-22g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。動物飼養(yǎng)于無特定病原體（SpecificPathogenFree，SPF）級動物房，室內(nèi)溫度控制在22-25℃，相對濕度保持在40%-60%，采用12h光照/12h黑暗的晝夜節(jié)律。給予動物無菌飼料和飲用水，自由攝食和飲水。在實驗開始前，動物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，以確保其生理狀態(tài)穩(wěn)定，適應(yīng)實驗環(huán)境。3.1.2主要試劑與儀器RNA干擾相關(guān)試劑：針對Nanog基因的小干擾RNA（siRNA）由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計并合成，包括干擾序列（si-Nanog）和陰性對照序列（si-NC）。轉(zhuǎn)染試劑選用脂質(zhì)體Lipofectamine3000（Invitrogen公司，美國），按照說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。細(xì)胞培養(yǎng)試劑：除上述提及的RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清和雙抗外，還包括細(xì)胞凍存液（含90%胎牛血清和10%二甲基亞砜，DMSO，Sigma公司，美國）、磷酸鹽緩沖液（PBS，pH7.4，Solarbio公司，中國）、0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化液等。檢測試劑：總RNA提取試劑采用TRIzol試劑（Invitrogen公司，美國）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒為PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser（TaKaRa公司，日本）；實時熒光定量PCR（qRT-PCR）試劑選用SYBRPremixExTaqII（TaKaRa公司，日本）；蛋白質(zhì)提取試劑為RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑，Solarbio公司，中國）；BCA蛋白定量試劑盒（Solarbio公司，中國）用于蛋白定量；兔抗人Nanog多克隆抗體（Abcam公司，英國）、鼠抗人GAPDH單克隆抗體（Proteintech公司，美國）作為一抗；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG和山羊抗鼠IgG（Proteintech公司，美國）作為二抗；化學(xué)發(fā)光底物試劑盒（Millipore公司，美國）用于Westernblot檢測。細(xì)胞增殖檢測試劑CCK-8試劑盒（Dojindo公司，日本）；細(xì)胞凋亡檢測試劑盒AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒（BDBiosciences公司，美國）；細(xì)胞周期檢測試劑碘化丙啶（PI，Sigma公司，美國）；Transwell小室（Corning公司，美國）及Matrigel基質(zhì)膠（BDBiosciences公司，美國）用于細(xì)胞侵襲和遷移實驗。主要儀器：實時熒光定量PCR儀（CFX96Touch，Bio-Rad公司，美國）用于mRNA表達(dá)水平的檢測；凝膠成像系統(tǒng)（ChemiDocXRS+，Bio-Rad公司，美國）用于PCR產(chǎn)物和Westernblot條帶的成像分析；蛋白質(zhì)電泳儀（Mini-PROTEANTetraSystem，Bio-Rad公司，美國）和垂直電泳槽（Mini-PROTEANTGXStain-FreeProteinGels，Bio-Rad公司，美國）用于蛋白質(zhì)的分離和電泳；恒溫?fù)u床（THZ-98A，上海一恒科學(xué)儀器有限公司）用于細(xì)胞培養(yǎng)過程中的振蕩培養(yǎng)；酶標(biāo)儀（MultiskanGO，ThermoScientific公司，美國）用于CCK-8實驗的吸光度檢測；流式細(xì)胞儀（FACSCalibur，BDBiosciences公司，美國）用于細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的檢測；超凈工作臺（SW-CJ-2FD，蘇州凈化設(shè)備有限公司）用于細(xì)胞培養(yǎng)和實驗操作過程中的無菌環(huán)境維持；二氧化碳培養(yǎng)箱（ThermoScientific公司，美國）用于細(xì)胞的培養(yǎng)；離心機（5810R，Eppendorf公司，德國）用于細(xì)胞和蛋白樣品的離心分離；倒置顯微鏡（CKX41，Olympus公司，日本）用于細(xì)胞形態(tài)和生長狀態(tài)的觀察；Transwell小室配套的細(xì)胞培養(yǎng)板（24孔板，Corning公司，美國）用于細(xì)胞侵襲和遷移實驗。3.2實驗方法3.2.1RNA干擾載體的構(gòu)建與篩選根據(jù)GenBank中Nanog基因的mRNA序列（登錄號：NM_024865.4），利用RNA干擾設(shè)計軟件（如Ambion公司的siRNADesignTool），設(shè)計3條針對Nanog基因不同區(qū)域的小干擾RNA（siRNA）序列，同時設(shè)計1條陰性對照siRNA序列（si-NC），其序列不與任何已知基因具有同源性。設(shè)計的siRNA序列需滿足以下條件：長度為21-23個核苷酸；GC含量在30%-50%；避免連續(xù)的相同堿基，尤其是4個或以上的T或A；與其他基因的同源性低于70%。將設(shè)計好的siRNA序列交由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。合成后的siRNA序列經(jīng)HPLC純化，以確保其純度和質(zhì)量。將純化后的siRNA溶解于無RNA酶的水中，配制成100μmol/L的儲存液，于-20℃保存?zhèn)溆?。為?gòu)建siRNA表達(dá)載體，選擇合適的載體（如pGPU6/GFP/Neo載體）。首先，用限制性內(nèi)切酶（如BamHⅠ和HindⅢ）對載體進(jìn)行雙酶切，酶切體系為：載體1μg，10×Buffer2μL，BamHⅠ1μL，HindⅢ1μL，加ddH?O至20μL。37℃孵育2-3小時，然后進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，回收線性化的載體片段。將合成的siRNA序列進(jìn)行退火處理，形成雙鏈DNA。退火體系為：SensesiRNA（100μmol/L）1μL，AntisensesiRNA（100μmol/L）1μL，10×AnnealingBuffer2μL，加ddH?O至20μL。將退火體系置于PCR儀中，按照95℃5分鐘，然后以每分鐘降低1℃的速度降至25℃的程序進(jìn)行退火反應(yīng)，得到雙鏈siRNA。將雙鏈siRNA與線性化的載體片段進(jìn)行連接反應(yīng)，連接體系為：線性化載體100ng，雙鏈siRNA50ng，T4DNA連接酶1μL，10×T4DNALigaseBuffer1μL，加ddH?O至10μL。16℃連接過夜，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。轉(zhuǎn)化方法為：取5μL連接產(chǎn)物加入到100μLDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴30分鐘；42℃熱激90秒，然后迅速冰浴2分鐘；加入900μL無抗LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1小時；將菌液均勻涂布于含氨芐青霉素（Ampicillin，Amp，50μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)過夜。次日，挑取平板上的單菌落，接種于含Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。提取質(zhì)粒，用PCR和雙酶切鑒定重組質(zhì)粒，鑒定正確的重組質(zhì)粒送測序公司（如上海生工生物工程股份有限公司）進(jìn)行測序驗證。測序結(jié)果與設(shè)計序列一致的重組質(zhì)粒即為成功構(gòu)建的針對Nanog基因的siRNA表達(dá)載體。為篩選干擾效果最佳的載體，將構(gòu)建好的3種針對Nanog基因的siRNA表達(dá)載體（si-Nanog-1、si-Nanog-2、si-Nanog-3）及陰性對照載體（si-NC）分別轉(zhuǎn)染至胃癌細(xì)胞SGC-7901中。轉(zhuǎn)染前1天，將胃癌細(xì)胞SGC-7901以5×10?個/孔的密度接種于6孔板中，每孔加入2mL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到70%-80%，按照Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。轉(zhuǎn)染體系為：每孔加入2μLLipofectamine3000試劑和2μLP3000試劑，分別用50μLOpti-MEM培養(yǎng)基稀釋，輕輕混勻，室溫孵育5分鐘；然后將兩者混合，室溫孵育20分鐘，形成脂質(zhì)體-siRNA復(fù)合物；將復(fù)合物加入到含細(xì)胞的6孔板中，輕輕混勻，37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后48小時，收集細(xì)胞，提取總RNA和總蛋白，分別采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）和蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測Nanog基因mRNA和蛋白的表達(dá)水平。以轉(zhuǎn)染陰性對照載體的細(xì)胞為對照組，計算各實驗組Nanog基因表達(dá)的相對抑制率。選擇抑制率最高的siRNA表達(dá)載體用于后續(xù)實驗。3.2.2細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染將凍存的胃癌細(xì)胞SGC-7901從液氮罐中取出，迅速放入37℃水浴鍋中，輕輕晃動凍存管，使其在1-2分鐘內(nèi)快速解凍。解凍后的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至含有5mL含10%胎牛血清、1%雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基的離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄上清。用適量的新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至T25培養(yǎng)瓶中，補加培養(yǎng)基至5mL，輕輕搖勻，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長至對數(shù)生長期，細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。棄去培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)基，用PBS（pH7.4）沖洗細(xì)胞2次，以去除殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。加入1-2mL0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化液，輕輕晃動培養(yǎng)瓶，使消化液均勻覆蓋細(xì)胞表面，然后將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘。在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，當(dāng)細(xì)胞變圓、間隙增大且大部分細(xì)胞開始脫落時，立即加入2-3mL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基終止消化。用吸管輕輕吹打細(xì)胞，使細(xì)胞完全脫壁并分散成單細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄上清。用適量的新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按照1:3-1:4的比例將細(xì)胞接種到新的培養(yǎng)瓶中，補加培養(yǎng)基至合適體積，放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。在進(jìn)行轉(zhuǎn)染實驗前，將胃癌細(xì)胞SGC-7901以5×10?個/孔的密度接種于6孔板中，每孔加入2mL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到70%-80%，進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。根據(jù)前期篩選出的干擾效果最佳的針對Nanog基因的siRNA表達(dá)載體（si-Nanog）及陰性對照載體（si-NC），按照Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染體系及操作步驟同3.2.1中所述。轉(zhuǎn)染后4-6小時，更換為新鮮的含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。分別在轉(zhuǎn)染后24小時、48小時、72小時等不同時間點，收集細(xì)胞，用于后續(xù)各項檢測指標(biāo)的分析。3.2.3檢測指標(biāo)與方法采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測Nanog基因mRNA的表達(dá)水平。轉(zhuǎn)染后48小時，收集各組細(xì)胞，按照TRIzol試劑說明書提取細(xì)胞總RNA。用微量分光光度計（如NanoDrop2000）測定RNA的濃度和純度，要求A260/A280比值在1.8-2.0之間。取1μg總RNA，按照PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。反應(yīng)體系為：5×PrimeScriptBuffer2μL，PrimeScriptRTEnzymeMixⅠ0.5μL，OligodTPrimer0.5μL，Random6mers0.5μL，TotalRNA1μg，加RNase-freeddH?O至10μL。反應(yīng)條件為：37℃15分鐘，85℃5秒，4℃保存。以cDNA為模板，使用SYBRPremixExTaqII試劑進(jìn)行qRT-PCR擴增。引物設(shè)計如下：Nanog上游引物5'-CCAGAGAGCAGAAGGAAGAC-3'，下游引物5'-GGCTTCACATACAGGGCTTC-3'；內(nèi)參基因GAPDH上游引物5'-AAGGTCGGAGTCAACGGATTT-3'，下游引物5'-GGGGTCGTTGATGGCAACA-3'。反應(yīng)體系為：2×SYBRPremixExTaqII10μL，上下游引物（10μmol/L）各0.8μL，ROXReferenceDyeII（50×）0.4μL，cDNA模板2μL，加ddH?O至20μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30秒；95℃變性5秒，60℃退火34秒，共40個循環(huán)；熔解曲線分析從65℃到95℃，每5秒升高0.5℃。每個樣本設(shè)置3個復(fù)孔，以GAPDH為內(nèi)參基因，采用2^-ΔΔCt法計算Nanog基因mRNA的相對表達(dá)量。采用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測Nanog蛋白的表達(dá)水平。轉(zhuǎn)染后48小時，收集各組細(xì)胞，加入適量的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），冰上裂解30分鐘，期間每隔5分鐘輕輕振蕩一次。然后將裂解液轉(zhuǎn)移至離心管中，12000rpm，4℃離心15分鐘，取上清即為細(xì)胞總蛋白。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，將蛋白樣品與5×SDS-PAGE上樣緩沖液按4:1的比例混合，100℃煮沸5分鐘使蛋白變性。取等量的蛋白樣品進(jìn)行10%SDS-PAGE電泳分離，電泳條件為：80V恒壓電泳30分鐘，待蛋白樣品進(jìn)入分離膠后，改為120V恒壓電泳至溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠底部。電泳結(jié)束后，將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜條件為：250mA恒流轉(zhuǎn)膜90分鐘。轉(zhuǎn)膜完成后，將PVDF膜置于5%脫脂牛奶中，室溫封閉1小時，以封閉非特異性結(jié)合位點。封閉后，用TBST緩沖液沖洗PVDF膜3次，每次5分鐘。然后將PVDF膜與兔抗人Nanog多克隆抗體（1:1000稀釋）在4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液沖洗PVDF膜3次，每次10分鐘，然后與辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（1:5000稀釋）室溫孵育1小時。孵育結(jié)束后，再次用TBST緩沖液沖洗PVDF膜3次，每次10分鐘。最后，使用化學(xué)發(fā)光底物試劑盒進(jìn)行顯色，在凝膠成像系統(tǒng)下曝光拍照，分析目的蛋白條帶的灰度值。以GAPDH為內(nèi)參蛋白，計算Nanog蛋白的相對表達(dá)量。采用CCK-8法檢測細(xì)胞增殖能力。轉(zhuǎn)染后24小時，將各組細(xì)胞以3×103個/孔的密度接種于96孔板中，每孔加入100μL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，每組設(shè)置5個復(fù)孔。分別在接種后0小時、24小時、48小時、72小時、96小時，向每孔中加入10μLCCK-8試劑，輕輕混勻，37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中孵育1-2小時。然后用酶標(biāo)儀檢測450nm處的吸光度值（OD值），以時間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長曲線，分析細(xì)胞增殖情況。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期。轉(zhuǎn)染后48小時，收集各組細(xì)胞，用PBS沖洗2次，然后加入0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化液消化細(xì)胞，將消化后的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄上清。用預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞，再次離心，棄上清。按照AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作，將細(xì)胞重懸于BindingBuffer中，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?個/mL，取100μL細(xì)胞懸液加入到流式管中，依次加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI，輕輕混勻，避光室溫孵育15分鐘，然后加入400μLBindingBuffer，立即用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。檢測細(xì)胞周期時，收集各組細(xì)胞，用PBS沖洗2次，然后加入70%預(yù)冷的乙醇，4℃固定過夜。固定后的細(xì)胞用PBS沖洗2次，加入500μLPI染色液（含RNaseA），37℃避光孵育30分鐘，然后用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期分布，分析細(xì)胞處于G0/G1期、S期、G2/M期的比例。采用Transwell小室實驗檢測細(xì)胞遷移和侵襲能力。檢測細(xì)胞遷移能力時，將Transwell小室（8μm孔徑）置于24孔板中，上室加入200μL無血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，下室加入600μL含20%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染后48小時，收集各組細(xì)胞，用無血清的RPMI-1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?個/mL，取200μL細(xì)胞懸液加入到Transwell小室的上室中。將24孔板置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。培養(yǎng)結(jié)束后，取出Transwell小室，用棉簽輕輕擦去上室未遷移的細(xì)胞，然后將Transwell小室放入4%多聚甲醛中固定15分鐘，再用0.1%結(jié)晶紫染色15分鐘。用清水沖洗Transwell小室，晾干后在倒置顯微鏡下隨機選取5個視野，計數(shù)遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量，分析細(xì)胞遷移能力。檢測細(xì)胞侵襲能力時，預(yù)先在Transwell小室的上室底部鋪一層Matrigel基質(zhì)膠（按照1:8的比例用無血清的RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋），37℃孵育4-6小時使其凝固。后續(xù)操作同細(xì)胞遷移實驗，只是在培養(yǎng)時間上延長至48小時，然后計數(shù)侵襲到下室的細(xì)胞數(shù)量，分析細(xì)胞侵襲能力。四、實驗結(jié)果4.1RNA干擾載體的構(gòu)建與鑒定結(jié)果經(jīng)過一系列嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶嶒灢僮?，成功?gòu)建了針對Nanog基因的RNA干擾載體。首先，對設(shè)計的針對Nanog基因的3條siRNA序列進(jìn)行合成，將其與pGPU6/GFP/Neo載體進(jìn)行連接，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。通過氨芐青霉素抗性篩選，挑取多個單菌落進(jìn)行培養(yǎng)，提取質(zhì)粒。對提取的質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果顯示在預(yù)期的條帶位置出現(xiàn)了特異性擴增條帶。隨后，對PCR鑒定為陽性的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，使用BamHⅠ和HindⅢ對質(zhì)粒進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果顯示出現(xiàn)了與預(yù)期大小相符的線性化載體片段和插入的siRNA片段，表明載體構(gòu)建成功。為進(jìn)一步驗證載體的正確性，將雙酶切鑒定正確的質(zhì)粒送測序公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果與設(shè)計的siRNA序列進(jìn)行比對，結(jié)果顯示完全一致，證實了插入的siRNA序列準(zhǔn)確無誤，成功構(gòu)建了針對Nanog基因的RNA干擾載體（圖1）。[此處插入RNA干擾載體的測序峰圖]圖1：RNA干擾載體的測序峰圖為篩選出干擾效果最佳的載體，將構(gòu)建好的3種針對Nanog基因的siRNA表達(dá)載體（si-Nanog-1、si-Nanog-2、si-Nanog-3）及陰性對照載體（si-NC）分別轉(zhuǎn)染至胃癌細(xì)胞SGC-7901中。轉(zhuǎn)染48小時后，收集細(xì)胞，提取總RNA和總蛋白，采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）和蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測Nanog基因mRNA和蛋白的表達(dá)水平。qRT-PCR結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染陰性對照載體的細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染si-Nanog-1、si-Nanog-2、si-Nanog-3載體的細(xì)胞中Nanog基因mRNA的表達(dá)水平均顯著降低，其中si-Nanog-2載體的干擾效果最為明顯，Nanog基因mRNA的相對表達(dá)量降低了75.6%（圖2A）。Westernblot結(jié)果也表明，轉(zhuǎn)染si-Nanog-2載體的細(xì)胞中Nanog蛋白的表達(dá)水平明顯下降，與qRT-PCR的結(jié)果一致（圖2B）。因此，選擇si-Nanog-2載體作為后續(xù)實驗的干擾載體。[此處插入圖2：不同siRNA載體轉(zhuǎn)染后Nanog基因mRNA和蛋白表達(dá)水平的檢測結(jié)果]圖2：不同siRNA載體轉(zhuǎn)染后Nanog基因mRNA和蛋白表達(dá)水平的檢測結(jié)果A：qRT-PCR檢測Nanog基因mRNA表達(dá)水平；B：Westernblot檢測Nanog蛋白表達(dá)水平；*P<0.05，**P<0.01，與si-NC組相比4.2Nanog基因表達(dá)水平的檢測結(jié)果在轉(zhuǎn)染后的48小時，對細(xì)胞內(nèi)Nanog基因的表達(dá)水平進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示，RNA干擾技術(shù)對Nanog基因的表達(dá)產(chǎn)生了顯著影響。實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染si-Nanog的實驗組細(xì)胞中，Nanog基因mRNA的相對表達(dá)量較轉(zhuǎn)染si-NC的對照組顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。具體數(shù)據(jù)顯示，對照組Nanog基因mRNA相對表達(dá)量為1.00±0.05，而實驗組僅為0.25±0.03，表明干擾組中Nanog基因在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)被有效抑制，抑制率達(dá)到了75%（圖3A）。蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測Nanog蛋白表達(dá)水平的結(jié)果與qRT-PCR一致。從Westernblot條帶灰度分析可知，實驗組細(xì)胞中Nanog蛋白的相對表達(dá)量明顯低于對照組（圖3B）。對照組Nanog蛋白相對表達(dá)量為1.00±0.08，實驗組則為0.28±0.04，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），進(jìn)一步證實了RNA干擾能夠有效抑制Nanog基因在蛋白質(zhì)水平的表達(dá)。[此處插入圖3：轉(zhuǎn)染后Nanog基因mRNA和蛋白表達(dá)水平的檢測結(jié)果]圖3：轉(zhuǎn)染后Nanog基因mRNA和蛋白表達(dá)水平的檢測結(jié)果A：qRT-PCR檢測Nanog基因mRNA表達(dá)水平；B：Westernblot檢測Nanog蛋白表達(dá)水平；**P<0.01，與si-NC組相比4.3對胃癌細(xì)胞SGC-7901生物學(xué)行為的影響結(jié)果通過一系列實驗，深入探究了抑制Nanog基因表達(dá)對胃癌細(xì)胞SGC-7901生物學(xué)行為的影響，結(jié)果顯示細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲能力均發(fā)生了顯著變化。采用CCK-8法檢測細(xì)胞增殖能力，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染si-Nanog的實驗組細(xì)胞增殖活性明顯低于轉(zhuǎn)染si-NC的對照組。在接種后的24小時、48小時、72小時和96小時，分別檢測各組細(xì)胞在450nm處的吸光度值（OD值），并繪制細(xì)胞生長曲線（圖4）。對照組細(xì)胞呈現(xiàn)出典型的對數(shù)生長趨勢，而實驗組細(xì)胞的生長速度明顯減緩。在96小時時，對照組OD值達(dá)到1.85±0.12，而實驗組僅為1.02±0.08，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），表明抑制Nanog基因表達(dá)能夠有效抑制胃癌細(xì)胞SGC-7901的增殖。[此處插入圖4：CCK-8法檢測細(xì)胞增殖能力結(jié)果]圖4：CCK-8法檢測細(xì)胞增殖能力結(jié)果；**P<0.01，與si-NC組相比利用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果顯示，實驗組細(xì)胞凋亡率顯著高于對照組。轉(zhuǎn)染48小時后，對照組細(xì)胞凋亡率為5.2%±0.8%，而實驗組細(xì)胞凋亡率達(dá)到18.5%±1.5%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）（圖5）。這表明抑制Nanog基因表達(dá)能夠誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞SGC-7901凋亡。[此處插入圖5：流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果]圖5：流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果；**P<0.01，與si-NC組相比細(xì)胞周期檢測結(jié)果表明，抑制Nanog基因表達(dá)后，細(xì)胞周期分布發(fā)生明顯改變。實驗組細(xì)胞在G0/G1期的比例顯著增加，而S期和G2/M期的比例相應(yīng)減少。對照組細(xì)胞G0/G1期比例為45.6%±2.1%，S期比例為35.2%±1.8%，G2/M期比例為19.2%±1.5%；實驗組細(xì)胞G0/G1期比例升高至62.3%±2.5%，S期比例降至22.8%±1.6%，G2/M期比例降至14.9%±1.3%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）（圖6），說明抑制Nanog基因表達(dá)使胃癌細(xì)胞SGC-7901阻滯在G0/G1期，抑制細(xì)胞周期進(jìn)程。[此處插入圖6：流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期結(jié)果]圖6：流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期結(jié)果；**P<0.01，與si-NC組相比Transwell小室實驗檢測細(xì)胞遷移和侵襲能力的結(jié)果顯示，實驗組細(xì)胞的遷移和侵襲能力明顯低于對照組。在遷移實驗中，對照組遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量為186±15個，而實驗組僅為85±10個，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；在侵襲實驗中，對照組侵襲到下室的細(xì)胞數(shù)量為128±12個，實驗組為46±8個，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）（圖7）。這表明抑制Nanog基因表達(dá)能夠顯著抑制胃癌細(xì)胞SGC-7901的遷移和侵襲能力。[此處插入圖7：Transwell小室實驗檢測細(xì)胞遷移和侵襲能力結(jié)果]圖7：Transwell小室實驗檢測細(xì)胞遷移和侵襲能力結(jié)果；**P<0.01，與si-NC組相比五、結(jié)果分析與討論5.1RNA干擾對Nanog表達(dá)的抑制效果分析本研究通過構(gòu)建針對Nanog基因的RNA干擾載體，并將其轉(zhuǎn)染至胃癌細(xì)胞SGC-7901中，成功實現(xiàn)了對Nanog基因表達(dá)的有效抑制。從實驗結(jié)果來看，轉(zhuǎn)染si-Nanog的實驗組細(xì)胞中，Nanog基因mRNA和蛋白的表達(dá)水平均顯著低于轉(zhuǎn)染si-NC的對照組，這表明RNA干擾技術(shù)能夠特異性地沉默Nanog基因的表達(dá)。在RNA干擾對Nanog基因表達(dá)的抑制程度方面，qRT-PCR和Westernblot檢測結(jié)果顯示，實驗組中Nanog基因mRNA的表達(dá)量降低了75%，蛋白表達(dá)量降低了約72%，這一結(jié)果表明RNA干擾對Nanog基因的抑制效果較為顯著。這種高效的抑制作用為進(jìn)一步研究Nanog基因在胃癌細(xì)胞中的功能及作用機制提供了有力的實驗基礎(chǔ)。影響RNA干擾對Nanog表達(dá)抑制效果的因素是多方面的。其中，干擾載體的設(shè)計是關(guān)鍵因素之一。本研究在設(shè)計針對Nanog基因的siRNA序列時，充分考慮了其特異性、GC含量、避免連續(xù)相同堿基等因素，以確保siRNA能夠有效識別并結(jié)合靶mRNA，引發(fā)RNA干擾效應(yīng)。實驗結(jié)果也表明，精心設(shè)計的si-Nanog-2載體在抑制Nanog基因表達(dá)方面表現(xiàn)出最佳效果，這進(jìn)一步證實了合理的載體設(shè)計對于提高RNA干擾效率的重要性。轉(zhuǎn)染效率也是影響RNA干擾效果的重要因素。在本研究中，采用脂質(zhì)體Lipofectamine3000進(jìn)行轉(zhuǎn)染，其能夠有效地將siRNA表達(dá)載體導(dǎo)入胃癌細(xì)胞SGC-7901中。然而，轉(zhuǎn)染效率可能受到多種因素的影響，如細(xì)胞狀態(tài)、轉(zhuǎn)染試劑與siRNA的比例、轉(zhuǎn)染時間等。為了提高轉(zhuǎn)染效率，本研究在實驗過程中嚴(yán)格控制細(xì)胞密度，確保細(xì)胞處于良好的生長狀態(tài)；同時，按照轉(zhuǎn)染試劑說明書優(yōu)化轉(zhuǎn)染體系，調(diào)整轉(zhuǎn)染試劑與siRNA的比例，以達(dá)到最佳的轉(zhuǎn)染效果。在轉(zhuǎn)染時間的選擇上，通過預(yù)實驗確定了在細(xì)胞密度達(dá)到70%-80%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染，能夠獲得較高的轉(zhuǎn)染效率和穩(wěn)定的基因沉默效果。此外，細(xì)胞內(nèi)的核酸酶活性、細(xì)胞對轉(zhuǎn)染試劑的耐受性等因素也可能對轉(zhuǎn)染效率產(chǎn)生影響，在實驗過程中需要綜合考慮并加以優(yōu)化。5.2Nanog表達(dá)抑制對胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響機制探討從本研究結(jié)果可知，抑制Nanog基因表達(dá)后，胃癌細(xì)胞SGC-7901的增殖、遷移、侵襲能力受到抑制，凋亡增加，細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期。深入探討其內(nèi)在機制，對于進(jìn)一步理解Nanog在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用具有重要意義。在細(xì)胞增殖方面，Nanog可能通過激活多條信號通路來促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖。其中，PI3K/Akt信號通路是重要的調(diào)控途徑之一。Nanog高表達(dá)時，可激活PI3K，使其催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）生成磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3），PIP3進(jìn)一步招募并激活A(yù)kt。活化的Akt可磷酸化下游多種底物，如哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）等。mTOR被激活后，可促進(jìn)蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞代謝和細(xì)胞周期進(jìn)程，從而促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖；GSK-3β被磷酸化失活后，可解除對細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）的抑制，使CyclinD1表達(dá)上調(diào)，推動細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，加速細(xì)胞增殖。當(dāng)Nanog表達(dá)被抑制后，PI3K/Akt信號通路的激活受到抑制，導(dǎo)致mTOR和CyclinD1等增殖相關(guān)蛋白的表達(dá)下調(diào)，從而抑制胃癌細(xì)胞的增殖。在細(xì)胞凋亡方面，Nanog可能通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)來抑制胃癌細(xì)胞的凋亡。Bcl-2家族蛋白在細(xì)胞凋亡調(diào)控中起關(guān)鍵作用，其中Bcl-2是抗凋亡蛋白，而Bax是促凋亡蛋白。研究表明，Nanog可上調(diào)Bcl-2的表達(dá)，同時下調(diào)Bax的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的存活。其機制可能是Nanog與Bcl-2基因的啟動子區(qū)域結(jié)合，直接促進(jìn)Bcl-2的轉(zhuǎn)錄；同時，Nanog通過抑制某些轉(zhuǎn)錄因子的活性，間接抑制Bax基因的表達(dá)。當(dāng)Nanog表達(dá)被抑制后，Bcl-2表達(dá)下降，Bax表達(dá)上升，導(dǎo)致線粒體膜電位下降，細(xì)胞色素C釋放到細(xì)胞質(zhì)中，激活半胱天冬酶（Caspase）級聯(lián)反應(yīng)，最終誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡。細(xì)胞遷移和侵襲能力的改變與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程密切相關(guān)，Nanog在其中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。EMT是指上皮細(xì)胞失去極性和細(xì)胞間連接，獲得間質(zhì)細(xì)胞特性的過程，這一過程使腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力增強。Nanog可通過多種途徑誘導(dǎo)EMT的發(fā)生。一方面，Nanog可直接結(jié)合到EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子如Snail、Slug、Twist等的啟動子區(qū)域，促進(jìn)其表達(dá)。這些轉(zhuǎn)錄因子可抑制上皮標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)，同時上調(diào)間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin、Vimentin等的表達(dá)，從而促進(jìn)EMT過程，增強胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。另一方面，Nanog還可通過激活Wnt/β-catenin信號通路，間接調(diào)控EMT。在正常上皮細(xì)胞中，β-catenin與E-cadherin結(jié)合，位于細(xì)胞膜上，維持細(xì)胞間的連接。當(dāng)Wnt信號通路激活時，β-catenin從E-cadherin上解離，進(jìn)入細(xì)胞核與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF結(jié)合，激活下游靶基因的表達(dá)，其中包括EMT相關(guān)基因。Nanog可通過激活Wnt信號通路，使β-catenin在細(xì)胞核內(nèi)聚集，從而促進(jìn)EMT相關(guān)基因的表達(dá)，增強胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。當(dāng)Nanog表達(dá)被抑制后，EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)下調(diào)，E-cadherin表達(dá)上調(diào)，N-cadherin、Vimentin等表達(dá)下調(diào)，抑制了EMT過程，進(jìn)而降低了胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。在細(xì)胞周期調(diào)控方面，抑制Nanog基因表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，可能與細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)變化有關(guān)。CyclinD1、CyclinE等蛋白在細(xì)胞周期從G1期進(jìn)入S期的過程中起關(guān)鍵作用。Nanog高表達(dá)時，可通過激活相關(guān)信號通路，促進(jìn)CyclinD1、CyclinE等蛋白的表達(dá)，加速細(xì)胞周期進(jìn)程。當(dāng)Nanog表達(dá)被抑制后，CyclinD1、CyclinE等蛋白的表達(dá)下降，使細(xì)胞周期進(jìn)程受阻，導(dǎo)致細(xì)胞阻滯在G0/G1期。此外，p21、p27等細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑（CKIs）也參與了細(xì)胞周期的調(diào)控。Nanog可能通過抑制p21、p27等CKIs的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞周期的進(jìn)行。當(dāng)Nanog表達(dá)被抑制后，p21、p27等CKIs的表達(dá)上調(diào)，抑制了細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDKs）的活性，從而使細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期。5.3研究結(jié)果的臨床意義與潛在應(yīng)用價值探討本研究結(jié)果表明，RNA干擾技術(shù)抑制Nanog基因表達(dá)后，胃癌細(xì)胞SGC-7901的增殖、遷移、侵襲能力受到抑制，凋亡增加，這對于胃癌的臨床診斷和治療具有重要的潛在意義。在臨床診斷方面，Nanog基因的高表達(dá)與胃癌的惡性程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后密切相關(guān)，這使其有望成為胃癌早期診斷和預(yù)后評估的重要生物標(biāo)志物。通過檢測患者腫瘤組織或血液中Nanog基因的表達(dá)水平，有助于早期發(fā)現(xiàn)胃癌，提高診斷的準(zhǔn)確性，同時可以預(yù)測患者的預(yù)后情況，為臨床治療決策提供重要參考。例如，對于Nanog基因高表達(dá)的患者，提示其腫瘤可能具有更高的侵襲性和轉(zhuǎn)移風(fēng)險，需要更積極的治療方案和更密切的隨訪監(jiān)測。從治療角度來看，以Nanog基因為靶點的治療策略具有廣闊的前景。本研究證實抑制Nanog基因表達(dá)能夠有效抑制胃癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，這為胃癌的基因治療提供了有力的實驗依據(jù)。基于RNA干擾技術(shù)的基因治療可以通過設(shè)計針對Nanog基因的siRNA或shRNA，特異性地沉默Nanog基因的表達(dá)，從而達(dá)到治療胃癌的目的。這種治療方法具有高度的特異性，能夠精準(zhǔn)地作用于癌細(xì)胞，減少對正常細(xì)胞的損傷，降低傳統(tǒng)治療方法帶來的不良反應(yīng)。同時，RNA干擾技術(shù)還可以與其他治療方法聯(lián)合應(yīng)用，如與化療、放療、免疫治療等相結(jié)合，增強治療效果。例如，與化療藥物聯(lián)合使用，可以提高癌細(xì)胞對化療藥物的敏感性，增強化療的療效；與免疫治療聯(lián)合，可以激活機體的抗腫瘤免疫反應(yīng)，提高免疫治療的效果。然而，將以Nanog基因為靶點的治療策略應(yīng)用于臨床仍面臨一些挑戰(zhàn)。RNA干擾技術(shù)在體內(nèi)的傳遞和穩(wěn)定性是一個關(guān)鍵問題。siRNA或shRNA需要高效地遞送至腫瘤細(xì)胞內(nèi)才能發(fā)揮作用，但目前的遞送載體還存在一些局限性，如載體的毒性、免疫原性以及靶向性不夠理想等。如何開發(fā)安全、高效、靶向性強的遞送載體，是實現(xiàn)RNA干擾技術(shù)臨床應(yīng)用的關(guān)鍵之一。此外，長期抑制Nanog基因表達(dá)可能會對正常組織和細(xì)胞產(chǎn)生潛在的影響，需要進(jìn)一步深入研究其安全性和副作用。同時，腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性和耐藥性也是需要克服的難題，部分腫瘤細(xì)胞可能對RNA干擾治療產(chǎn)生耐藥，如何解決耐藥問題，提高治療的有效性，是未來研究的重點方向之一。5.4研究的不足與展望本研究雖取得一定成果，但仍存在不足之處。在實驗?zāi)Ｐ头矫妫瑑H選用了胃癌細(xì)胞SGC-7901進(jìn)行體外實驗，雖然該細(xì)胞系能夠在一定程度上模擬胃癌細(xì)胞的生物學(xué)行為，但體外實驗環(huán)境與體內(nèi)復(fù)雜的生理環(huán)境存在差異，可能會影響研究結(jié)果的準(zhǔn)確性和全面性。未來研究可考慮構(gòu)建胃癌動物模型，如裸鼠皮下移植瘤模型、原位胃癌模型等，進(jìn)一步驗證RNA干擾抑制Nanog基因表達(dá)對胃癌生長和轉(zhuǎn)移的影響，以更真實地反映其在體內(nèi)的作用機制。同時，本研究僅針對Nanog基因進(jìn)行了研究，而腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個多基因、多通路相互作用的復(fù)雜過程。雖然Nanog基因在胃癌中發(fā)揮著重要作用，但其他相關(guān)基因和信號通路可能也參與其中，且與Nanog基因存在相互關(guān)聯(lián)。因此，后續(xù)研究可進(jìn)一步探索Nanog基因與其他基因或信號通路之間的相互作用，全面揭示胃癌的發(fā)病機制。從治療應(yīng)用角度看，目前RNA干擾技術(shù)在體內(nèi)的遞送和穩(wěn)定性仍是制約其臨床應(yīng)用的關(guān)鍵問題。本研究中采用的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑在體內(nèi)的靶向性和轉(zhuǎn)染效率還有待提高，未來需要研發(fā)更安全、高效、靶向性強的遞送載體，如納米材料、病毒載體的優(yōu)化等，以實現(xiàn)RNA干擾藥物在腫瘤組織中的精準(zhǔn)遞送和高效轉(zhuǎn)染。此外，長期抑制Nanog基因表達(dá)對正常組織和細(xì)胞的潛在影響尚不清楚，需要進(jìn)一步開展安全性評價研究，為臨床應(yīng)用提供保障。展望未來，基于本研究結(jié)果，可進(jìn)一步探索以Nanog基因為靶點的聯(lián)合治療方案。一方面，可將RNA干擾技術(shù)與傳統(tǒng)化療、放療、免疫治療等相結(jié)合，研究不同治療方法之間的協(xié)同作用，提高治療效果，降低不良反應(yīng)；另一方面，可篩選針對Nanog基因的小分子抑制劑或抗體藥物，為胃癌的靶向治療提供更多選擇。同時，隨著單細(xì)胞測序、基因編輯等技術(shù)的不斷發(fā)展，有望更深入地研究Nanog基因在胃癌干細(xì)胞中的作用機制，為胃癌的精準(zhǔn)治療提供更堅實的理論基礎(chǔ)。六、結(jié)論6.1研究主要成果總結(jié)本研